이 프로토콜은 인간 백혈구에 의해 표지된 아스퍼길러스 fumigateurs Conidia의 phagocytosis를 정량적으로 측정하기 때문에 중요합니다, 세포에 Conidia의 부착과 더불어, 및 유동 세포측정에 의한 상호 작용의 부족. 이 방법의 주요 장점은 많은 수의 세포의 빠른 분석을 용이하게한다는 것입니다. 또한, 세포 마커의 라벨링은 동일한 샘플 내에서 호중구 및 단핵구의 분리 평가를 허용한다.
어떤 이 기술에서 Mucorales 같은 다른 임상 관련 곰 팡이 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. 대신 적혈구는 phagocytes로 사용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 소독제로 종이 타월을 적시고 바이오 안전 캐비닛에 넣습니다.
휘발성 코니디아의 과잉 분포를 방지하기 위해 종이 타월 위에 재배 된 아스퍼 질러스 훈가투스 접시를 놓습니다. 곰팡이 위에 0.01 %의 세제가 들어있는 PBS 10 밀리리터를 추가하고 드리갈스키 주걱을 사용하여 접시 위에 액체를 퍼 뜨리고 어두운 색의 코니디아를 문지릅니다. 30 마이크로미터 스트레이너를 통해 Conidia 서스펜션을 50 밀리리터로 전송하여 잔류 균을 제거합니다.
접시에 세제가 있는 PBS 10밀리리터를 추가하여 주걱으로 퍼뜨리고 여과기를 통해 동일한 튜브로 옮습니다. 다음으로, PBS에 용해된 0.1 어금강 탄산나트륨의 멸균 용액을 준비한다. 그리고 이 탄산 나트륨 용액에서 FITC 분말의 0.1 밀리머용액을 준비합니다.
1억 밀리리터 튜브에서 이 FITC 용액의 5밀리리터에서 1억 이하의 코니디아를 다시 중단합니다. 섭씨 37도에서 20분간 회전기에서 배양하세요. 코니디아로 팽창하기 위해 FITC라벨이 있는 코니디아를 RPMI 배지 5밀리리터로 10%FCS로 보충합니다.
그리고 원하는 시간 동안 섭씨 37도에서 회전에 배양. 바이오 안전 캐비닛에 5밀리리터의 버피 코트를 50밀리리터 튜브에 넣습니다. EL 버퍼로 튜브를 채우고 세 번 반전합니다.
혼합물의 유백색 모양이 명확해질 때까지 5~8분 동안 수평으로 배양합니다. 그런 다음 원심 분리기는 300 배 G, 실온에서 10 분 동안. 상체를 버리고 파이펫팅을 통해 EL 버퍼의 1밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.
EL 버퍼의 또 다른 24 밀리리터를 추가하고 튜브를 여러 번 반전시면 됩니다. 원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간. 10%의 FCS로 보충된 RPMI 미디어의 1밀리리터에서 상체를 폐기하고 세포를 다시 중단합니다.
우선, 200만 개의 백혈구와 400만 FITC 라벨이 부착된 코니디아를 10%FCS로 보충한 1.5밀리리터의 12웰 컬쳐 플레이트로 이송합니다. 코니디아가 없는 세포의 제어와 표지가 없는 코니디아를 가진 세포의 제어를 포함합니다. 가습 된 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 원하는 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
잠복이 완료되면 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확하고 15 밀리리터 튜브로 옮습니다. 먼저 각 샘플의 100 마이크로리터를 넣고 96웰 V-바닥 플레이트의 한 웰에 컨트롤을 넣습니다. 세척을 위해 EDTA의 2 밀리머를 포함하는 PBS의 150 마이크로 리터를 추가합니다.
색상 보정을 위해 각 색상마다 Conidia없이 100 만 개의 셀을 플레이트의 다른 우물에 놓습니다. 훈련받지 않은 상태로 남겨질 세포의 우물을 포함합니다. 세탁을 위해 각 웰에 EDTA 의 2 밀리몰라를 포함하는 PBS의 150 마이크로 리터를 추가합니다.
다음으로, 접착제 호일로 접시를 덮고 원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간 덮습니다. 그런 다음 호일을 제거하고 싱크대 또는 일회용 종이 타월을 통해 한 번만 접시를 신속하고 강제로 반전시켜 상체를 폐기하십시오. 항체 믹스의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고, 파이펫팅에 의해 잘 혼합.
색상 보정을 위해, EDTA의 2밀리머를 포함하는 PBS의 100 마이크로리터에서 각각의 세포를 재보중단하고, 항체 믹스에 사용되는 것과 동일한 양으로 각각의 웰에 단일 항체 유형을 추가한다. 접착제 호일로 덮고 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 그 후 호일을 제거하고 세척을 위해 각 웰에 EDTA 2 밀리머를 포함하는 PBS의 150 마이크로리터를 추가합니다.
접시를 접착제 호일로 다시 덮습니다. 원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간. 그런 다음 호일을 제거하고 싱크대 또는 일회용 종이 타월을 통해 접시를 빠르고 강력하게 반전시켜 상체를 버립니다.
2 밀리머 EDTA를 포함하는 PBS의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고, 각각의 우물에서 세포 현탁액을 별도의 둥근 바닥 튜브로 전송한다. 흐름 세포계를 시작하고 따뜻하게 하십시오. 획득 소프트웨어에서 새 실험을 만들고 새 샘플을 설정하고 레이블을 지정합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 형광에 대한 매개 변수 및 검출기를 설정합니다. 이 소프트웨어에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 점 플롯을 표시합니다. 세포만 샘플을 사용하여 일부 세포를 획득하고 백혈구 주위의 게이트를 설정합니다.
백혈구 게이트에 기초하여, CD45 양성 셀에 대한 게이트, SSC CD45 플롯에서 코니디아에서 분리. 점 플롯에서 CD14, CD66b, 게이트 호중구 및 단핵구는 별도로 합니다. 그 후, 세포에서 만 샘플, 레이블이 지정되지 않은 Conidia로 변경합니다.
도트 플롯에서 안티 FITC, APC FITC는 안티 FITC 및 FITC 신호에 대한 세트 사분면에 호중구를 표시합니다. 통계 보기를 열고 사분면을 조정하여 1분기, 2분기 및 Q4에서 최대 1%의 셀을 허용합니다. 단핵구 게이트에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 백혈구 게이트에서 최소 20, 000 개의 이벤트로 모든 샘플을 기록하십시오.
인간 호중구에 의해 FITC 라벨 코니디아의 phagocytosis통계 보기에서 읽을 수 있습니다. 이 연구에서는, 빠른 유동 세포 측정 방법은 많은 수의 1차 인간 백혈구를 가진 아스퍼길러스 fumigateurs Conidia의 상호 작용을 측정하는 데 사용됩니다. 여기에 도시된 적절한 항체 및 게이팅 전략을 사용하여, FSC 및 SSC 특성에 의한 인간 백혈구의 일반적인 게이팅은 자유 코니디아에서 백혈구를 분리하고, 팬 백혈구 마커, CD45에 의해 뒤따릅니다.
Conidia는 특히 부어 콘니디아를 사용할 때, 또는 긴 잠복 시간을 사용할 때, 흐름 세포 측정의 시간에 거의 세포 크기에 도달 할 수 있으며, 따라서 우리에게 분석을 구입할 수 있습니다. 인간 1차 단세포와 호중구가 코니디아를 다르게 차지하기 때문에, 이 프로토콜은 잘 확립된 세포 계보 마커를 가진 염색, 단핵구CD14 및 호중구를 위한 CD66b를 기반으로 이러한 세포 집단의 분리된 분석을 허용합니다. Conidia를 내면화하는 인간 1 차 적인 phagocytes의 백분율은 혈액 기증자 중 높게 가변할 수 있습니다, 그러나 또한 Conidia의 잠복기 및 팽윤 상태와 같은 실험적인 요인에 달려 있습니다.
포자 내재화는 0.5시간의 공동 배양 후 검출될 수 있으며, 시간이 지남에 따라 증가한다. 미리 부어 오른 코니디아는 짧은 인큐베이션 시간에도 포자를 쉬는 것보다 쉽게 차지합니다. 코니디아가 포름알데히드로 고정되면, phagocytosis는 네이티브 코니디아에 비해 감소된다.
이 절차에 따라, 공동 배양 면역 세포와 Conidia의 슈퍼 나티온을 수집하고 면역 세포에 의해 세포 카인 방출을 유도 하는 경우 확인 엘리자에 의해 분석 될 수 있다. 인간의 혈액은 잠재적으로 전염병을 전송할 수 있습니다. 이 작품은 B형 간염에 걸쳐 예방 접종을 필요로, 바이오 안전 캐비닛의 사용뿐만 아니라 실험실 코트에 장갑을 착용.
