이 작품 NIH 교부 금 P50HG004952와 모에 R01GM109099에 의해 지원 되었다

1. 캡처 Oligonucleotide 디자인
<ol><li>
대상 지역/s의 하이브리드 캡처 동안 사용할 oligonucleotides의 패널 디자인.
	<ol>
<li>4-8 oligonucleotides 대상 지역, 그러나 최소한 디자인, 하나 이상의 oligonucleotide 대상 영역의 각 끝을 대상으로 디자인을 목표로 합니다.</li>
		<li>대상 시퀀스는 긴 경우 (> 500의 기본적인 쌍), 전체 대상 지역 chromatin의 효과적인 농축을 최대한 밖으로 보기로 oligonucleotides 디자인. 참고: 우리는 4-8 oligonucleotides와 최적의 캡처 관찰. 이 프로세스는 더 많은 oligonucleotides 잘 사용할 수 있습니다, 하지만 너무 많은 oligonucleotides 사용 하는 경우 농축 수율의 감소를 관찰 하는 것은 드물지 않다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유사한 녹는 온도, oligonucleotides 디자인 하 고는 그들이 하지 강한 헤어핀을 형성 않으며 강한 상호 작용 (고려 내 42 ᵒC에서 실시 될 것입니다)를가지고 있는지 확인 하십시오. 참고: 발 차입 (4.12.3)을 선택 하는 경우는 추가적인 외부 8 기준 시퀀스는 oligonucleotide에 추가 되어야 합니다 그리고 필요 합니다 보완 '릴리스' oligonucleotides 차입17시. 선택 하 고 분석 하는 oligonucleotides 여러 상용 소프트웨어 도구를 사용할 수 있습니다. 25 메 좋은 결과 보이고 있다 그러나 게놈 크기 순서에 따라, 캡처 oligonucleotides 포함 될 수 있습니다 어딘가에 사이 20-80 기지. 일반적으로, 캡처 oligonucleotides 62 ᵒC, 가까운 녹는 온도 하지만 그는 그들의 길이 따라 변경할 수 있습니다. 일관 된 용융 온도 및/또는 캡처 믹스 전체 oligonucleotide 길이 농축에 원치 않는 편견을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>캡처 oligonucleotides는 biotin moiety (선호 캡처 시퀀스에서 공백 구분 함) 3' 끝에와 함께 디자인.</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>
37 ᵒC와 5% CO2에 인간 lymphoblastoid 셀 (예: GM12878 여기에 표시) 또는 다른 셀 라인 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스, 2 mM L-글루타민 보충 RPMI 1640 미디어에서를 성장 한다.
	<ol>
<li>시드 초기 RPMI 1640 미디어 2.1에서 준비의 6 mL와 T-25 플라스 크에서 aliquots (2-5 105 셀 x) 냉동입니다.</li>
		<li>셀 밀도 생존을 모니터링 합니다.<ol>
<li>대표 셀의 aliquot 고 블루 trypan 같은 적절 한 염료와 얼룩.</li>
			<li>hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>셀에 1 x 106 셀/mL의 조밀도 도달 하면, 전에 5 분 x 100g에 셀 아래로 회전 하 고 2.1에서 준비 RPMI 1640 미디어의 25 mL와 T-75 플라스 크에 세포를 전송. 셀 밀도 접근 1 x 106 셀/mL까지 세포 성장.</li>
		<li>RPMI 1640 미디어 (2.1)의 38 ml T-150 플라스 크에 세포를 전송 추가 2 일에 대 한 셀을 성장 하 고. 참고: Lymphoblastoid 세포 현 탁 액에서 성장. 성장 하는 lymphoblastoid 세포에 대 한 일반 지침 셀 밀도를 0.2-1 x 106 셀/mL 사이 보관 될 것이 좋습니다. 이 기술에 필요한 자료의 큰 양 때문에 현재 프로토콜 고의로 넘어 무엇 일반적으로 사용 되는 셀 밀도 세포 성장에 기록 됩니다. 세포 성장 프로토콜 개정 하 고 적응 사용할 수 세포 유형에 따라 독자 수 있습니다.</li>
		<li>5 분 x 100g에 셀 아래로 회전 RPMI 1640 미디어 (2.1) 10 mL에 셀 resuspend 하 고, 미디어의 500 mL를 포함 하는 850 cm2 롤러 병에 현 탁 액을 부 어. 앞으로 동일한 조건 하에서 세포를 품 어 하지만 시점에서 지속적인 회전 (~0.5 rpm)를 사용 하 여 시작 합니다.</li>
		<li>세포 성장 모니터링 하 고 미디어 (일반적으로 매 3-4 일) 필요할 때 변경. 2 x 106 셀/mL (총에서 1 x 109 셀)에 최대한 가까이 밀도 성장 세포를 하자.</li>
		<li>원하는 셀 수에 도달 하면 5 분 동안 100 x g에 아래로 셀을 회전 시켜 세포를 수확 하 고 RPMI 1640 미디어 (2.1)의 36 ml 셀 resuspend. 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 셀 계산 및 DNA 추출을 위한 작은 aliquots를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1%의 최종 농도 도달 Crosslink 37% 포름알데히드의 1 mL을 추가 하 여. 주의: 포름알데히드는 발암 물질 이며, 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.<ol>
<li>회전 셀을 품 어 (~ 30-60 rpm) 실 온 (RT)에서 10 분.</li>
		<li>125 mM의 최종 농도 대 한 2.5 M 글리신 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 crosslink 반응을 끄다.</li>
		<li>회전 셀을 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에서 5 분 5 분 동안 100 x g에서 centrifuging 여 셀을 펠 렛 및 얼음 감기 1 x PBS로 두 번 셀을 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>계속 해 서 다음 단계 또는 세포 세포의 용 해 버퍼 (5 mM Hepes, 85 m m KCl, 0.5 %Igepal, protease 억제제 (PI)) 5 mL에 펠 릿을 resuspend 스냅-동결 정지 액체 질소에 의해 드롭. -80 ᵒC에서 샘플을 저장 합니다. 참고: 준비 > 25 mL Igepal 및 PI 없이 세포 세포의 용 해 버퍼의 그 시 약 신선한 때 사용할 준비가 추가. Igepal 및 PI 추가 되었습니다 일단 세포 세포의 용 해 버퍼의 장기 저장을 하지 마십시오. 최대 3 개월까지 4 ᵒC에서 세포 세포의 용 해 버퍼를 저장 합니다. Igepal 비, 비 변성 시키기 세제입니다. NP-40 Igepal 안으로 잠재적으로 사용 될 수 있지만 우리가 그것을 사용 하지이 샘플은 결국 DNA 의무적인 단백질을 특성화 하는 질량 분석에 의해 분석 하면 NP-40은 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>3. 세포 및 전단
<ol><li>준비 > 핵 세포의 용 해 버퍼 (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, 1 %SDS, PI)의 15 mL. 참고: 추가 PI 사용 될 금액을 신선한. PI를 추가 핵 세포의 용 해 버퍼의 장기 저장을 하지 마십시오. 핵 세포의 용 해 버퍼 최대 1 개월 RT에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>세포 세포의 용 해 버퍼 (Igepal, PI 포함) 20 mL에 펠 릿을 resuspend. 잘 한 번 해 동 얼음에 녹여와 섞어 알 약에 하자. 샘플 얼음에 추가 10 분 동안 앉아 보자. 4 ᵒC 5 분 동안에 400 x g에서 셀 원심</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 PI와 핵 세포의 용 해 버퍼의 6 mL에 셀 resuspend (볼륨 증가 될 수 있다 경우에 세포는 현 탁 액을 형성 하지 않는다).</li>
	<li>
쥡니다 위한 준비, 분할 ~ 6-8에 균등 하 게 샘플 microfuge 관 (각 관에 대 한 1000 600 µ L).
	<ol>
<li>얼음 이나 차가운 랙에 샘플을 놓고는 sonicator는 microtip을 사용 하 여 샘플을 sonicate. 5 x 20 s 일정 한 필요, 적어도 40에 대 한 진정 서 스 펜 션 수 65% 진폭을 사용 하 여 펄스 사이 s. 참고: 볼륨이 증가 하는 경우 > 샘플, 세포를 냉각 하는 유리 당 10 mL 대신 사용할 수 있습니다. 점점 더 이상 파열을 해야 할 것 이다 다음. Sonicators는 크게 다릅니다. 조건은 독자에 의해 최적화 할 수 있습니다. 다른 쥡니다 대안 뿐만 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12000 x g 4 ᵒC에서 10 분 동안에 세포를 원심, 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 알 약을 삭제.</li>
	<li>Fluorometric 메서드를 사용 하 여 전체 복구를 예상 하고있다.</li>
	<li>계속 해 서 다음 단계 또는 스냅-동결-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.</li>
	<li>선택 사항: 0.3 M NaCl에 67 ᵒC에서 하룻밤 배양 하 여 aliquot, crosslinks을 가져가 라. DNA를 깨끗 하 고 조각 길이 결정 하는 Bioanalyzer에 그것을 실행. 파편의 대부분은 500 그리고 1000 bp 사이 이어야 한다. 참고: 그것은 시점에서 중지 하 고-80 ᵒC에서 샘플을 저장 하려면 확인입니다.</li>
</ol>4. 교 잡 캡처
<ol><li>교 잡 (Hyb) 버퍼 x 2의 500 mL를 준비 (200mm MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0.02% 트윈-20) 워시 버퍼 (200 m m NaCl, 0.2 %SDS, 50 mM Tris pH 8)의 500 ml. 저장 Hyb 및 워시 버퍼 4 ᵒC 및 실 온에서 각각 최대 3 개월까지 합니다. 교 잡 버퍼 x 1을 준비 하는 2 x Hyb 버퍼의 절반을 사용 합니다. 또한 최대 3 개월까지 4 ᵒC에 저장할. 참고: 교 잡 캡처의 전체 볼륨은 이전 단계에서 결과 샘플의 볼륨을 두 번 있을 것입니다 (지금까지 설명 된 대로 샘플 볼륨 약 6 mL 것과 따라서 총 교 잡 볼륨 12 mL 것).</li>
	<li>따로 설정 구슬 총 교 잡 캡처 볼륨 (이 경우 600 µ L)의 5%. 적절 하 고 적합 한 자석 구슬 다음 단계에 함께 작동 하도록 필요 합니다.</li>
	<li>워시 세 번 Hyb 버퍼 두 번 구슬 볼륨 (1200 µ L)를 사용 하 여 x 1와 구슬. 2x Hyb 버퍼의 1200 µ L에 구슬 resuspend. 해결 될 때까지 자석에 튜브를 배치 하 고 버퍼를 제거.</li>
	<li>1.5 mL 튜브 당 샘플의 700 µ L의 최대 microfuge 관 전 개간 반응을 수행 합니다. 충분 한 구슬 (5%)와 2 배 희석 (10 튜브 샘플의 600 µ L, 씻어 구슬 Hyb 버퍼, x 2에 resuspended의 120 µ L와 Hyb 버퍼 x 2의 480 µ L) x 1 Hyb 버퍼 Hyb 버퍼 추가 합니다. 최종 회전 이상 끝 31 ᵒC에서 10 분 동안 그들을 품 어 (~ 30-60 rpm).</li>
	<li>구슬 움직일 수는 새로운 관에 샘플을 전송 때까지 자석에 튜브를 놓습니다. 비즈를 삭제 합니다. 참고:이 시점에서 앞으로, 낮은 바인딩 튜브는 권장 됩니다.</li>
	<li>10 pmol / µ L의 작업 솔루션을 캡처 oligonucleotides resuspend 고 각 관에이 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 참고: 다른 지역, 서로 대 한 제어 역할을 할 수 있지만 진정한 부정적인 제어 역할을 발진의 시퀀스 캡처 oligonucleotide를 포함 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>마지막 회전에 엔드와 42 ᵒC에서 40 분 동안 튜브를 품 어 (~ 30-60 rpm).</li>
	<li>부 화, 동안 필요한 구슬 (0.3 µ L/캡처 oligonucleotide의 pmol) 제쳐 설정 합니다. 4.3, 단계에서 설명한 대로 구슬 세 번 씻어 하지만 Hyb 버퍼 x 1에 있는 셀을 resuspend.</li>
	<li>씻어 구슬 샘플을 추가 하 고 최종 회전 이상의 끝에서 RT 30 분 샘플을 품 어 (~ 30-60 rpm). 자석에 튜브를 놓고 일단 구슬이 움직일 수 있는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>
구슬 세척
	<ol>
<li>워시 버퍼의 1.2 mL을 추가 하 고 최종 회전 동안 끝 5 분에 대 한 샘플을 품 어 (~ 30-60 rpm) 자석 및 대기에 실시간 장소 튜브에서 솔루션까지 최소 몇 지웁니다. 버퍼를 제거 하 고이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>워시 버퍼의 1.2 mL을 추가 하 고 최종 회전 이상 끝 1 h 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에 튜브 자석에 놓고 솔루션 지웁니다 때까지 몇 분을 기다립니다. 버퍼를 제거 하 고 2 시간 30 분에 부 화 시간을 단축 하는이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>워시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 최종 회전 이상 끝 15 분 동안 품 어 (~ 30-60 rpm) 31 ᵒC에서. 자석에 튜브를 놓고 솔루션 클리어까지 몇 분 기다려야 합니다. 버퍼를 분리 합니다.</li>
		<li>PBS의 200 µ L을 추가 하 고 최종 회전 동안 끝 5 분 동안 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에 튜브 자석에 놓고 솔루션 지웁니다 때까지 몇 분을 기다립니다. 버퍼를 제거 하 고이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
간단한 차입
	<ol>
<li>구슬에 분자 학년 물 40 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 94 ᵒC에서 품 어.</li>
		<li>자석에 튜브를 놓고 몇 분 해결 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>새로운 관으로는 상쾌한을 전송 합니다. 비즈를 삭제 합니다.</li>
		<li>Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할. 참고:이 유형의 차입 작품 나중 정량 분석 및 일부 단백질 측정을 위해 잘 하지만 다른 경우에 항복 "청소기" 있다 아래에 설명 된 두 가지 대체 방법을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNase 차입입니다.
	<ol>
<li>각 튜브를 DNase 버퍼 x 1과 DNase의 U 2의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ᵒC에 15 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>자석에 튜브를 놓고 해결 될 때까지 몇 분 기다려야 합니다.</li>
		<li>구슬에서 eluted 샘플을 제거 하 고 새로운 낮은 바인딩 튜브에서 샘플을 배치.</li>
		<li>효소를 비활성화 및 proteomic 분석 진행 7 분 94 ᵒC에서 튜브를 품 어. 참고: 낮은 DNase 농도 간섭 proteomic 분석 관찰 되는 경우 사용할 수 있습니다. 그것은이 차입 메서드 DNase 치료 샘플에서 DNA 자료를 완전히 파괴 이후 사용 하는 경우 캡처 풍부 정량 계산 가능한 되지 않습니다.</li>
		<li>Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
발 차입17. 참고:이 메서드는 권장 되지 않습니다 오래 oligonucleotides (> 40 기지). 이 방법은 게놈 시퀀스와 오버랩 되지 않는 한 추가 8 기지를 포함 하는 캡처 oligonucleotides 및 보완 자료 oligonucleotides 캡처 oligonucleotides에서 대상을 제거 하려면 필요 합니다.<ol>
<li>SSC 버퍼의 40 µ L에서 릴리스 oligonucleotides의 2 nanomoles 희석.</li>
		<li>실시간에서 20 분 동안 품 어</li>
		<li>자석에 튜브를 놓고 몇 분 해결 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>구슬에서 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 평가 대상 캡처 영역의 관심에 대 한 뇌관으로 정량 하 여 항복 캡처
<ol><li>적절 한 소프트웨어 또는 온라인 도구를 사용 하 여 뇌관 및 대상 지역에 대 한 프로브 디자인. 참고:이 실험에서 DUSP3 및 DUSP5 의 발기인 지역 대상으로 했다. 뇌관 및 프로브 사용 되는 다음입니다. DUSP3: 뇌관 1-GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, 뇌관 2-CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM 표시 된 프로브-TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: 뇌관 1-TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, 뇌관 2-GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM 표시 된 프로브 TGC ATT 태그 AGC AGC CAG ATG AGG TT.</li>
	<li>Eluate (10 개 이상 µ L)의 약 수를가지고 고 희석 1:10 분자 학년 H2o.</li>
	<li>2.1.7 단계에서 aliquots의 한의 DNA를 추출 하 고 그 DNA 샘플 5 직렬 1:10 희석 분자에 H2o. 학년을 수행 하 여 표준 곡선을 사용 하 여</li>
	<li>정량 마스터 믹스 (다양 한 상업 대안) 준비, 뇌관 및 프로브를 추가 하 고 적절 한 금액 (15 µ L 20 µ L 반응을 실행 하는 경우)에 각 잘 분배.</li>
	<li>추가 5 µ L의: a) 희석 샘플, b)는 표준 곡선 또는 c) 분자 급료 H2O (템플릿 제어 역할)을 각 잘 하.</li>
	<li>접시를 밀봉 하 고 1 분 동안 100 x g에서 원심.</li>
	<li>다음 매개 변수는 정량 시스템에서 실행: 95 ᵒC에서 5 분 뒤에 20 95 ᵒC의 40 주기 s, 20 59 ᵒC s 및 25 72 ᵒC s.</li>
	<li>엉덩이 수율과 뒤섞여 캡처를 표준 곡선을 사용 하 여 캡처 특이성 평가.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci.">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li><li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Protein-DNA+Interactions+in+Human+Alphoid+Chromatin+via+Hybridization+Capture+and+Mass+Spectrometry.">Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li><li>Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+programmable+release+of+captured+DNA.">Multiplexed programmable release of captured DNA.</a> Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).</li><li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+(enChIP)+using+CRISPR.">Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).</li><li>Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Proteomics+Approach+for+the+Discovery+of+Chromatin-associated+Protein+Networks.">A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).</li></ol>

공개 관심의 없습니다 충돌을 확인 하 고 있습니다.

여기서 설명 하는 HyCCAPP 메서드는 그것에 게 밝히기 애매 남아 것 이다 DNA 상호 작용 하는 강력한 접근 방식을 많은 독특한 기능이 있습니다. 과정의 성격 HyCCAPP 다른 유기 체와 게놈의 지역에서 작동 하도록 유연성을 제공 합니다. 그러나 그것은 방법,, 그는 몇 가지 제한이 간주.
HyCCAPP 일차 전지, 세포 배양 시스템, 또는 심지어 조직 샘플에서 잠재적으로 적용할 수 있도록 셀 ...

지난 10 년 동안 많은 수의 샘플, 그리고 놀라운 해상도 다양 한 게놈의 연구를 수 있도록 시퀀싱 기술에 극적인 개선을 보았다. 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 컨소시엄, 국가 인간 게놈 연구소는 건강의 국가 학회의 주도로 대규모 다 기관 노력 개별 녹음 방송 요인에 대 한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 다른 규제 단백질 바인딩할 게놈 상호 작용. 초기 노력 Chromatin immunoprecipitation (칩)에 의해 100 개 이상의 알려진된 DNA 묶는 단백질1에 대 한 평가 특정 DNA 단백질 상호 작용, 특징. 등 DNase 프린팅2 포름알데히드 규제 요소 (시 키)3 의 보조 절연 단백질, 하지만 분명 한 제한으로 작용 하는 게놈의 특정 영역을 찾을 사용 되었습니다 또한 다른 방법에 실험 방법 팬 들은 상호 작용 단백질의 정보를 식별 하지 않습니다. 지난 년 동안 광범위 한 노력에도 불구 하 고 아무 기술 염색 질, 그리고 식별에 단백질 DNA 상호 작용의 포괄적인 특성화 및 정량화 chromatin 관련 단백질의 효율적으로 있도록 떠오르고 있다.
이 필요를 해결 하기 위해 우리는 우리가 Hybridization Capture of Chromatin-Associated 단백질으로 단백질 (HyCCAPP)에 대 한 불리는 새로운 접근 방식을 개발. 처음 개발 된 효 모4,5,6, 접근 가교 된 chromatin 관심 영역 (바인딩된 단백질)와 시퀀스 관련 교 잡 캡처를 사용 하 여 격리 합니다. 단백질-DNA 복합물의 고립, 후 질량 분석 등 접근 관심사의 순서에 바인딩된 단백질의 세트의 특성을 사용할 수 있습니다. 따라서, HyCCAPP 소설 DNA 단백질 상호 작용의 항 체 그리고 그것에 의존 하지 않습니다 의미를 밝히기 위해 바이어스 비 접근은 완전히 찾을 수 있는 단백질에 대 한 불가 지론으로 간주 될 수 있습니다. 다른 방법을 밝히기 소설 DNA 상호 작용 단백질7, 하지만 대부분 칩 같은 방법8,,910, 플라스 미드 삽입11,12,에 의존 하는 능력 13,14또는 높은 복사 번호15지역. 반면, HyCCAPP는 다중 및 단일 복사 영역에 적용할 수 있는 그리고 지역에서 단백질에 대 한 사전 정보는 필요 하지 않습니다. 또한, 일부 방법 중 위는 중요 한 기능, 특히 DNA-단백질 가교 반응, HyCCAPP의 독특한 특징은에 단일 복사 영역에 적용할 수 있습니다 필요를 피하고 수정 되지 않은 셀, 언급 하 고 없이 상 상속 의무적인 단백질, 또는 사용할 수 있는 항 체에 대 한 사전 지식.
이 시점에서, HyCCAPP 효 모4,,56, 다양 한 게놈 지역 분석에 주로 적용 되 고 최근 알파 위성 DNA 반복 영역에에서 단백질 DNA 상호 작용을 분석 하는 데 사용 했다 인간 게놈16. 우리의 지속적인 작업의 일환으로, 우리 처음 효 모 chromatin 인간 세포의 분석에 적용 되 고 현재 여기 단일 복사 대상의 선택적 캡처 수 있도록 수정 된 프로토콜에 대 한 개발 교 잡 캡처 접근을 적응 시켰다 우리의 초기 연구에서 효 모와 유사한 효율성으로 인간 게놈에 있는 영역입니다. 이 새로운 최적화 된 프로토콜 적응 및 질량 분석 또는 다른 분석 접근을 사용 하 여 인간 게놈 전체 DNA 단백질 상호 작용을 심문 기술의 활용 수 있습니다.
그것은 HyCCAPP 메서드를 사용 하면 특정 대상 지역 분석을 위한 게놈 넓은 분석에 적합 하지 않습니다 강조 하는 것이 중요. 기술 영역 상호 작용 단백질에 대 한 부족 한 정보는 거래 할 때 또는 특정 게놈 소재 시에 상호 작용 단백질의 더 포괄적인 심층 분석을 원할 때 특히 유용 하다. HyCCAPP은 DNA 묶는 단백질을 폭로 하지만 정확 하 게 genomic DNA에 특정 단백질 바인딩 사이트 특성을 하지 의미입니다. 현재 구현, 방법론 DNA 바인딩 시퀀스 또는 개별 단백질에 대 한 주제에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 따라서, 그것은 멋지게 시 키, 같은 기존 기술을 보완 하 고 게놈 지역에 소설 묶는 단백질의 id는 초기 시 키 분석으로 식별 하는 것을 허용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PrimerQuest tool</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Analyze capture oligonucleotids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PairFold</td>
			<td>UBC</td>
			<td></td>
			<td>Analyze interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>850 cm2 roller bottle&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>680058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller system</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>22-288-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson digital sonifier SFX 150</td>
			<td>Emerson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 5M</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12301D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 atreptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>60210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>SciGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube shaker and rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>415110Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC buffer 20&#215; concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics to mammalian cells

단백질 (HyCCAPP) 기술에 대 한 단백질 chromatin 관련의 교 잡 캡처 효 모에 소설 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 처음 개발 되었다. 분석을 대상 지역에 바인딩된 가능성이 단백질에 대 한 사전 지식 없이도 관심의 대상 영역을 수 있습니다. 이론에서 그러면 관심, 어떤 게놈 영역을 분석 하는 데 사용할 HyCCAPP 그리고 다른 세포 시스템에서 작동 하도록 충분 한 유연성을 제공 합니다. 이 방법은 알려진된 전사 인자, Chromatin Immunoprecipitation (칩) 및 칩 같은 방법에 대 한 더 적합 한 작업의 바인딩 사이트를 공부 하는 것은 아닙니다. HyCCAPP의 힘은 제한 된 DNA 영역을 탐구 하는 능력 또는 그것에 바인딩 단백질에 대 한 지식에 있다. 그것은 편견 (칩 같은 방법에 존재 하는) 단백질 기반 chromatin 농축 항 체를 사용 하 여 도입을 방지 하는 편리한 방법을 수 있습니다. 잠재적으로, HyCCAPP를 진정으로 새로운 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 강력한 도구를 수 있습니다. 날짜 하려면, 기술은 주로 적용 된 효 모 세포 또는 포유류 세포에서 높은 복사 반복 시퀀스. 우리가 구상 하는 강력한 도구가 되었다, HyCCAPP 접근 포유류 세포에서 단일 복사 loci를 효율적으로 캡처를 최적화 해야 합니다. 여기, 선물이 우리의 적응 초기 효 HyCCAPP 프로토콜 인간의 세포 라인을 캡처하고 표시 단일 복사 chromatin 지역이 수정 프로토콜 효율적으로 격리 될 수 있습니다.

때문에 성공 하려면 HyCCAPP chromatin의 대용량 입력된에 대 한 필요성, 세포 confluency의 상대적으로 높은 수준에 성장 된다. Trypan 세포 사망률은 보통 확인 하는 데 사용은 블루 얼룩 (< 10%). 단일 복사본 실험, chromatin 콘텐츠 교 잡 캡처 해야 femtomolar 범위에서 이전에 보통 시작 물자로 적어도 109 셀을 필요 합니다. 전체 규모 실험, 이전에 더 작은 일괄 처리 캡처 oligonucle...

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Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

adaptation-hybridization-capture-chromatin-associated-proteins-for

Research

JoVE Journal

Genetics

6.2K 조회수.  Texas Biomedical Research Institute. 이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly defined states of chromatin organization. The dynamic architecture of the nucleus is controlled by multiple mechanisms and shapes the transcriptional output programs. It is, therefore, important to determine locus-specific chromatin accessibility in a reliable fashion that is preferably independent from antibodies, which can be a potentially confounding source of experimental variability. Chromatin accessibility can be measured by various methods, including the Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) assay, that allow the determination of general chromatin accessibility in a relatively low number of cells. Here we describe a FAIRE protocol that allows simple, reliable, and fast identification of genomic regions with a low protein occupancy. In this method, the DNA is covalently bound to the chromatin proteins using formaldehyde as a crosslinking agent and sheared to small pieces. The free DNA is afterwards enriched using phenol:chloroform extraction. The ratio of free DNA is determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or DNA sequencing (DNA-seq) compared to a control sample representing total DNA. The regions with a looser chromatin structure are enriched in the free DNA sample, thus allowing the identification of genomic regions with lower chromatin compaction.

The plasticity of nuclear architecture is controlled by dynamic epigenetic mechanisms including non-coding RNAs, DNA methylation, nucleosome repositioning as well as histone composition and modification. Here we describe a Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) protocol which allows the determination of chromatin accessibility in a reproducible, inexpensive, and straightforward manner.

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly being extended to integrative studies to enhance the understanding of molecular dynamics within cells. Current tools for the visualization and integration of proteomics with other omics datasets are inadequate for large-scale studies. Furthermore, they only capture basic sequence identify, discarding post-translational modifications and quantitation. To address these issues, we developed PoGo to map peptides with associated post-translational modifications and quantification to reference genome annotation. In addition, the tool was developed to enable the mapping of peptides identified from customized sequence databases incorporating single amino acid variants. While PoGo is a command line tool, the graphical interface PoGoGUI enables non-bioinformatics researchers to easily map peptides to 25 species supported by Ensembl genome annotation. The generated output borrows file formats from the genomics field and, therefore, visualization is supported in most genome browsers. For large-scale studies, PoGo is supported by TrackHubGenerator to create web-accessible repositories of data mapped to genomes that also enable an easy sharing of proteogenomics data. With little effort, this tool can map millions of peptides to reference genomes within only a few minutes, outperforming other available sequence-identity based tools. This protocol demonstrates the best approaches for proteogenomics mapping through PoGo with publicly available datasets of quantitative and phosphoproteomics, as well as large-scale studies.

Here we present the proteogenomic tool PoGo and protocols for fast, quantitative, post-translational modification and variant enabled mapping of peptides identified through mass spectrometry onto reference genomes. This tool is of use to integrate and visualize proteogenomic and personal proteomic studies interfacing with orthogonal genomics data.

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...