이 작품은 알레르기의 국립 연구소와 전염병 부여 R01AI079253 (BHS까지)에 의해 지원되었다에게 국립 암 연구소 암 센터 지원 그랜트 CA016056 로즈웰 파크 암 연구소에.

이 연구에서 동물에 수행 된 모든 절차는 로스웰 파크 암 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 연방의 모든 상태, 준수, 보건 규정의 국립 연구소했다. 1. 생체 내 대 식세포 라벨링 참고 : PHK26은 (IV) 정맥 투여시 혈액 순환 및 조직에 모두 식세포에 의해 흡수 될 친 유성 염료입니다. PKH26는 대식구의 수확 후 조작의 양을 최소화하는 생체 표지에 사용 하였다. PKH-26은 안정적으로 장기간에 걸쳐 폐포 대 식세포의 축적의 장점이 있습니다. 십일 투여 후 기다리는 PKH26 8, 9 만 폐포 대 식세포 안정적으로 레이블을 떠나 순환의 모든 레이블 세포의 정리를 할 수 있습니다. PKH26는 여기 (551 NM) 및 방출 (567 nm의) 특성 호환이 빨간색 형광 색소입니다로다 민 또는 피코 에리 트린 탐지 시스템과. 모든 라벨 절차는 생존 능력의 손실을 포함, 유물을 소개 할 수있다. 우리는 다른 마우스 유전자형에서 대 식세포의 표시에 대해 동일한 방법을 사용하기 때문에, (예를 들어, WT 대 NADPH 산화 효소 결핍),이 유물의 효과가 균일하다. <ol><li> PKH26의 원액 (에탄올에 1 × 10 -3 M) 제조업체에서 제공하는 희석제 C에서 1:5 희석. </li><li> 각 마우스의 1 / 2 ml의 인슐린 주사기 (29 G x 1 / 2 &quot;)에 희석 PKH26의 부하 100 μL. </li><li> 수확하기 최소 10 일 전에 정맥 주사 (꼬리 정맥 또는 복고풍 궤도 중 하나)에 의해 마우스로 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol> 폐포 2. 수확 폐포 대 식세포 (BAL) 실험에 사용하는 마우스의 수는 달라질 수있다. 비자극 마우스로부터 전형적인 수율은 3-5 × 105 폐포의 대 식세포의 범위이고, 그러나이 숫자는 BAS 크게 달라질 수이러한 세척을 수행하는 사람의 마우스, 경험의 크기 및 세척액과 폐로부터 회수 볼륨 instillations의 수와 같은 요인에 ED. 이 프로토콜에서 폐 세척을 반복 1 ㎖의 lavages와 함께 세포 수율을 향상하는 데 도움이 폐쇄 흉강으로 수행된다. <ol><li> 멸균 용액을 유지하기 위해 무균 조건을 사용 AVERTIN 마취제 치사량 (12.5 mg)을 복강 내 (IP)을 투여하여 마우스를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 철저하게 마우스 스프레이. </li><li> 흉부 (그림 1A)를 노출 동물의 두개골 끝으로부터 피부를 제거합니다. <ol><li> 다만 다이어프램 아래 피부에 작은 상처를 확인합니다. </li><li> 컷에 손가락을 삽입하고 멀리 동물 (그림 1A)의 두개골 끝에서 피부를 잡아 당깁니다. </li><li> 목의 복부 측면 (그림 1A)를 확장, 머리에 약간 밀어. </li></ol></li><li> 흉곽을 통해 작은 구멍을 잘라흉부의 오른쪽에 폐를 수축하고 또한 다음 단계에서 폐의 시각화를 허용합니다. </li><li> 기관을 찾아 조심스럽게 주위 조직을 멀리 해부하다. <ol><li> 곡선 집게로 침샘, sternohyoid 근육과 후두 등을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 곡선 집게로 들어 올려 가위로 기본 고리 연골 구조를 드러내기도 (외막)를 덮고있는 얇은 조직을 절개. </li></ol></li><li> 기관에 카테터를 삽입합니다. <ol><li> 곡선 집게를 사용하여 기관 (에 지느러미) 뒤에 봉합을 배치하고 개방을 통해 10 cm 길이를 당깁니다. </li><li> 윤상 (연골의 농축 링) 위에 시작하는 것은 신중 기관은 흉골 뒤​​에 사라지는 중지 기관의 아래 22 G 카테터를 안내합니다. </li><li> 단단히 아늑한 적합을위한 기관 및 카테터 주위 봉합을 묶어. 카테터에서 바늘을 제거합니다. </li></ol></li><li> 4 방향 코크를 조립합니다. <ol><li> 기입하나 6 ㎖를 DPBS, 1 % FBS 주사기와 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 4 방향 꼭지에 연결합니다. </li><li> 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 표시된 위치에 빈 6 ML의 주사기를 연결합니다. </li><li> 카테터에 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 열린 포트를 연결합니다. 기관에서 도관을 제거하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 폐에서 세척 유체를 수집합니다. 참고 : 수사는 조직 손상의 가능성을 최소화하기 위해 세척 유체의 하부 볼륨을 사용하도록 선택할 수있다. 그것은 동일한 방식 일관 모든 마우스 그룹에 적용하는 것이 중요하다. <ol><li> 그래서 빈 주사기가 닫혀 꼭지의 핸들을 돌려 천천히 폐를 팽창시키는 ~ 1 ㎖의 DPBS, 1 % FBS를 주입. 2.4 단계에있는 구멍 컷을 통해 폐의 팽창을 준수하십시오. </li><li> 폐를 overinflate하지 않도록주의하십시오. </li><li> 전체 주사기를 닫을 수 있도록 마개의 핸들을 돌려 조심스럽게 독감 철회<html> 폐의 ID입니다. </li><li> 폐 단계 1.4의 홀 가공을 통해 폐의 관찰합니다. 카테터는 좋은 무승부를 얻기 위해 약간 앞뒤로 이동해야 할 수 있습니다. 기관 내에서 카테터를 유지하기 위해 특별한 예방 조치를 취할. </li><li> 반복 FBS 1 %를 주입하고 폐 단종 된 모든 DPBS까지 2.8.1-2.8.4 5 배의 단계를 반복합니다. 참고 : 폐 유체의 복구가 주입 액의 100 %되지 않습니다. </li></ol></li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 세척 유체 빈 주사기. 상온에서 전지를 보관하십시오. </li><li> 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 붓는다. 원하는 경우에 사이토 카인 분석을 위해 저장 될 수 있습니다. </li><li> 10 % FBS와 1 ~ 5 ㎖의 RPMI 1640 세포를 재현 탁하고 혈구를 계산합니다. 비자극 마우스에서는 BAL 의해 수확 된 세포의&gt; 95 %는 세포 검사에 의해 확인 될 수있는 대 식세포가 될 것으로 예상된다. </li></ol> 3. 배양 및 수확 버섯 &quot;&gt;이 프로토콜에 사용되는 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스의 수명주기의 모든 단계에 걸쳐 GFP를 표현 :. 포자, germlings 및 균사이 곰팡이 균주 박사 마고 무어, 사이먼 프레이저 대학, 버나비, BC, 캐나다에 의해 제공되었다. <ol><li> 클로람페니콜 (0.05 g / L) 및 겐타 마이신 (0.5 g / L)와 기울기 한천 사부로 뇌 심장 주입 (BHI)에 GFP를 표현 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스 균주의 플레이트 생포. </li><li> 느슨하게 실온에서 7~10일에 덮인 어둠 속에서 품어. </li><li> DPBS 0.01 % 트윈 20 10 ㎖로 세척 경사에 의해 수확 생포. 살짝 느슨하게 stripette와 곰팡이를 다 쳤어요. 수율을 높이기 위해 경사를 여러 번 씻어. </li><li> 50 ML 원뿔에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 포자 현탁액을 전달합니다. </li><li> 10 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 펠렛의 생포. </li><li> 을 Resuspend 50 ㎖의 DPBS에서 생포 및 혈구를 사용하여 계산합니다. </li><li> DPBS로 두 번 세척하고 원하는 집중 한에 희석록해. </li></ol> 4. 곰팡이 도전과 공 초점 현미경 숙주 방어 식세포 NADPH 산화 효소의 역할을 조사하기 위해, 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하기위한 세 가지 유전자형 생쥐로부터 격리 폐포 대 식세포의 능력을 평가 하였다. 이 연구에 사용 된 유전자형은 다음과 같습니다; 자연적으로 발생하는 Ncf1 돌연변이 (Ncf1 그들에게 NADPH 산화 효소의 결핍을 떠나 P47의 phox, 식세포의 NADPH 산화 효소의 필수 구성 요소)에 대한 인코딩, 3) Ncf1 * / 1) 야생형 마우스, 2) Ncf1 * / * MN-마우스 * + Mn이 형질 전환 마우스 NADPH 옥시 다제 활성은 단핵구 / 대 식세포 인구 (10, 11)에서 재구성 된 (MN은 인간 CD68 프로모터의 제어하에 야생형 Ncf1 은닉 유전자를 나타낸다.) 공 초점 현미경은 최고의 인해 존재로이 분석에 적합그리고 슬라이드에 비 포식 분생 포자의 성장. 공 초점 현미경은 Z 축 내 개인 비행기의 시각화를 허용하고, 대식 세포 내부보다는 주위에 성장하는 곰팡이 사이에 차별화를 가능하게 할 것이다. 모든 공 촛점 이미지는 63X 기름 침지 렌즈를 사용하여 획득된다. Z-스택은 2.5의 전자 줌 배율로 획득됩니다. Z-스택의 두께는, 필드의 상단 및 하단을 찾을 DAPI 및 명 시야 이미지를 사용하여 결정된다. Z-스택은 ~ 1 μm의 두께 (14)로부터 개별 조각 24 μm의였다. 대식 세포의 정량, 1X 전자 줌의 단일 스캔은 유전자형 당 10 필드를 수행 하였다. 본래 식세포 각각 PKH26 및 멤브레인과 핵의 DAPI 염색에 근거 확인되었다. 분생 포자는 FITC 표현과 시야 이미지를 기반으로 확인되었다. <ol><li> 불임의 coverslips와 접시를 준비합니다 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에서 70 % 에타의 22 X 22mm 유리 커버 슬립을 흡수5 ~ 10 분 동안 L. </li><li> 멸균 PBS에 커버 슬립을 씻어. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 부드럽게 멸균 단독으로 포장 된 6 - 웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 하나의 커버 슬립을 배치합니다. </li></ol></li><li> 씨 ~ 1 × 10 6 PKH26 각 커버 슬립에 폐포 RPMI 1640 300 μL에 현탁 식세포, 10 % FBS를 표시 수확. 정확한 수는 수확 수율에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 대식 세포는 밤새 5 % CO 2와 37 ° C에서 배양하여 부착 할 수 있습니다. </li><li> 다음 날 아침, ~ 1 × 10 7 GFP - 표현 A.에게 추가 미가 투스의 포자는 100 ㎕의 예열 (37 ℃) RPMI 1640, 10 % FBS에서 일시 중단. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 플레이트를 반환합니다. </li><li> 세포를 4 ℃의 실온에서 하룻밤 2 시간의 최소 고정되어야한다 같은 각각 2 %, 포름 알데히드의 양 아니라 (최종 농도 1 %의 포름 알데히드)을 추가하여 3, 7, 14 시간 수정 세포에서. 장소 플레이트4 ° C 하룻밤에 이른 시점. 최종 시점 (14 시간)의 경우, 실온에서 2 시간 동안 세포를 고정한다. </li><li> 고정 후, 부드럽게 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하고 DPBS에 헹군다. </li><li> 접힌 킴 와이프에 커버 슬립의 가장자리를 배치하여 여분의 액체를 제거합니다. </li><li> 유리 현미경 슬라이드에 DAPI와 6 μL 형광 설치 매체를 적용합니다. </li><li> 슬라이드 커버 슬립 중 하나 가장자리를 놓고 부드럽게 장착 매체로 아래로 셀 측에 놓습니다. 매체를 장착하면 확산 커버 슬립 아래도 층을 형성 할 것이다. 커버 슬립에 누를 필요가 없습니다. </li><li> 명확한 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 공기 건조 할 수 있습니다. </li><li> 상점은 공 초점 현미경으로 분석 할 준비가 될 때까지 실온에서 (빛으로부터 보호) 슬라이드 상자에 슬라이드를 준비했다. </li></ol>

<ol>
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Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

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함께 생체 진균 챌린지와 대 식세포의 항균 활성의 생체 외 분석을 위해 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 이전 식세포의 NADPH 산화 효소는 A. 방어에서 중요한 역할을한다는 것을 입증 미가 투스 4. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 호중구 모집)의 부재에서 자신의 항진균 활...

폐포 대 식세포는 흡입 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식 섭취 및 흡입 포자 (분생 포자)의 성장을 제한하고 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 슈퍼 옥사이드 음이온 및 다운 스트림 활성 산소 중간체 (로아)에 산소 분자를 변환합니다. 만성 육아 종성 질환 (CGD)는 심각한 세균 및 곰팡이 감염에 의해 과도한 염증 반응이 특징 NADPH 산화 효소의 유전 질환이다. NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 - 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이전 연구는 호중구가 주로 균사의 단계 5를 대상으로하는 반면 폐포 대 식세포가 섭취 및 아스 페르 길 루스 포자를 죽이는 것으로 나타났습니다. 그러나, 충돌 resul가 있었다A.의 성장을 억제하는 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 역할에 같은 TS 미가 투스는 6, 7, 포자. 이 방법의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스 포자. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 가장 밀접하게 흡입 곰팡이에 대한 호스트 응답을 모델링하기 위해, 우리는 비자극 마우스에서 바로 희생 다음과 같은 기관지 세척하여 수확 폐포 대 식세포를 사용했습니다. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 모집 호중구)의 부재에 자신의 항진균 활성에 초점을 할 수있었습니다. 이 방법에서는, 폐포 대 식세포가 수확 후 조작의 양을 최소화하기 위해 수확 전에 생체 내에서 염색 하였다. &lt;/ P&gt; 이 프로토콜의 또 다른 장점은 GFP-발현 A.의 사용이다 미가 투스의 변형. 이 균류는 균사의 단계를 통해 포자 단계에서 GFP를 표현하고 추가 염색에 대한 필요가 없습니다. 더 상세한 이미지를 얻으려면, 우리는 얻은 이미지로부터 3 차원 구조의 재구성을 가능하게 공 초점 현미경을 선택했다. 입체 재건 균사가 대 식세포 또는 통해 주위에 성장보다는 구별 할 수있는 기능을 제공합니다. 분생 포자는 세포 대 세포로 정확하게 구별 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,2,2 Tribromoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T48402</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A-1685</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4CL</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0171</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P91444</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">381523</td>
			<td>Insyte Autoguard Winged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 ml syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4-way stopcock</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-700-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">suture thread</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze sponges (4 inch square)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30396.03</td>
			<td>heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hema 3 Stain Set</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-122-911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytoseal 60</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">297252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 micron Cell Strainers</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">64753-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scissors</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leica DM1000 light microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytospin 2 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37 &#176;C, 5%&#160; CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">22X22 mm micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366-227</td>
			<td>glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0502-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vectashield Mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

폐는 숙주 세포가 정기적으로 미생물 및 미생물 제품에 노출되는 인터페이스입니다. 폐포 대 식세포는 흡입 버섯 및 기타 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포 등 면역 세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식하고 다운 스트림 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 활성 산소 중간체 (로아)을 생성 및 호스트 방어에 중요합니다. NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 - 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이 연구의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 여기서, 우리는 마우스의 능력을 평가하는 방법을 서술포식 누룩 곰팡이 포자 (분 생자)의 성장을 제어하기 lveolar 식세포 (AMS). 폐포 대식 세포는 생체 내에서 스테인드 및 10 일 후 기관지 폐포 세척액 (BAL)에 의해 생쥐에서 격리됩니다. 대 식세포는 유리 커버 슬립에 도금되어, 다음 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 A.을 시드 미가 투스 포자. 지정된 시간에, 세포를 고정 및 포식 포자 그대로 식세포의 수는 공 초점 현미경에 의해 평가된다.

<html> 비자극 생쥐에서 BAL에 의해 폐포 대 식세포를 수집하는 것은 세포 검사를 기반으로&gt; 95 % 순수한 인구가 발생합니다. 3과 7 시간 (그림 2) 시점은 곰팡이 성장의 균사 무대 앞에와 유전자형 사이에서 분생 포자의 식세포의 효율성 비교를 할 수 있습니다. 유전자형이 조직 침습 균사 스테이지 포식 분생 포자의 전이 (도 3)를 억제하는 능력에 대하여 비교 될 수있는 14 ?...

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Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K 조회수.  Roswell Park Cancer Institute.  공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법. 

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...