이 프로토콜은 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 사용하여 수천 개의 게놈을 신속하게 스크리닝하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 접근성이 유리합니다. 비용이 많이 드는 특수 시퀀싱 기반 접근 방식 대신 당사의 방법은 PCR 제한 효소와 겔 전기영동을 사용하여 인델 또는 특정 게놈 편집을 위해 F0 수컷 운반체를 스크리닝합니다.
이 절차에서 가장 어려운 부분은 정자를 빨리 얻는 것이지만, 이형 물고기를 많이 다루면 체외 수정에 좋은 기술이 되기 때문에 문제를 일으키는 물고기를 쉽게 교배할 수 있는 방법입니다. 야생형과 F0 물고기 모두를 위한 번식 탱크를 설치하고 밤새 탱크를 부화시키는 것으로 시작하십시오. 다음날 수컷 물고기를 마취 한 후 슬롯 형 스푼을 사용하여 깨끗한 종이 타월 더미에 옮깁니다.
생선을 부드럽게 굴려 과도한 물을 제거하십시오. 깨끗하고 접힌 티슈로 물기를 닦아서 물기를 제거합니다. 슬롯 형 스푼을 사용하여 준비된 스폰지에 생선을 옮깁니다.
물고기를 복부 쪽이 위로 향하게 놓고 깨끗하게 접힌 티슈 페이퍼로 항문 지느러미 주변을 부드럽게 닦아냅니다. 정자를 수집하려면 모세관을 사용하여 골반 지느러미를 정중선에서 부드럽게 움직여 배설물을 노출시킵니다. 모세관을 배설물 근처에 놓습니다.
손가락이나 필터 집게로 아가미에서 물고기의 측면을 부드럽게 짜냅니다. 모세관 작용을 사용하여 튜브에 정자를 수집하고 40 마이크로 리터의 50 밀리몰 수산화 나트륨 용액이 들어있는 PCR 튜브에 넣은 다음 샘플을 튜브로 배출합니다. 미니 원심분리기에서 정자 샘플을 회전시킨 후 PCR 튜브를 열 순환기에 넣습니다.
샘플을 섭씨 95도에서 40분 동안 가열한 다음 섭씨 25도에서 냉각하여 사이클러를 실행합니다. 사이클러로부터 샘플을 제거한 후, pH 8의 1몰 트리스 히드로클로라이드 10 마이크로리터를 첨가하여 pH를 중화시킨다. 현탁액을 흡인하여 혼합한 다음 샘플을 원심분리합니다.
예열을 위해 열 순환기를 섭씨 95도로 설정하십시오. 그 동안 각 정자 샘플에 대해 25 마이크로 리터의 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞은 다음 샘플을 회전시킵니다.
예열된 열 순환기에 샘플을 넣고 사이클을 설정합니다. 겔 용액을 얻기 위해, 아가로스 분말, 겔 염색 및 TBE 완충액을 혼합하여 제조된 4%아가로스 겔 용액을 마이크로파로 돌린다. 젤 용액을 젤 캐스팅 프레임에 붓고 한쪽에 빗을 삽입합니다.
겔 응고 후 빗을 조심스럽게 제거하십시오. 웰이 음극에 가장 가깝도록 전기 영동 장비에 젤을 놓습니다. 우물이 완전히 잠길 때까지 TBE 실행 버퍼를 장비에 붓습니다.
5마이크로리터의 DNA 사다리를 첫 번째 웰에 피펫팅하여 젤을 로드하기 시작합니다. 나머지 웰에 5 내지 10 마이크로리터의 PCR 산물을 로딩한다. 앰플리콘이 적절하게 분리되도록 1볼트에서 150시간 동안 젤을 실행합니다.
젤 이미저를 사용하여 view DNA 밴드. p2ry12 유전자좌 분석은 야생형 앰플리콘이 250 염기쌍 길이의 단일 밴드를 나타내는 반면, 인델을 포함하는 F0 주입된 수컷 앰플리콘은 다중 밴드로 실행되는 것으로 나타났습니다. DNAh10 유전자좌 분석은 야생형 앰플리콘이 단일 400 염기쌍 긴 밴드로 실행되는 것으로 나타났습니다.
인델을 포함하는 F0 주입된 수컷 앰플리콘은 다중 밴드 또는 겔 이동성이 감소된 단일 밴드로 실행되었습니다. F0 주사된 수컷 1번은 소화된 산물에 추가 밴드가 있었는데, 이는 PCR 산물에는 없었기 때문에 돌연변이 녹인 라인 확립을 위한 최고의 창시자 후보가 되었습니다. 수컷 물고기가 짜낼 때 정자가 나오지 않으면 물고기를 너무 세게 짜서 다칠 위험이 있는 대신 일주일 동안 쉬고 다시 시도하는 것이 가장 좋습니다.
FC 또는 남성 창시자가 교배되면 F1 자손에서 대립 유전자의 서열을 확인해야 합니다. F1 앰플리콘을 직접 시퀀싱하고 이형접합 대립유전자 분석을 수행하는 것은 이를 수행하는 쉬운 방법입니다.
