Name: high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
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이 일 병 리의 부, J.C.S.B.에 유타 대학에서 시작 그랜트에 의해 지원 되었다

1. 식별 오버랩2 방법 (O2M)에 의해 화학 유전학 Dataset에서 시너지 예측 돌연변이
참고: 이것은 시너지 예측 돌연변이 니콜스 외에서 게시 된 데이터 집합을 사용 하 여 식별 하기 위한 방법입니다. 대장균에서 17 . 그러나,이 모든 화학 유전학 dataset 및 미생물에 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터 세트의 녹아웃 돌연변이 100 개 이상의 작은 분자의 성장 각 작은 분자에 각 돌연변이 대 한 양적 성장 점수를 주는 라이브러리 포함 되어 있습니다. 1 개의 상승 쌍을 알고 있어야 합니다, 그리고 성장 점수는 데이터 집합에 포함 된 두 작은 분자에 대 한 되어야 합니다.
<ol><li>
모든 돌연변이 각 작은 분자의 단일 농도의 성장에 대 한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산 합니다. 참고:이 수행할 수 있는 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여. 브라운 실험실을 사용 하 여 Excel 기능 =AVERAGE(B3:B3981)와 작은 분자의 열 각의 계산에 대 한 =STDEV(B3:B3981).<ol>
<li>다른 데이터 집합을 사용 하는 경우이 방향이 다를 수 있지만 의미 및 작은 분자의 각 열에서 표준 편차를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>니콜스 외에서 동일한 데이터 집합을 사용 하 여 작은 분자의 각 농도 대 한 Z 점수를 계산 합니다. 스프레드시트 프로그램에서 17 . 이 대 한 음수 z 점수 Z(2.5) 것 = 의미-2.5 * 표준 편차, 그리고 긍정적인 z 점수 Z(2.5) 것 = 평균 + 2.5 * 표준 편차.</li>
	<li>어떤 유전자 돌연변이 포함 되 고 확실 하 게 그 분자의 모든 농도에서 알려진된 시너지 쌍을 구성 하는 작은 분자의 중요 한 Z 점수를 결정 합니다. 음수 Z (2.5) 보다는 작은 성장 돌연변이의 점수는 점수 또는 그 작은 분자에 대 한 긍정적인 Z (2.5) 점수 보다 큰, 그것은 중요 한 간주 됩니다.</li>
	<li>중요 한 유전자 돌연변이의 한 오 페론에 속하는 경우 결정 합니다. 참고: 대장균, 저자 추천 "Ecoli 위 키" 정보에 대 한 검사에 관한 유전자는 polycistronic RNA의 일환으로 복사할 경우.</li>
	<li>다른 농도 작은 분자의 대부분에 공통 된 유전자/오 페론 돌연변이 식별 (예. 항생제 trimethoprim와 synergize 분자 식별 표시 중요 한 Z 돌연변이 찾고 때, 점수 trimethoprim와 sulfamethizole 또는 sulfamethoxazole와 같은 알려진된 시너지 파트너의 성장 하는 때). 이들은 상 상속 시너지 예측 돌연변이입니다.</li>
</ol>2. 예측 O2M에 의해 화학 유전학 데이터 집합 내에서 Synergizers
<ol><li>데이터 집합17되돌립니다 시너지 예측 돌연변이에서 상당한 성장 점수를 elicits 작은 분자의 각 농도 식별 합니다. 이것은 작은 분자의 각 농도 대 한 계산 된 Z 점수 보고에 의해 이루어집니다. 다시 말하지만, 상당한 성장 점수는 부정적인 Z 점수 보다 보다 작거나 작은 분자의 그 농도 대 한 긍정적인 Z 점수입니다. 참고: 분자의 농도 중도에 나타납니다, 분자 예측된 synergizer를 간주 됩니다. 중요 한 성장 점수를 유도 하지 않는 어떤 분자 예측된 비-synergizer입니다.</li>
</ol>3입니다. 예측된 시너지 상호 작용의 유효성 검사
<ol><li>예측 된 synergizers의 최소 억제 농도 (MIC)를 찾는.
	<ol>
<li>37 ° c.에 M9 최소한의 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장 참고: 모든 숙박 문화 관심의 유기 체에 대 한 적절 하 게 정의 된 매체에서 자란 수 있습니다. 브라운 실험실 파운드 또는 YPD 같은 리치 미디어를 권장 하지 않습니다. M9 최소한의 미디어 10.5 g/L M9 국물, 0.2 %casamino 산, 0.1 m M CaCl2, 0.4% 포도 당, 1 M MgSO4, 0.25% 니코틴산 산, 및 이루어져 H2o. 티 아민 0.33%</li>
		<li>마이크 데이터의 병원 체 작은 분자를 받으면 문학에서 발견 분해 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 높은 농도에서 하는 경우 (> 10 mg/mL).</li>
		<li>96 잘 접시를 사용 하 여 각 우물에 M9 미디어의 100 µ L를 추가 합니다. 그래서 200 µ L의 총 포함 열 1에서에서 M9 미디어의 추가 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>열 1에에서 집중 된 작은 분자 솔루션의 임의의 금액 (~ 10 µ L)를 추가 합니다. 열 1 (접시 당 8 작은 분자)의 당 하나의 작은 분자. 참고: 이들은 synergize 것으로 예측 하는 관심, 작은 분자입니다. 갈색 연구소는 일반적으로 대장균을 억제할 수 있는 100 %DMSO 금액은 매우 집중된 작은 분자 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>일단 작은 분자를 추가 접시의 x 축에 걸쳐 작은 분자를 희석. 열 1에서에서 솔루션의 100 µ L를가지고, 열 2에에서 놓고 혼합 합니다. 열 2에서에서 100 µ L를 받아 3 열에 놓고 혼합 합니다. 100 µ L 11 열에 배치 됩니다 때까지이 과정을 계속 합니다. 열 11 섞으십시오, 그렇다면 해당 열에서 100 µ L 고 버리고. 데이터 정규화를 그냥 미디어에 열 12 두고.</li>
		<li>접시 접종 야간 문화에서 광학 밀도를 (OD600)를 가져옵니다. 문화와 OD600 0.002의 M9 미디어 솔루션 준비 (또는 적절 한 농도의 원하는 유기 체에 대 한 500 세포 / µ L를 나타내는). 그래서 잘 당 1000 셀 문화 솔루션의 2 µ L 플레이트의 각 음에 플라스틱.</li>
		<li>부드럽게 접시를 흔들어 하 고 읽고 0 h의 OD600 . 37 ° C 24 h. 얻기 읽기 24 h에 대 한 OD600 에서 성장 플레이트를 하자. 참고: 적절 한 사용 조건 다른 유기 체에 대 한 관심의 증가.</li>
		<li>잘 사용 하 여 각 스프레드시트 프로그램에 대 한 net 성장을 계산 합니다.</li>
		<li>평균 평균 약 성장이를 열 12의 순 성장. 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 마약 성장이의 평균에 다른 우물을 정상화. 10% 미만으로 어떤 잘 봐는 MIC90를 식별 하는 성장. 어떤 50% 미만으로 잘 성장은 MIC50를 나타냅니다. 그 우물에 작은 분자의 농도 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>공동 성 상호 작용에 대 한 분석 실험 바둑판
	<ol>
<li>앞으로 M9 최소한의 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장. 참고: 적절 한 사용 조건 다른 유기 체에 대 한 성장.</li>
		<li>96 잘 접시 및 열 1에에서는 여분의 100 µ L의 각 음에 M9 미디어의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>추가 테스트 작은 분자 (~ 8 마이크 x) 각 열 1에서에서 잘 하 고 두 배 농도 추가 (~ 16 마이크 x) 잘 a 1를 (접시 당 1 개의 작은 분자 테스트). 참고:이 금액에서 마이크 테스트 완료 사전 결정 되 고 각 잠재적인 synergizer에 대 한 다릅니다.</li>
		<li>열 1에서에서 100 µ L를 복용 하 고 열 2 전송 하 여 x 축에 그라데이션 희석을 만듭니다. 100 µ L 열 11에 추가 될 때까지이 과정을 계속 합니다. 혼합, 그렇다면 열 11에서에서 100 µ L 고 처분. 열 12 (그림 1A)에 어떤 약물을 추가 하지 마십시오.</li>
		<li>입력된 약물에 대 한 y를 통해 두 번째 약물 그라디언트를 설정 합니다. 추가 행 A. 혼합 입력된 분자의 마이크와 행 A와 B. 계속 100 µ L 행 G. 믹스에에서 배치 될 때까지 배치에서 앞으로 희석, 100 µ L x 2를 포함 하는 미디어의 100 µ L, 100 µ L 고, 보장 하지 행 헤에에서 어떤 입력된 약물을 추가 하려면 행 높이 및 열 (그림 1B) 테스트 마약 쌍의 개별 마이크 포함 12 수 있습니다.</li>
		<li>접시 접종 각 잘 (당 잘 1000 셀)를 세600 0.002의 대장균 문화의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>OD600 0 h 읽기에 대 한 접시에 각의 측정.</li>
		<li>37 ° c.에 24 h에 대 한 접시를 품 어</li>
		<li>OD600 24 h의 각을 측정 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>닦아내기에서 소수 억제 농도 인덱스 (FICI)을 계산
	<ol>
<li>접시의 각 잘 순 성장 OD600 스프레드시트 프로그램에서 24 시간에 0 h에서 OD600 을 빼서 계산 합니다.</li>
		<li>더 작은 분자를 포함 각 잘에 의해 잘 H12 나누어 소프트웨어에 성장을 표준화 됩니다.</li>
		<li>열 12 입력된 분자의 MIC90 및 잠재적인 의존적인 행 H. MIC90</li>
		<li>90%의 성장 억제 하는 모든 우물을 찾습니다.</li>
		<li>물론 그 중 하나는 낮은 (시너지) 아래에 대 한 FICI90를 계산 또는 (대립) 위의 높은 방정식을 사용 하 여 두 MIC90 값: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>어떤 FICI ≤ 0.5로 시너지 고려 및 FICI ≥ 4 대립 (그림 2). 참고:이 또한 행 해질 수 있다 MIC50와 (성장의 50% 저해) MIC 값에 기반 하는 FICI50를 얻을.</li>
	</ol></li>
	<li>블 리스 독립 분석 결과 참고: 블 리스 독립 자체에 마이크 하지 않은 어떤 잠재적인 의존적인 함께 실행 됩니다.<ol>
<li>이전 처럼 37 ° C에서 M9 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장. 참고: 다시, 관심의 다른 유기 체에 대 한 적절 한 성장 조건 사용할 수 있습니다이 단계에서.</li>
		<li>잠재적인 시너지 분자, 입력된 분자, 조합, 및 치료 비 제어를 테스트 하기 위해 96 잘 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>각 우물에 M9 미디어의 50 µ L을 추가 하 여 잠재적인 의존적인 접시를 만듭니다. 행의 각 음에 잠재적인 synergist의 설정된 농도 (10 µ M 또는 100 µ M)를 포함 하는 미디어의 50 µ L를 추가 합니다. 접시 당 8 분자를 테스트 합니다.</li>
		<li>각 우물에 미디어의 50 µ L을 추가 하 여 입력된 분자 접시를 만듭니다. 50 µ L 4 x 포함 된 추가 열 1에 있는 각 음을 입력된 약물의 마이크. X 축 따라 그라데이션 희석 마이크 번호판, 열 1에서에서 50 µ L를 복용, 분산 및 혼합 열 2에서에서 비슷한 만듭니다. 열, 12 열 12에서에서 50 µ L를 폐기 때까지이 과정을 계속 합니다. 추가할 미디어의 추가 50 µ L 각 잘 각 잘 끝 총 100 µ L 이므로.</li>
		<li>96 잘 접시를 사용 하 여 조합 접시 만들기, 각 잘을 미디어의 50 µ L를 추가 합니다. 50 µ L 4 x 포함 된 추가 열 1에 있는 각 음을 입력된 약물의 마이크. 마이크 번호판, 열 1에서에서 50 µ L를 복용, 분산 및 혼합 열 2에서에서 비슷한 x 축을 따라 희석. 이 열, 12 열 12에서에서 50 µ L를 처분 하는 길 내내 계속 합니다. 50 µ L 10 µ M 또는 100 µ M는 행의 각 음에 잠재적인 의존적인 포함 된 미디어를 추가 합니다. 또, 하나의 농도 또는 행 당 약 이어야 한다.</li>
		<li>접시의 모든 우물을 M9 미디어의 100 µ L을 추가 하 여 처리 되지 않은 컨트롤을 만듭니다.</li>
		<li>앞으로 각 잘 하 0.002 또는 1000 셀의 OD600 와 세균성 문화 2 µ L을 추가 하 여 모든 접시를 예방.</li>
		<li>0과 24 시간에서 각의 OD600 을 측정 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>블 리스 독립 점수 계산
	<ol>
<li>접시의 각 잘 순 성장 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여 24 시간에 성장에서 0 h에서 OD600 을 빼서 계산 합니다.</li>
		<li>스프레드시트 프로그램에서 아무 약물 접시에서 평균 성장에 우물을 정상화.</li>
		<li>스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 빼면 1에서 net 성장 저해를 계산 합니다.</li>
		<li>평균만 입력된 그라데이션 스프레드시트 소프트웨어에 포함 된 컨트롤 플레이트에 열.</li>
		<li>방정식으로 각 잘 행복 점수 계산: 행복 점수 = (잘 X + 입력된 열 X) -잘 X 결합
</li>
		<li>웰 스는 입력의 MIC90 아래에 부정적인 점수에 대 한 보세요. 참고: 여러 농도 걸쳐 부정적인 점수는 공동 성 상호 작용을 나타내는 것 이다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 높은 처리량 화면 시너지 예측 돌연변이 소설 시너지 쌍을 확인 하려면
<ol><li>
시너지 예측 돌연변이 확인 참고: 단계 1.5 putative 시너지 예측 돌연변이 확인. 여기, 우리는 이러한 돌연변이의 시너지 약물에 대 한 높은 처리 화면에서 최고의 작동 합니다 결정 합니다. 우리 Bioscreen 기계에서이 분석 결과 수행 하지만 96 잘 접시 독자 또한 허용 해야 한다.<ol>
<li>각 상 상속 시너지 예측 돌연변이 야생-타입 셀 M9 최소한의 미디어에 있는 성장.</li>
		<li>100 설정 잘 플레이트 (또는 96 잘 접시) 적절 한 성장 매체, 성장 매체 + 입력된 마약, 성장 매체 + 입력된 마약, 그리고 성장 매체 + 알려진된 비 시너지 약물의 알려진된 시너지 파트너에 벌집. 차량 컨트롤을 포함 하도록 확인 하십시오. 참고: 4 각 스트레인/마약/농도 대 한 웰 스 복제 것이 좋습니다.</li>
		<li>잘, 빈 제어 웰 스를 포함 하 여 당 1000 셀 접종</li>
		<li>떨고와 37 ° C에서 48 h를 성장 하 고 읽고 OD600 매 20 분.</li>
		<li>가장 큰 성장 사이의 차이 보여줍니다 야생-타입 및 시너지 예측 입력된 약물 및 알려진된 시너지 파트너의 존재 돌연변이 세포 약물 농도 시간 포인트를 결정 합니다. 최적의 시간 포인트와 농도, 거기 해서는 안됩니다 많은 성장 차이 야생-타입 및 시너지 예측 돌연변이 세포 입력된 약물 (그림 3)와 함께 공동 성으로 행동 하지 알려진 약물의 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시너지 약물에 대 한 높은 처리 화면
	<ol>
<li>야생-타입 세포와 M9 최소한의 미디어에서 시너지 예측 돌연변이 세포 성장. 참고: 적절 한 성장 매체를 사용 하 여 관심의 유기 체에 대 한.</li>
		<li>라이브러리에서 미디어 그래서 각 100 µ L 미디어는 이전 단계에서 확인은 설정된 농도에 작은 분자를 포함 하는 잘 된 약물을 추가 합니다. (셀) 없이 빈 우물과 우물 차량 컨트롤 포함 (e.g., DMSO) 약물 희석 차량 어떤 성장 저해에 대 한 계정.<ol>
<li>접시, 이상적으로 흩어져 있는 잘 위치 효과 대 한 계정에 접시 당 적어도 4 개의 차량 제어 웰 스를 준비 합니다. 분석은 변수, 다음 행/열 당 잘 하나 이상 차량 제어를 포함 하 고 뿐만 아니라 컨트롤 각 행/열 제어를 사용 하 여 각 행/열 대신 전체 접시 (단계 4.2.5)에 대 한 Z 점수를 계산 하.</li>
		</ol>
</li>
		<li>앞으로 각 잘에 문화의 2 µ L를 추가 합니다. (야생 타입 박테리아와 예측된 시너지 돌연변이 박테리아에 대 한 하나의 플레이트 한 격판덮개).</li>
		<li>C. neoformans에 대 한 0과 18 h 대장균 또는 48 h에 OD600 을 평가 합니다.</li>
		<li>스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 차량 제어 우물에서 빈 우물의 OD600 빼서 그물 성장 계산. Z-점수가-2.5의 웰 스를 식별 (Z 점수 = 평균-2.5 * 표준 편차). 이 우물에는 잠재적인 의존적인 작은 분자 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>3 단계에서 설명한 방법을 사용 하 여 화면 안타를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Hsp90+Genetic+Interaction+Network+in+Candida+albicans+Reveals+Environmental+Contingency+and+Rewired+Circuitry.">Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry.</a> PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).</li><li>Robbins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Antifungal+Combination+Matrix+Identifies+a+Rich+Pool+of+Adjuvant+Molecules+that+Enhance+Drug+Activity+Against+Diverse+Fungal+Pathogens.">An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens.</a> Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).</li><li>Wildenhain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Synergism+from+Chemical-Genetic+Interactions+by+Machine+Learning.">Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning.</a> Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).</li><li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole.">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

시너지 작은 분자 쌍 미생물 감염을 치료에 강력한 도구가 될 수 있습니다 아직 시너지 쌍을 식별 하는 도전 때문에 그들은 그들의 전체 임상 잠재력을 도달 하지 않은. 이 문서에서는 간단한 없음을 조합 보다 훨씬 빠르게 상승 쌍을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 화학 유전학 데이터 집합을 사용 하 여 O2M 다음 시너지 쌍을 예측 하기 위해서는 화면 큰 라이브러리 작은 분자의 판독으로 사용 될 ?...

항생제 내성 박테리아 발생할 2 백만 이상의 감염과 23000 죽음 매년 CDC1에 따르면 미국에서. 새로운 치료는 이러한 감염을 극복 하기 위해 필요 하다. 이러한 새로운 치료를 식별 하는 전략에는 새로운 항균 약물의 개발 이나 작은 분자 치료 미생물 감염2,,34다른 조건에 대 한 승인의 재사용 포함 됩니다. 그러나, 새로운 약물의 발견은 매우 비싸고 시간이 많이 소요. 마약을 재사용 소설 마약을 식별할 수 있습니다 또는 약물 대상5,6. 우리의 실험실 시너지 조합 치료로 알려진 세 번째 전략에 초점을 맞추고. 시너지 조합 두 작은 분자는 함께 그들의 개별 신진대사7의 첨가제 효과 보다는 효능을가지고 하는 경우 발생 합니다. 또한, 시너지 조합 큰 잠재적인8,9, 렌더링 덜 원치 않는 오프 대상 효과 이외 쌍에 있는 작은 분자 중에 병원 체 저항에 대 한 효과가 될 수 있습니다. 10.
시너지 쌍 드물다, 약물 조합11,,1213의 약 4-10%에서 발생. 따라서, 인덱스도 스크린 등 전통적인 기술 도전과 백 분자의 작은 도서관에서 잠재적인 조합의 수천 시간이 있습니다. 또한, 공동 성 상호 작용 일반적으로 예측할 수 없습니다 화합물14의 활동에서. 그러나, 저자 오버랩2 방법 (O2M)12라는 시너지 쌍에 대 한 화면에 대 한 높은 처리 접근을 개발 했다. 여기서 설명 하는이 방법을 이러한 시너지 쌍의 빠르고, 보다 효율적인 식별 수 있습니다. O2M 알려진된 시너지 쌍 및 화학 유전학 데이터 집합 사용을 해야합니다. 녹아웃 돌연변이의 도서관은 많은 다른 작은 분자의 성장 하는 때 화학 유전학 데이터 집합 생성 됩니다. 그 같은 돌연변이에서 표현 형을 elicits 다른 작은 분자 알려진의 각 멤버와 또한 synergize 해야 경우 알려진된 시너지 쌍에서 한 분자 두 번째 시너지 분자 처럼 특정 녹아웃 돌연변이에서 동일한 표현 형을 유도, 시너지 쌍입니다. 이 근거 시너지 항생제 쌍 대장균 (대장균) 에 대 한 활성 및 병원 성 균 류 Cryptococcus neoformans (c.에 대 한 활성 시너지 항진균 약물 쌍을 식별 하는 갈색 실험실에서 사용 되었습니다. neoformans)11,12. O2M만 다양 한 병원 균에 대 한 적응력은 하지만 쉽고 빠르게 상승 쌍을 확인 하려면 분자의 큰 도서관의 심사에 대 한 수 있습니다. O2M 식별 유전자 돌연변이와 심사 시너지에 대 한 예측만 그 작은 분자를 확인 하기 위해 수 있습니다. 따라서, 쌍 2000 분자 라이브러리를 테스트 걸릴 것 이라고 개월, 반면에 있던 경우에 20 분자 synergize 것으로 예측 하는 해당 라이브러리에서 일의 문제가 걸립니다 지금은 시너지에 대 한 테스트. O2M 프로그래밍 기술, 필요 하지 않습니다 이며 필요한 장비 대부분 연구소 나 핵심 시설에서 사용할 수 있습니다. 연구팀은 약물 조합에 관심이, 뿐만 아니라 O2M 분석 약 화면을 완료 하 고 중요 한 약물-약물 상호 작용을 식별 하 여 그들의 명 중을 확장 하 고 싶어 누가 누구에 게 관심입니다. 아래는 박테리아, 시너지 작은 분자 식별로 잘 알려진 분석15,16예측된 공동 성 상호 작용을 확인 프로토콜이입니다.

<table><tbody><tr><td>Bioscreen C</td><td>instrument</td><td>Growth Curves USA</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1</td><td>instrument</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9 broth</td><td>reagent</td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>Casamino Acids</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>reagent</td><td>Sigma</td><td>G7021-10KG</td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>reagent</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>Thiamine</td><td>reagent</td><td>Acros Organics</td><td>148991000</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Dihydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;Heptahydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td></tr><tr><td>chemical-genetics dataset</td><td>dataset</td><td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td><td></td></tr><tr><td>trimethoprim (example input drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15671125</td></tr></tbody></table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

항균 약물 극적으로 증가 수명과 삶의 질20 세기에서 비록 항균 성 저항 조직의 감염을 치료 하는 우리의 전체 사회 능력을 위협 한다. 년 및 비용 추가 건강에 약 20 십억 달러는 미국에서 혼자, 항생제 내성 감염 약 23000 명 죽 일. 항균 성 저항에 대처 하기 위해 한 가지 방법은 조합 치료, 감염의 중요 한 초기 단계에 특히 유용 하다 전에 감염 유기 체와 약물 저항 프로필 확인 되었습니다입니다. 많은 항균 성 치료는 조합 치료를 사용합니다. 그러나,이 조합은 대부분의 첨가물, 결합 된 효능은 개별 항생제 효능의 합계와 같은 의미. 일부 조합 치료는 시너지: 결합 된 효능 첨가제 보다 훨씬 큽니다. 때문에 그들은 항균 약물 저항 종자의 성장을 억제할 수 있는 시너지 조합은 특히 유용 합니다. 그러나, 이러한 조합은 희귀 하 고 식별 하기 어려운 있습니다. 이것은 없음을 방식으로 테스트 하는 데 필요한 분자의 완전 한 숫자 때문 이다: 1000 분자의 도서관은 1 백만 잠재적인 조합. 따라서, 시너지 효과 대 한 분자를 예측 하기 위해 노력 되었습니다. 이 문서에서는 중복2 방법 (O2M)로 알려진 시너지 작은 분자 쌍을 예측에 대 한 우리의 높은 처리량 방법. O2M 화학 유전자 데이터 집합에서 사용 하 여 과민 시너지 쌍에서 각 분자를 하지만 다른 분자는 돌연변이 식별. 브라운 실험실 돌연변이 하지 야생-타입 세포의 성장을 억제 하는 분자에 대 한 높은 처리 화면을 수행 하 여이 성장 차이 이용 한다. 실험실의 작업은 이전 항생제 trimethoprim와이 전략을 사용 하 여 항진균 약물 fluconazole synergize 분자 식별. 여기, 저자 여러 미생물에 대 한 변경 될 수 있습니다 새로운 시너지 조합에 대 한 화면을 방법 제시.

바둑판 분석 실험은 공동 성 상호 작용을 측정 하기 위한 반 정량 방법. 최종 점수 출력, FICI, 결정 약물 조합 시너지 (FICI ≤0.5)으로 간주 됩니다, 만약 비-상호 작용 (0.5 < FICI < 4), 또는 대립 (FICI ≥4.0). 그림 1 에 바둑판 분석 결과에서 마약 그라디언트를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 일반적인 결과를 보여 줍니다...

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K 조회수.  University of Utah. 시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

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Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

연구

암 연구학

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of both synthetic lethal interactors leads to loss of cell viability or cell death. The best studied synthetic lethal interaction is between BRCA1/2 and PARP1, with PARP1 inhibitors being used in clinical practice to treat patients with BRCA1/2 mutated tumors. Large genetic screens in model organisms but also in haploid human cell lines have led to the identification of numerous additional synthetic lethal interaction pairs, all being potential targets of interest in the development of novel tumor therapies. One approach is to therapeutically target genes with a synthetic lethal interactor that is mutated or significantly downregulated in the tumor of interest. A second approach is to formulate drug combinations addressing synthetic lethal interactions. In this article, we outline a data integration workflow to evaluate and identify drug combinations targeting synthetic lethal interactions. We make use of available datasets on synthetic lethal interaction pairs, homology mapping resources, drug-target links from dedicated databases, as well as information on drugs being investigated in clinical trials in the disease area of interest. We further highlight key findings of two recent studies of our group on drug combination assessment in the context of ovarian and breast cancer.

Large genetic screens in model organisms have led to the identification of negative genetic interactions. Here, we describe a data integration workflow using data from genetic screens in model organisms to delineate drug combinations targeting synthetic lethal interactions in cancer.

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in glioblastoma (GBM), the most prevalent and devastating primary brain tumor. The presence of GSCs makes the GBM very refractory to most of individual targeted agents, so high-throughput screening methods are required to identify potential effective combination therapeutics. The protocol describes a simple workflow to enable rapid screening for potential combination therapy with synergistic interaction. The general steps of this workflow consist of establishing luciferase-tagged GSCs, preparing matrigel coated plates, combination drug screening, analyzing, and validating the results.

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens are performed on cells grown in a monolayer. However, these two-dimensional (2D) models are considered less accurate compared to three-dimensional (3D) spheroid cell models; this is especially true for glioma stem cell lines. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening of spheroid lines; mouse and human glioma stem cell lines are used as an example. This protocol describes a 3D spheroid drug sensitivity and synergy assay that can be used to determine if a drug or drug combination induces cell death and if two drugs synergize. Glioma stem cell lines are&#160;modified to express RFP. Cells are plated in low attachment round well bottom 96 plates, and spheres are allowed to form overnight. Drugs are added, and the growth is monitored by measuring the RFP signal over time using the Incucyte live imaging system,&#160;a fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator. Half maximal inhibitory concentration (IC50), median lethal dose (LD50), and synergy score are subsequently calculated to evaluate sensitivities to drugs alone or in combination. The three-dimensional nature of this assay&#160;provides a more accurate reflection of tumor growth, behavior, and drug sensitivities in vivo, thus forming the basis for further preclinical investigation.

In vitro drug sensitivity screens are important tools for discovering anti-cancer drug combinations. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening for spheroid lines.

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

면역학 및 감염병학

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The goal of computational methods for drug repurposing is to enable solutions for safer, cheaper and faster drug discovery. Towards this end, we developed a novel method that integrates genetic and clinical phenotype data from large-scale GWAS and PheWAS studies with detailed drug information on the concept of transitive Drug-Gene-Disease triads. We created "RE:fine Drugs," a freely available, interactive dashboard that automates gene, disease and drug-based searches to identify drug repurposing candidates. This web-based tool supports a user-friendly interface that includes an array of advanced search and export options. Results can be prioritized in a variety of ways, including but not limited to, biomedical literature support, strength and statistical significance of GWAS and/or PheWAS associations, disease indications and molecular drug targets. Here we provide a protocol that illustrates the functionalities available in the "RE:fine Drugs" system and explores the different advanced options through a case study.

Here we describe a protocol using the web-based drug repurposing hypothesis generation tool: "RE:fine Drugs." This protocol can be modified to a user's preferences at the level of the query type (gene, drug or disease) and/or the range of available advanced options.

은 &quot;RE를 : 좋은 약&quot;을 사용하여 의약품 용도 변경 가설 발전 시스템

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

의학

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

생물학

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

오버랩² 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

요약

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