Name: identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
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우리 감사 NIAMS 빛 이미징 섹션 현미경 및 기술 지원을 제공 합니다. MF20 및 Pax7 항 체 개발 연구 Hybridoma 은행은 NICHD의 후원 하에 개발 하 고 유지 관리 학과 생물 과학, 아이오의 대학, 아이오와 시티에서 얻은 했다. 이 작품은 국립 보건원의 NIAMS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 성인 쥐 (2-6 개월), tibialis 앞쪽 (TA) 및 신 근 digitorum longus (EDL)의 앞쪽 뒷 다리 근육 그들의 SCs에 얼룩 면역 형광 검사를 수행 하려면 예제로 채택 되었다. 모든 단계 마우스 및 근육 조직 해 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIAMS/NIH에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 뒷 다리에서 따/EDL 근육 해 부
<ol><li>NIH의 ACUC의 지침에 따라 CO2 채워진된 안락사 챔버에 마우스 안락사 필요한 경우 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.</li>
	<li>위에 마우스 얼굴 업 해 부 패드 (부정사). 복 부 피부에 70% 에탄올 스프레이. 마우스 배 스킨의 중앙에 가로로 여 1-2 cm를 잘라 다음 마우스 피트를 향해 개방을 당겨서 마우스를 deskin. 마우스 뒷 다리 사지의 한쪽을 노출 합니다.</li>
	<li>두 개의 날카로운 집게를 사용 하 여: 발목, TA/EDL을 연결 하는 힘 줄을 하나를 사용 하 고 다른 하나를 사용 하 여 휴식을 전단 TA/EDL을 취재 하는 근 막. 일단 근 막 벗는 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 TA/EDL 근육 아래 팁을 실행 하 여 TA/EDL 경골 뼈에서 분리.</li>
	<li>여전히는 집게로 잡고가 위로 발목 힘 줄을 잘라. 집게와 발목 쪽에서 TA/EDL을 해제 하는 동안 근육은 TA/EDL 발목에서 무릎에의 경도 선 따라가 위로 잘라. 전체 TA/EDL 경골에서 분리를 무릎 쪽 힘 줄을 잘라.</li>
</ol>2. Cryo-포함 TA/EDL 근육의
<ol><li>컨테이너, 예를 들어액체 질소 목욕 준비., 액체 질소 Dewar 플라스 크. 작은 플라스틱 비 커에 (약 20 mL) 반 전체에 methylbutane를 붓는 다. 그럼 그것을 동결에 액체 질소 목욕에서 비 커를 넣어. 몇 분 후에 methylbutane 동결 되었음을 확인 합니다. 참고: 액체 질소는 드라이 아이스의 양동이 의해 대체 될 수 있지만 동결 시간 느립니다.</li>
	<li>해 부 TA/EDL 작은 플라스틱 주사기 플런저의 평평한 표면에 놓으십시오. 완전히 조교/EDL 몇 방울의 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물 (냉동 매체)로 커버.</li>
	<li>액체 질소 목욕 중 methylbutane 비 커 고 따뜻한 개체와 표면 해빙 (예.가 위 손잡이). 신속 하 게 딥은 O.C.T. 스냅-동결 조직에 녹 인된 methylbutane로 플런저에 TA/EDL을 커버.</li>
	<li>집게와 플런저에서 포함 된 조직을 분리 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 더 많은 샘플을 처리 하는 동안 그것을 저장 하는 장소 액체 질소에 튜브. 참고: 포함 된 조직 저장할 수 있습니다 장기 (2 년) 또는-20 ° C-80 ° C에서 짧은 기간 (6 개월)에 대 한.</li>
</ol>3. cryostat 단면
<ol><li>O.C.T.는 cryostat의 견본 홀더의 중심에 복합의 한 방울을 추가 합니다. O.C.T. 화합물은 거의 확정 될 때까지 기다립니다. 신속 하 게 발목 쪽으로 수직 O.C.T. 화합물에 포함 된 TA/EDL 스틱 다운 및 무릎 쪽까지.</li>
	<li>탑재 한 cryostat에 견본 홀더, 조직 10 µ m 간격 자르고에 대 한 프 로스트 코팅 슬라이드와 cryo-섹션을 수집 한 슬라이드에 4-8 절.</li>
	<li>적어도 3 h 하룻밤 실 온에서 섹션을 건조. 참고: 비록 하룻밤 이상 냉장고에 섹션을 건조 하는 것은 허용, 그것은 필연적으로 증가 합니다 하지는 autofluorescence. 최상의 결과 얻으려면 건조 0.5 h에 대 한 섹션 진행 됩니다 고정과 얼룩 단계 즉시.</li>
	<li>슬라이드 상자에서 슬라이드를 수집, 즉시 그들을 사용 하 여 또는-80 ° C 또는-20 ° C 나중에 사용할 슬라이드를 저장.</li>
</ol>4입니다. 면역 형광 염색 법에 대 한 시 약의 준비
<ol><li>
버퍼를 준비:
	<ol>
<li>10 x PBS에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 2 리터를 준비 합니다.</li>
		<li>1 x PBS 16%에서 4 %paraformaldehyde (PFA)의 40 mL 준비 PFA.</li>
		<li>PBST의 2 리터를 준비: 0.1% 트리톤-100 1 x PBS.</li>
		<li>2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 PBST-b: PBST의 50 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>2%와 5 %BSA 정상 염소 혈 청으로 PBST-B-g: PBST의 10 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>1 mL 차단 솔루션의 준비. 희석 AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) (1:10) PBST-b</li>
		<li>1 x 시트르산 버퍼의 200ml를 준비 합니다. 참고: 위의 솔루션의 볼륨은 적어도 5 슬라이드에 대 한 충분 한. 볼륨은 슬라이드의 수와 슬라이드 컨테이너의 크기에 따라 조정 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 체 얼룩을 준비:
	<ol>
<li>1 차 항 체 (작업 농도): Pax7 마우스 단일 클론 항 체 (IgG1) 희석 하 여 1 차적인 항 체 혼합의 1.2 mL를 준비 (1-5 µ g/mL) + Laminin polyclonal 토끼 항 체 (0.5-2 µ g/mL) + MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) (0.5-2.5 µ g / mL) PBST-B-g 참고: MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) 선택 사항입니다.</li>
		<li>2 차 항 체 (작업 농도): 염소 반대로 마우스 IgG1 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 488 diluting 하 여 1.2 mL 이차 항 체 혼합의 준비 (0.5-2 µ g/mL) + 염소-토끼 IgG (H + L) 높은 간-흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 플러스 555 (0.5-2 µ g/mL) + 염소 반대로 마우스 IgG2b 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 647 (0.5-2 µ g/mL) PBST-B-g 참고: 알 렉 사 Fluor 647 선택 사항입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 면역 형광 염색 법 단계
<ol><li>
Rehydrate 하 고 PFA와 cryo-섹션을 수정.
	<ol>
<li>슬라이드 상자에서 TA/EDL cryo-섹션 슬라이드의 몇 가지를 제거 합니다. 따뜻한 실 온에서 슬라이드 잡고 트레이에 슬라이드.</li>
		<li>액체 차단 펜 (PAP 펜)를 사용 하 여 모든 곳을 알아내는-섹션 슬라이드에 포함 된 영역을 그립니다. 이 원형 슬라이드 밖 흐르는 솔루션을 막을 것 이다.</li>
		<li>실험실 연기 후드에는 트레이 가져가 라. 300-500 µ L 4%의 추가 10 분 1 x PBS와 PFA에 밖으로 세척에 대 한 실 온에서 섹션을 해결 하기 위해 원된 영역 내에서 슬라이드에 PFA 슬라이드 컨테이너에서 적어도 3 x 5 분. 주의: PFA는 독성과 유해 폐기물; 그것은 관리와 함께 작동 한다 고 유해 폐기물 용기에 폐기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 원 복구
	<ol>
<li>구 연산 염 버퍼의 200 mL와 함께 다른 슬라이드 컨테이너를 작성.</li>
		<li>컨테이너에 슬라이드를 전송 합니다. 압력 밥 솥 요리 10 분에 대 한 높은 압력 모드에서 슬라이드를 슬라이드와 함께 컨테이너를 전송 합니다.</li>
		<li>배수 물 10 분 전송에 대 한 모든 슬라이드 PBST (200 mL)와 새로운 컨테이너와 컨테이너를 쿨, 3 x 5 분 이상에 대 한 PBST와 슬라이드를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차단
	<ol>
<li>슬라이드의 건조를 피하기 위해 습 한 환경을 만들기 위해 슬라이드를 잡고 트레이를 물에 젖은 kimwipes를 추가 합니다.</li>
		<li>트레이, 다시 슬라이드를 이동 하 고 각 슬라이드에 솔루션 차단의 200 µ L를 추가 합니다. 모자와 함께 트레이 커버 하 고 30 분 동안 개발 차단 하자. 참고: Pax7 항 체는 마우스 단일 클론 항 체 때문에 마우스 IgG 마우스 근육 조직에 높은 백그라운드를 만드는의 불특정 바인딩. AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L)를 사용 하 여 마우스에 마우스 난다 바인딩을 차단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차 항 체를 적용 합니다.
	<ol>
<li>슬라이드 슬라이드 컨테이너에서 한 번 PBST와 린스. 그런 다음 다시 얼룩 트레이 슬라이드를 이동 합니다.</li>
		<li>각 슬라이드에 1 차적인 항 체 혼합의 200 µ L을 적용 하 고 모자, 트레이 커버 개발 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서 반응 하 게. 참고: 4 ° C에서 하룻밤 반응 비록 만족 스러운 결과 제공 실 온에서 반응 개발 최상의 결과 제공 합니다. Myosin MF20 항 체 트리플 (Pax7, Laminin MF20) 라벨 수행 믹스에 추가할 수 있습니다. MF20 얼룩 분화 근육 섬유. 이 단계는 또한 PBST-B-g을 줄이기 위해 다음 단계에서 2 차 항 체 (염소 항 체)에서 잠재적인 난다 바인딩 다른 차단 단계 역할을 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 차 항 체를 적용 합니다.
	<ol>
<li>실 온에서 PBST와 함께 1 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.</li>
		<li>각 슬라이드에 이차 항 체 혼합의 200 µ L을 추가 하 고 허용 하는 적어도 1 시간에 대 한 실 온에서 개발 하는 반응. 참고: Pax7 + Laminin에 대 한 사용 하 여 염소 반대로 마우스 IgG1 알 렉 사 488와 염소 안티 토끼 알 렉 사 555. Pax7 + Laminin + MF20, 염소 반대로 마우스 IgG2b 알 렉 사 647 믹스에 추가.</li>
		<li>PBST와 2 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 카운터 얼룩 및 장착
	<ol>
<li>PBST 슬라이드 컨테이너, 예를 들어, PBST의 200 mL에 DAPI의 10 µ L에에서 DAPI (1:20, 000)를 희석.</li>
		<li>슬라이드 3 분 DAPI 컨테이너에 얼룩.</li>
		<li>PBST와 DAPI 적어도 5 x 5 분 동안 세척 한다.</li>
		<li>설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 합니다. Coverslips와 함께 슬라이드 커버. 주의: DAPI는 유독 하 고 위험한; 그것은 신중 하 게 처리 해야 한다 고 유해 폐기물 병에서 삭제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 형광 현미경 검사 법
참고: immunofluorescent 얼룩 프로토콜 위에 보고는 넓은 필드 형광 또는 confocal 현미경으로 SCs 시각화를 수 있습니다. 그것은 처음 SCs를 식별 하는 도전 수 있습니다. 도움이 될 수 있는 몇 가지 권장 되는 단계는 여기 있다.
<ol><li>DAPI 채널 및 낮은 배율 목표를 사용 하 여 슬라이드에 대 한 섹션을 시각화.</li>
	<li>높은 낮은 배율을 전환 합니다. 관찰 하기 위해 SCs, 적어도 20 X 목적은 필요)입니다.</li>
	<li>488 (FITC)에 대 한 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 / 555 (Rhodamine) Pax7 Laminin를 모두 관찰 하는 SCs를 식별 하는 동시에 신호. 이 설정에서 Pax7 얼룩의 신호는 배경 잡음을 더 나은 대비.</li>
	<li>신속 하 게 제대로 식별 SCs DAPI FITC에서 채널 대체. 모든 SCs Pax7/DAPI 양성 해야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle.">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li><li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis.">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li><li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+insect+eye+to+vertebrate+muscle:+redeployment+of+a+regulatory+network.">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li><li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity.">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential.">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li><li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+the+engines+of+muscle+repair.">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li><li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration:+therapeutic+potential+and+roadblocks.">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Giordani, L., Puri, P. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence:+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts.">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li><li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements.">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

위의 프로토콜 Pax7/MF20 zebrafish 골격 근육12얼룩의 방법에 근거 했다. 사용 하 고 단계 차단 솔루션은 동일 하거나 유사한. 사용 하는 항 체는 동일 합니다. 조정된 단계 마우스 근육 조직과 SCs의 기능에 근거 했다. 첫째, 항 체 Laminin 시각화 하 고 SCs의 위치를 확인할 수 있도록 믹스에 추가 되었습니다. 그것은 특히 도움이 488/555;의 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 현미경 SCs의 수를 계?...

골격 근육 multinucleated 근육 세포의 구성, myotubes 이라고, myofibers, 힘 및 수 축을 통해 움직임을 생성 하는 구성. Craniofacial 일부 근육을 제외 하면 대부분 골격 근육 somite1라고 하는 임시 미 발달 구조에서 파생 됩니다. 조직적 전조 세포 상피 somite myoblasts 될에서 delaminate. 더 Myoblasts myocytes 멀티 nucleated myofibers를 myotubes 될 융합으로 구분 합니다. 위의 과정은 myogenesis 이라고 불리고 일시적으로 통제 제어 유전자 발현의 특징 이다. 조직적 선구자 표현할 Pax3 Pax7, 반면 myoblasts 익스프레스 MyoD 또는 Myf5 myocytes 익스프레스 myogenin myosins2,3. 근육 성장 있는 myofibers 될 큰 근육 섬유 크기 (비 대)4증가 기존 섬유 (증식)에 더 많은 myonuclei를 통합 하는 프로세스입니다. 근육 성장, 동안 줄기 세포 속성을 차별화 하 고 자기 갱신 수에 있는 조직적 셀의 지속 가능한 소스가입니다. 이 세포는 위성 세포 sarcolemma는 myofiber의 (세포 막)와 기저 lamina5사이 그들의 물리적 위치에 따라 불린다. SCs는 적극적으로 청소년 단계 (출생 후 쥐의 첫 2-3 주), 근육 성장에 기여 하지만 성인 근육6휴식에서 무부하 될. 놀랍게도, 그들은 근육에 다시 활성화 될 수 있습니다 손상 및 복구 손상 된 근육7새로운 근육 세포로 분화.
줄기 세포 속성 기본 근육 생물학 및 근육 질환8의 치료에 대 한 관련 SCs의 연구를 확인합니다. 결과적으로, 그것은 과거 십 년간에서 강렬한 수 사의 영역 되었습니다. 유전학 그리고 epigenetics SCs9,10의 해 부에 엄청난 진행이 했다. 분리 하 고 제자리에 SCs 식별에 관련 된 기술은 개발 하 고 방법11에 따라 최적화 된 했다. Immunofluorescent 얼룩 Pax7를 포함 하 여 특정 항 체를 사용 하 여 SCs의 식별 수 있습니다. 그러나, 부족 및 강한 자동-형광 성인 골격 근육 조직을 결합 하는 SCs의 작은 크기 렌더링 시각화 도전. 여기, 우리는 immunofluorescent 얼룩 프로토콜 Pax7 마우스 근육 조직에 대 한 최적화 및 zebrafish 근육12는 기존 방법에 따라 설명 합니다. 또한, 뚜렷한 fluorophore 표시 Laminin 항 체 기저 lamina는 SCs는 위치를 식별 하기 위해 채택 된다. 이 프로토콜은 지속적으로 Pax7 긍정적인 SCs와 모든 테스트 생리 적 조건 및 발달 단계에서 조직적 선구자의 시각화 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Citrate Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2&lt;sub&gt;b&lt;/sub&gt;) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG2&lt;sub&gt;b&lt;/sub&gt; cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1860 cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR wide-field fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuisinart electronic pressure cooker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies

면역 형광 검사 조직 섹션에 다른 세포 유형을 식별 하는 데 도움이 효과적인 방법입니다. 원하는 셀 인구를 공부 하기 위하여 특정 셀 표식에 대 한 항 체는 조직 섹션에 적용 됩니다. 성인 골격 근육 인공위성 세포 (SCs)는 근육 수리 및 재생에 기여 하는 줄기 세포 이다. 따라서, 그것은 시각화 하 고 다른 생리 적인 조건 하에서 위성 세포 인구를 추적 하는 것이 중요입니다. 골격 근육을 휴식, SCs 기저 lamina 및 myofiber 플라즈마 멤브레인 사이 상주 합니다. SCs는 myofibers 또는 세포 배양에서 식별 하는 데 일반적으로 사용 되 마커 Pax7 짝된 상자 단백질입니다. 이 문서에서는, 골격 근육 부분에 최적화 된 Pax7 면역 형광 검사 프로토콜은 일반적인 얼룩 및 백그라운드를 최소화 하 여. 기저 lamina의 단백질 (laminin)를 인식 하는 또 다른 항 체도 SCs 유사한 프로토콜을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 또한 더블 또는 트리플 Pax7 및 관심사의 추가적인 단백질을 위한 항 체와 라벨을 수행 하기 위해 추가 되었다.

위의 단계에 따라 SCs 성공적으로 성인 휴식 근육 섹션 형광 현미경 (그림 1)의 밑에 구상 될 수 있다. 비록 성인 근육 조직 섬유의 특정 유형에 서 강한 자동 형광 있다, 밝은 알 렉 사 시리즈 염료 배경 잡음을 극복할 수와 신호 밖으로 서 (그림 1A, B, 화살표 머리). 두 광자 공초점 현미경 넓은 분야 형광 현미경 (<strong...

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Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

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Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K 조회수.  National Institutes of Health. 위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.

비디오: Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

유전학

Satellite Cell from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis (마우스 사지 근육에서 위성 세포 분리 및 유세포 분석)

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

저자 스포트라이트: 마우스 근육 줄기 세포의 Cistrome 분석 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&amp;RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

생물학

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

요약

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이 비디오의 챕터

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비