저자는 유방암 연구 재단 및 고급 의료 연구 재단의 지원을 인정 하는 기꺼이.

여기 설명 하는 모든 방법은 보스턴 어린이 병원 기관 Biosafety 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 세포 준비
<ol><li>
녹고 KHOS-A 및-N 셀
	<ol>
<li>따뜻한 문화 매체, 즉, 최대 Dulbecco의 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FBS)와 1% (vol/vol) 페니실린/스 보충이 글 중간 수정.</li>
		<li>액체 질소 탱크에서 세포의 극저온 튜브를가지고, 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 물에 튜브의 하단을 담가 그리고 부드럽게 녹고 프로세스를 가속 화 하기 위해 극저온 병을 흔들어. 오염을 방지 하기 위하여 물 접촉에서 극저온 튜브의 뚜껑을 유지. 최대한 빨리 셀은 해 동, 70% 에탄올 솔루션을 분사 하 고 유리병을 닦는 여 극저온 유리병을 소독.</li>
		<li>층 류 두건에서 즉시 극저온 유리병에서 세포 현 탁 액을 발음 하 고 부드럽게 따뜻하게 10 mL의 배양 (1.1.1에서 설명)에 일시 중단 합니다. 5-7 분 약 200 x g에서 셀 정지 원심</li>
		<li>예 열 10 mL 문화 매체와 셀 펠 릿 resuspend 그리고 T75 플라스 크로 전송. 부드럽게 균등 하 게 10 mL를 피펫으로 사용 하 여 셀 중단 여러 번 플라스틱.</li>
		<li>5% (vol/vol) CO2 와 습도 분위기 37 ° C 배양 기에 플라스 크를 놓습니다. 셀 12 h 이상에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
		<li>80-100% 합칠 때까지 약 3-7 일에 대 한 셀을 품 어. 2-3 일 마다 문화 매체를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분할 KHOS-A 및-N 셀
	<ol>
<li>플라스 크에서 문화 미디어를 제거 합니다.</li>
		<li>5 mL 살 균 PBS로 세포 세척 (1x) 칼슘과 마그네슘, 비 부착 셀 또는 제거 없이.</li>
		<li>플라스 크에 1 mL 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션을 추가 하 고 간단히 트립 신-EDTA 균등 하 게 분산 되도록 플라스 크를 소용돌이.</li>
		<li>37 ° C 배양 기에서 2-3 분 또는 실 온에서 3-5 분에 대 한 플라스 크를 품 어. 에 셀은 반올림 하 고 분리 되도록 약 400 배 확대 현미경으로 세포를 확인 합니다.</li>
		<li>세포 분리는 일단 10 mL 문화 매체를 추가 하 고 부드럽게 헤어 10ml 피펫으로 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀 집계 여러 번 왔다 갔다 매체 플라스틱.</li>
		<li>셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 2 × 106 세포의 밀도 또는 1: 4의 비율에서 새로운 T75 플라스 크에 세포 현 탁 액을 시드하십시오.</li>
		<li>QPI 실험에 뿌리기 전에 80-100% 합류에 성장 하는 셀 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시드 KHOS-A 및-N QPI 셀
	<ol>
<li>씨 KHOS-A 및-N 셀의 50000-300000 셀/셀 카운터로 계산 후 5 mL 문화 매체와 밀도에서 6 잘 플레이트에 참고: 시드 밀도에 따라 달라 집니다 셀 확산 속도 이미징 기간 하려면 < 이미징 수집 하는 동안 100% 합류.</li>
		<li>첨부 파일을 허용 하도록 적어도 12 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>QPI를 수행 하기 전에 신선한 미디어와 매체를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. QPI 수집
<ol><li>
커버 슬립 설정
	<ol>
<li>커버 슬립 이온 물로 여러 번 헹 궈 서 깨끗 하 고 건조 살 균 층 류 두건으로 커버 슬립을 넣어 15 분에 대 한 침수에 의해 75% 에탄올 용액으로 소독.</li>
		<li>신중 하 게 커버 슬립을 분명 거품을 피하기 위해 6-잘 접시에 놓습니다. 커버 슬립의 하단 문화 미디어 (최소 5 mL/음)에 몰입 됩니다 확인 하십시오.</li>
		<li>(37 ° C, 5% CO2, 그리고 습도 분위기) 적어도 15 분 동안 equilibrate 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 커버 슬립에 안개 형성 하는 경우에 멸 균 면봉을 사용 하 여 그것을 깨끗 하 게 닦아.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경으로 세포 이미징
	<ol>
<li>노출 시간, 패턴 대비 및 홀로그램 잡음의 자기 보정을 포함 하 여 시스템을 초기화 하기 위해 소프트웨어를 엽니다. 값은 허용 (녹색 또는 노란색 범위에 표시 된) 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>6 잘 플레이트 QPI 현미경의 스테이지에 배치 합니다.</li>
		<li>"라이브 캡처," 클릭 하 고 "소프트웨어 초점."에서 "수동"을 선택 개의 "현미경 설정"에서 작업 거리를 조정 하 여 셀의 위상 이미지를 초점 셀 단계 이미지에 대 한 개요를 얻을. "소프트웨어 초점."에서 "자동"으로 변경</li>
		<li>"새로운 실험"를 클릭 하 여 새 실험 만들기를. 숫자 패드에 마우스 또는 화살표 키를 사용 하 여 이미지 수집 위치의 선택으로 시작 합니다. 각 선택 후 "저장"을 클릭 합니다. 일반적으로 3-5 위치 각 샘플에 대 한 선택 됩니다.</li>
		<li>"Timelapse" 섹션에서 이미징 간격 및 기간을 설정 합니다. 참고: 명확 하 게 암 세포를 추적, 간격 이어야 한다 짧은 보다 5 분 48 시간 조합 QPI 분석 기간으로 설정 됩니다.</li>
		<li>자동으로 집중 하 고 설정 시간 지점에서 이미지를 "캡처"를 클릭 하 여 실험을 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>
셀 형태 분석
	<ol>
<li>"셀을 식별 합니다." 클릭 셀 영역 배경 잡음 으로부터 잘 구분 되는 "배경 임계값"에 대 한 숫자 설정을 조정 합니다. "개체 크기"에 대 한 설정을 조정할 각 셀 한 핵에 있는지 확인 합니다. 이 마지막 지역 및 볼륨 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 비교 될 필요가 있는 샘플에 대 한 일치 매개 변수를 유지 합니다. 필요한 경우 수동으로 "수동 변경,"를 사용 하 여 셀 세그먼트 수정 합니다.</li>
		<li>셀을 분석 하는 소프트웨어에서 "데이터 분석" 함수를 사용 합니다. "새로운 분석."를 클릭 하 여 새로운 데이터 분석 시작 선택 된 이미지는 "소스 프레임" 탭 및 세포 형태학 매개 변수 셀 영역 (µ m2), 광학 두께 (µ m), 및 모든 개별 셀에 대 한 볼륨 (µ m3)을 포함 하 여 끕니다. 분산형 플롯 또는 히스토그램 모드 및 내보내기 데이터를 테이블 또는 그림을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 확산 분석
	<ol>
<li>다른 시간 포인트 (예, 초기, 12 h, 24 h, 36 h 및 48 h) 적어도 5 이미지를 선택 합니다. 소프트웨어에 의해 제공 되는 레코드 셀 번호.</li>
		<li>배로 시간을 추정, 초기 숫자 정상화 후 핸드폰 번호를 플롯 하 고 지 수 성장 곡선에 맞게.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 모션 분석
	<ol>
<li>소프트웨어에 "셀 추적" 기능을 사용 합니다. "새로운 분석"을 클릭 하 여 새로운 데이터 분석을 시작 하. 선택한 기간 동안 (예를 들어, 24 h 부 화 후 4 h) "소스 프레임" 탭에는 이미지의 드래그 시리즈는 임의로 "셀 추가" 선택 모드에서 셀을 클릭 하 여 10-30 셀을 선택 합니다. 가장자리와 보기의 필드 밖으로 이동에 셀을 제외 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 이미지의 시리즈에서 추적을 확인 하십시오. 시스템 셀의 트랙을 잃거나 잘못 된 셀을 추적는 수동으로 조정 추적 셀 셀을 식별 하기 위해 "확인"을 클릭 하거나 "위치 수정"을 클릭 하 여 셀 위치를 수정 하려면 "선택" 모드.</li>
		<li>"플롯 운동" 셀 궤적의 장미 줄거리 또는 줄거리는 다른 모션 관련 매개 변수에 대 한 운동 속도 (µ m/h), 운동 (µ m), 마이그레이션 (µ m), 및 마이그레이션 똑 바 름 같은 "플롯 기능"에서 선택 하십시오. 테이블 또는 수치 데이터를 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Harper, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+tumor+angiogenesis:+mechanisms+and+therapeutic+implications.">Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications.</a> EXS. (96), 223-268 (2006).</li><li>Naumov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).</li><li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-2+is+required+for+the+switch+to+the+angiogenic+phenotype+in+a+tumor+model.">Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+switch+of+dormant+tumors+to+fast-growing+angiogenic+phenotype.">Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype.</a> Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signature+for+angiogenic+and+nonangiogenic+non-small-cell+lung+cancer.">Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).</li><li>Harper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+the+zinc+finger+transcription+factor+ZNF24.">Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24.</a> Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).</li><li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+repression+of+VEGF+by+ZNF24:+mechanistic+studies+and+vascular+consequences+in+vivo.">Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo.</a> Blood. 121 (4), 707-715 (2013).</li><li>Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+zinc+finger+transcription+factor,+ZNF24,+modulates+the+angiogenic+potential+of+human+microvascular+endothelial+cells.">The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+dormancy+of+human+liposarcoma+is+associated+with+impaired+tumor+angiogenesis.">Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+micro+RNAs+governing+the+switch+of+dormant+tumors+to+the+fast-growing+angiogenic+phenotype.">Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype.</a> PloS One. 7 (8), e44001 (2012).</li><li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors.">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PloS One. 7 (9), e44395 (2012).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+induced+by+the+tumor+dormancy-associated+microRNA-190.">Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190.</a> Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).</li><li>Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+control+the+angiogenic+switch+in+mouse+lung+metastasis.">Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis.</a> Science. 319 (5860), 195-198 (2008).</li><li>Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+angiogenesis+during+the+transition+from+hyperplasia+to+neoplasia.">Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.</a> Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).</li><li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Phase+Imaging+Techniques+for+the+Study+of+Cell+Pathophysiology:+From+Principles+to+Applications.">Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications.</a> Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).</li><li>Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Phase+Imaging.">Quantitative Phase Imaging.</a> Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).</li><li>Marrison, J., R&#228;ty, L., Marriott, P., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptychography--a+label+free,+high-contrast+imaging+technique+for+live+cells+using+quantitative+phase+information.">Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information.</a> Scientific Reports. 3, 2369 (2013).</li><li>Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gj&#246;rloff Wingren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+for+non-invasive+monitoring+of+cell+cycle+arrest+in+L929+cells.">Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells.</a> PloS One. 9 (9), e106546 (2014).</li><li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).</li><li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dormant+and+active+human+cancer+cells+by+quantitative+phase+imaging.">Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).</li><li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response.">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PloS One. 9 (2), e89000 (2014).</li><li>Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+testing+at+the+single+cell+level+using+quantitative+phase+and+amplitude+microscopy.">Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+red+blood+cell+mechanics+during+morphological+changes.">Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).</li><li>Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+blood+testing+using+quantitative+phase+imaging.">Real time blood testing using quantitative phase imaging.</a> PloS One. 8 (2), e55676 (2013).</li><li>Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+prostate+cancer+recurrence+using+quantitative+phase+imaging.">Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9976 (2015).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+surface+area+and+deformability+of+individual+human+red+blood+cells+over+blood+storage+using+quantitative+phase+imaging.">Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 6, 34257 (2016).</li><li>Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-mechanical+signatures+of+cancer+cells+based+on+fluctuation+profiles+measured+by+interferometry.">Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry.</a> Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

이 연구에서 우리는 생체 외에서비-침략 적, 레이블 없는 방법과 양적 특성 인간 다리 세포의 신생 및 비 신생 고기 QPI를 사용 하 여 설명 합니다. 여러 세포 매개 변수는이 메서드에서 통합, 높은 처리량, 확산 속도, 시간, 마이그레이션 똑 바 름, 운동 속도, 마이그레이션, 및 운동 성을 두 배로, 셀 볼륨, 셀 간격, 셀 영역을 포함 하 여 동시에 분석 되었습니다 했습니다.
...

개발 및 단단한 종양의 진행 초기 검사점 중 신생 표현 형, 암 홀 마크의 인수입니다. 이 진행 포함 다양 한 생 화 학적 및 분자 프로세스1,2,3. 종양 진행이 키 단계 연구에서 기술 도전 도구를 지속적으로 하 고 양적 특성화 고 편견으로 라이브 암 세포의 신생 및 비 신생 고기 구별의 부족 이다. 보통 신생 및 비 신생 세포의 세포질 행동을 조사 하는 데 사용 되는 전통적인 분석 필요 비싼 시 약 및 기기, 예를 들어 셀 확산/마이그레이션 분석4,5, 실험 6,7,,89,10,11,12,13,14 또는 상당한 전문성과 집중을 요구 뿐만 아니라 보완 vivo에서 평가4,5,6,8,,1516, 시간과 노동 소비입니다.
최근, 양적 위상 이미징 (QPI) 다양 한 세포 형태 및 동작 매개 변수17,18,19, 의 시간 경과 및 라벨 무료 평가 가능 하 게 소설 기법으로 떠오르고 있다 20 , 21 , 22. 기존의 광학 현미경과 달리 QPI 단정 위상 변화에 의해 픽셀의 빛 광 개체를 통해 전달 되 고 변환 된 광학 두께와 볼륨, 자필을 재구성 한 후 직접 활성화 라이브 셀 및 다음 기능 분석: (1) 양적 이미징, (2) 비-침략 적 및 시간 경과 영상, (3) 라벨 무료 이미징, 및 (4) 동시 다중 매개 변수 영상. 이러한 기능을 평가 하 고 세포 수준에서 병 적인 프로세스를 이해 하는 강력한 도구 QPI를 확인 합니다.
최근 연구에서 활용 하는 양적 특성 및 신생 구별 QPI KHOS A 및 세포 형태학의 분석을 결합 하 여 체계적이 고 정량적으로 인간의 다리 셀의 비 신생 KHOS N 고기 확산, 그리고 운동 성23. 이미지 분석 소프트웨어, 패널을 사용 하 여 셀 형태학과 행동의 매개 변수가 양적 신생 및 비 신생 인간 다리 셀 사이의 비교 했다 그리고 5 특성 차이이 두 사이 발견 했다 고기입니다. 이 새로운 접근 방식을 다양 한 세포 생물학 관련 특성을 평가 하기 위한 통합 및 양적 플랫폼을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>T75 flask</td><td>Corning, NY, USA</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning, NY, USA</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals, GA, USA</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Z1 Coulter counter</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>Z1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HoloMonitor M4</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td><td>M4</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Hololid</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td><td>PHI 8020</td><td></td></tr><tr><td>HStudioM4</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td><td>HStudioM4</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

a time-lapse, label-free, quantitative phase imaging study of dormant and active human cancer cells

신생 표현 형의 인수 종양 휴면에서 탈출의 필수적인 구성 요소입니다. 여러 클래식 체 외에서 분석 실험 (예를들면, 확산, 마이그레이션, 등)와 모델 vivo에서 조사 하 고 신생 및 비 신생 셀 고기 특성화 개발 되었습니다 있지만이 메서드는 시간 노동 집약적인, 그리고 종종 필요한 상당한 전문 지식 뿐만 아니라 비싼 시 약 및 악기. 최근 연구에서 우리 신생 및 비 신생 인간 다리 KHOS 셀의 시간 경과 및 라벨 무료 characterizations을 소설 양적 위상 이미징 (QPI) 기법을 사용. 셀 형태, 운동 성, 확산, 등 세포 매개 변수 패널 양적 측정 되었다 고 QPI를 사용 하 여 분석. 이 소설과 양적 접근 지속적으로 및 비 접촉 관련 세포 프로세스, 행동, 그리고 암 세포의 특성 및 다른 세포 유형 간단 하 고 통합 된 방식으로 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 보고서에서는 셀 준비, QPI 수집 및 데이터 분석을 포함 하 여 우리의 실험 프로토콜을 설명 합니다.

그림 1 전형적인 세포 형태학 특성 묘사. 이미지는 holographs (그림 1A-B)와 2D 이미지 (그림 1C-D)로 표시 됩니다. 광 셀 두께 (계산 고 굴절률 광학 경로 길이에서) 라인 프로 파일 또는 전체 셀 측정을 통해 정량은. KHOS-A의 두께 면적의 점도 그림 1E-G,?...

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A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.4K 조회수.  Boston Children's Hospital. 휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

연구

의학

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

암 연구학

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

생물학

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing factor in the overall outcome. Immunoblotting, flow cytometry and fixed cell experiments are often used to study how cells respond to anti-cancer drugs. These methods are important, but they have several shortcomings. Variability in drug responses between cancer and normal cells, and between cells of different cancer origin, and transient and rare responses are difficult to understand using population averaging assays and without being able to directly track and analyze them longitudinally. The microscope is particularly well suited to image live cells. Advancements in technology enable us to routinely image cells at a resolution that enables not only cell tracking, but also the observation of a variety of cellular responses. We describe an approach in detail that allows for the continuous time-lapse imaging of cells during the drug response for essentially as long as desired, typically up to 96 hr. Using variations of the approach, cells can be monitored for weeks. With the employment of genetically encoded fluorescent biosensors numerous processes, pathways and responses can be followed. We show examples that include tracking and quantification of cell growth and cell cycle progression, chromosome dynamics, DNA damage, and cell death. We also discuss variations of the technique and its flexibility, and highlight some common pitfalls.

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

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