우리는 물 샘플의 분석에 대 한 감사는 UAntwerpen와는 시간적의 작물 보호 학과의 구체 그룹에. 이 프로젝트 중 지원 우수 센터에 의해 제공 된 ' 환경 및 사회 진화 역학 (PF/10/007) 구 루벤 연구 기금. AFG (11Q0516N) 및 ESJT (FWO-SB151323)로 박사 투자 했다 고 FWO 플랑드르 (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek)에서 박사 후 연구원으로 TP (12F0716N).

여기에 설명 된 모든 방법은 KULeuven의 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 화 명 furzeri 의 일반 유지 보수
<ol><li>준비 물고기 14 ° C의 온도에서 매체 (pH 7)와 600 µS/c m (24 ° C)의 전도도에 추가 표준화 된 소금, 정제 타입 II 물을 추가.</li>
	<li>표준화 된 조건13에서 저장 된 GRZ (Gona-토크쇼-Zhou) 연구소 라인에서 계란을 선택 합니다. (즉 해치 준비), DIII 단계에서 계란을 선택 인식할 수 있는 황금 눈9 의 그리고 부드럽게 존재에 의해 그들 핀셋의 부드러운 쌍을 전송 플라스틱 2 리터 탱크 (탱크 당 더 이상 약 30 알). 참고: 하기 위해서는 건강 한 시험 생물의 충분 한 수, 필요한 물고기 애벌레의 수로 두 번 많은 계란 해치.</li>
	<li>12 ° C에서 물고기 매체의 1 cm를 추가 하 고 물 온도 실내 온도 (24 ° C)9점차 수렴 하 게. 물고기는 처음 12 h 이내 해치 것입니다.</li>
	<li>24 시간 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemianauplii 집중된 투여 (대 한 음식의 양과 주파수에 자세히 Polačik 외. 20169번 식 프로토콜을 참조)에 의해 5 cm에 물 깊이 증가 물고기 매체 추가.</li>
	<li>36 h 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemia nauplii 의 다른 집중된 투여 하 고 물고기 매체 물 깊이 10 cm를 증가 추가 합니다.</li>
	<li>14 h:10 h에서 일정 한 온도 조건 (예: 보육, 기후 실 또는 온수 물 목욕) 물고기 컨테이너를 품 어 빛: 다크 정권.</li>
	<li>실험을 시작 하기 전에 복잡 한 물고기 컨테이너 (물고기) 노출 노출 매체의 높은 농도 함께 그들을 작성 하는 것 그것을 떠날 하 여 복합 하룻밤 실제 컨테이너에 유독의 전송을 제한 하려면 실험입니다.</li>
	<li>해칭, 후 48 h 노출 실험을 시작 하는 건강 한 부 력 애벌레를 선택 합니다. 무시 하 고 결과적으로 장애인된 부 력 그들의 수영 방광을 채우기 할 수 없었던 소위 배 슬라이더 (지속적으로 바닥에 싱크).</li>
</ol>2. 단기 노출 프로토콜
참고: 연구원 치료 당 적어도 20 복제 (별도 항아리에 20 물고기)에 대 한 목표로 한다. 용 매를 사용 하 여 화합물의 재고 솔루션을 준비 하는 경우 모든 권한 치료 뿐만 아니라 용 매 제어는 포함 되어야 합니다. 솔벤트 컨트롤 최고 노출 농도에서 용 매 농도 인 용 매의 양을 포함 해야 합니다.
<ol><li>그들 하 고 적절 한 노출 매체 (다른 toxicant 농도)와 그들을 작성 하는 것에 의해 실험 용기 (0.5 L 유리 항아리)를 준비 합니다. 정확한 농도 얻기 위해 화합물을 추가 합니다.</li>
	<li>컨테이너 (개별 모니터링에 대 한 컨테이너 당 1 물고기)에 애벌레 (48 h 후 부 화)를 개별적으로 전송 합니다. 참고: 물고기 음식과 침략에 대 한 경쟁 등 사회적 상호 작용의 잠재적인 혼란 효과 최소화 하기 위해 개별적으로 노출 됩니다. 그러나, 물고기 실험 동물 사용에 대 한 윤리 기준에 따라에서 시각적으로 상호 작용할 수 있습니다.</li>
	<li>최대 2 주 동안이 급성 노출 후속. 그 시간 동안, 물고기 먹이 광고 libitum Artemia nauplii 두 번 하루, 7 일/주를.</li>
	<li>새로 고침 매체 매일 수 질을 유지 하 고 복합 저하의 잠재적인 영향을 최소화 합니다. 주요 물 변수 모니터링 (용 존된 산소 수준 80%를 초과 한다, 전도도 해야 600 그리고 700 µS/c m, pH 7.8와 8.2, 고 경도 (CaCO3)로 사이 350와 450 mg/L, 최적의 양육 조건의 범위 내 명. furzeri 9)에 대 한. 전과 후 실제 화합물 농도 결정 하는 매체 물 샘플을 가져가 라.</li>
	<li>끝점<ol>
<li>물고기 사망, 스트레스에 대 한 확인 (예: 탈 선 행동: 거꾸로 수영) 또는 질병 매일 (아침, 저녁). Shedd 외 의 게시를 참조 하십시오 (1999) 사망률, 스트레스 또는 질병의 관찰에 대 한 내용은 12 .</li>
		<li>LC 계산 복용량 응답 곡선 (리츠와 Streibig, 2005)를 사용 하 여 다른 시간 지점에서 사망률에 따라50 값. Drm 함수를 사용 하 여 R v3.2.3 (연구 개발 핵심 팀, 2016) drc 패키지에서 또는 유사한 통계 접근.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 만성 노출 프로토콜
참고: 상태 생선/25 비뚤어진된 섹스 률의 가능성을 최소화 하 고 자연적인 원인으로 인 한 잠재적인 배경 사망률에 맞게 실험의 발병의 최소 목표 (즉. 연령 관련 사망률).
<ol><li>(참조 1) 부 화</li>
	<li>차 전 (2 일 후-16 일 후 부 화 부 화)<ol>
<li>2.1-2.4에 설명 된 대로 프로토콜을 따라</li>
		<li>실험의 두 번째 단계 동안 매체 주 (없음 다, 아래 참조)에 걸쳐 떨어집니다. 화합물의 비슷한 저하를 허용 하기 위하여 큰 불활성 용기에 1 주일에 대 한 매체의 필요한 양을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단계 II (16 일 후 부 화-끝)<ol>
<li>2 L 준비 실험 유리 항아리 complexing에 의해 그들 화합물으로. 정확한 노출 매체와 항아리와 항아리 공기에 쐬는 공기 튜브를 추가. 실험의 나머지 부분에 대 한 이러한 항아리에 개별적으로 집 물고기. 윤리 기준에 맞게 시각적 상호 작용을 허용 합니다.</li>
		<li>주 당 한 번 매체를 새로 고칩니다. 동일한 노출 매체를 포함 하는 새 항아리에 그물과 물고기를 전송. 각 농도 처리에서 화합물의 저하를 모니터링 하는 데 1 주일 동안 매일 물 샘플을 가져가 라. 각 치료 경우 여러 스트레스에 대 한 저하 곡선 테스트 (예: 다른 온도 정권에서 화합물의 독성)를 계산 합니다. 주 당 세 번 abiotic 매개 변수 (pH, 온도, 용 존 % 산소, 전도도)를 측정 합니다.</li>
		<li>2 일 후 부 화 (dph) 23 dph까지, 하루에 두 번, 주 ad libitum Artemia nauplii 당 7 일 물고기를 먹이. 24 dph-37 dph에서에서 다진된 Chironomus 애벌레와 광고 libitumArtemia 다이어트를 보완. 에 38 dph에서 두 번 하루, 7 일 주일 광고 libitum Chironomus 애벌레 냉동 물고기를 먹이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>끝점<ol>
<li>매일 물고기 사망, 스트레스 또는 질병12에 대 한 확인 합니다.</li>
		<li>결정 성장, 페 트리 접시에 생선을 전송 하 여 (9 dph-16 dph-21 dph-...) 주간 기준 본문 크기를 측정 하는 그들의 저수지에서 매체 가득 합니다. (고정된 높이)에서 4-5 위에서 물고기의 보정 크기 사진을가 고 디지털 공간 측정 프로그램 (예: ImageJ)를 사용 하 여 그들을 분석. 참고: 성인 물고기에 대 한 전체 프로세스를 측정 하는 동안 잠긴 모든 물고기를 유지 하 여 처리 스트레스를 최소화 하기 위해 높은 페 트리 접시를 사용 합니다.</li>
		<li>남성 성숙에 대 한 시각적으로 매일 15 dph 이후부터 채색에 대 한 물고기를 검사 합니다. 결혼식 채색 (2 차 성적 특성)의 첫 번째 징후에 대 한 지 느 러 미를 확인 하십시오. 이 표시 됩니다 프록시 남성 성숙으로 첫 날을 사용 합니다.</li>
		<li>커플 비 sexed 물고기 같은 치료 그룹의 남성 또는 주당 3 회 실험 비 남성 30 dph에서 이후 여성 성숙 시간 (첫 번째 계란 입금 일)을 결정 하기 위하여. 이 위해, 3.4.5에 설명 된 산란 프로토콜을 사용 합니다.</li>
		<li>통치에 대 한 몇 가지 성숙한 성숙한 남성과 여성 3 회 / 30 dph 주 이후, 그들의 처리에서 사용 하 여 횡단 계획.<ol>
<li>산란 탱크 (1 L) 기판 산란 보충 남성 수족관에서 노출 매체를 사용 하 여 각 커플에 대 한 준비 (미세 모래 < 500 µ m).</li>
			<li>산란 탱크에 남성과 여성 모두 전송 및 2 시간 동안 산란 하도록 허용. 인간의 활동 또는이 프로세스 동안 산란 컨테이너 주위 방해를 최소화 합니다.</li>
			<li>그 후, 부드럽게 물고기 다시 전송 그들의 원래 주택 컨테이너 산란 기판에 달걀을 소용돌이 물의 불필요 한 혼합 없이.</li>
			<li>500 µ m 메쉬 위에 산란 기질을 붓는 의해 계란을 필터링. 계란을 계산 하 고 그들을 전송 (사용 하 여 부드러운 핀셋) 접시9,14에서 축축한 물 이끼를.</li>
			<li>매일 죽은 계란을 제거 합니다. 후 주, 물개는 페 트리 필름 밀봉 된 접시와 온도에 저장 제어 28 ° C에서 인큐베이터와 14시 10분 h 빛: 다크 DIII 단계 (즉, 약 3 주 후 해치 준비)을 즉시 개발 주기. 장기 보관을 위해 따라 계란 휴면 단계를 입력 하 고 가능한 여러 년 남아 지속적인 암흑에서 17 ° C에 계란을 저장. 14:10 h 28 ° C 조건 실험, 휴면이 계란에서 모집 물고기 전송 휴면 계란 빛: 다크 DIII 단계로 개발 수 있도록 약 3 주에 대 한 주기.</li>
		</ol>
</li>
		<li>성인 물고기의 중요 한 열 최대 (CTmax) (15성능 측정)를 측정 합니다.<ol>
<li>0.33 ° C/min의 일정 한 속도로 열 물 목욕을 사용 하 고 물을 지속적으로 순환 됩니다. 각 개별 물고기에 대 한 몇 가지 1 L aquaria을 추가 합니다. 참고: 물 목욕에서 공간 제약을 감안할 때, 그것은 여러 시리즈에서 일 필요가 있다. 시리즈 중 조건에서 잠재적인 차이 계정에 임의의 요소로 ' 시리즈'를 포함 하 여 통계 분석을 수행할 때 취해야 한다.</li>
			<li>수족관에 물에는 물고기 (일반적으로 28 ° C)의 실험적인 양육 온도 도달 했습니다 때 수족관에 물고기를 추가 하 여 재판을 시작 합니다. 디지털 온도계 (0.1 ° C 스케일)를 사용 하 여 모든 5 분 1 L aquaria CTmax 목욕의 온도 모니터링 합니다.</li>
			<li>물고기 dorso ventrally 수직 위치를 유지 하거나 무 겁 게16,17꿈 틀 시작 때 재판을 종료. 중요 한 최대 온도 1 L 수족관에서 온도 측정 합니다. 물고기는 그것의 실험 주택 복구에 대 한 다시 전송.</li>
		</ol>
</li>
		<li>건조 모리 아 티와 무게 보트에 전송 하 여 실험의 마지막 날에는 생선의 무게 (0.1 mg 정확도)를 측정 합니다. 참고: 모든 생선 창 자에서 음식 무게 표준화에 마지막 수 유 후 4 시간 측정 한다.</li>
		<li>0.1%를 사용 하 여 물고기를 안락사 Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Transgenerational 노출 프로토콜
주: 명. furzeri에 오염 물질의 transgenerational 효과 측정 하는 1 세대에 대 한 위에서 설명한 만성 노출 프로토콜을 따릅니다.
<ol><li>매주 두 번, 28 ° C에 저장 된 생산된 계란 (즉 2 세대)의 개발 확인 14시 10분 DIII 단계에서 배아의 배양 접시를 검사 하 여 h 빛: 다크 주기 조건 (Polačik 외. 참조 20169)입니다. 각 부모의 치료의 50 개 이상의 복제 완전히 개발 되는 때, 1.1에서 프로토콜을 따르고 그들을 해치.</li>
	<li>건강 한, 잘 뜨는 물고기 정확 하 게 동일한 설치 및 부모의 물고기 치료를 노출.</li>
</ol>

<ol>
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W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+three+organic+chemicals+on+the+upper+thermal+tolerances+of+four+freshwater+fishes.">The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes.</a> Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).</li><li>Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+tolerances+of+North+American+freshwater+fishes+exposed+to+dynamic+changes+in+temperature.">Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature.</a> Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).</li><li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+bush+to+the+bench:+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology.">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biological Reviews. , (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 작품 Nothobranchius furzeri, 신흥 모델 유기 체, 개인 연구를 사용 하 여 새로운 생물을 설명 하 고 유독 다른 스트레스의 장기적인 효과 결합. 제시 프로토콜 성공적으로 유독 (구리, 카드뮴, 3, 4-dichloroaniline, 및 chlorpyrifos)의 배열에 종의 감도 측정에 적용 했다. 그것의 빠른 수명 주기 때문이 척추 모델 sublethal의 평가 대 한 허용 하 고 transgenerational 4 개월 이내 효과. 이 어류를 사용 하 여 독성 ...

전략적으로 선택한 유독 종족의 감도 프로필 유럽 도달 법안 (등록, 평가, 승인, 및 화학 물질의 제한)에 대 한 설명된1 되었습니다. 급성 또는 단기 독성 테스트 그들은 종족의 감도의 빠른 알려주지이 목적을 위해 주로 사용 했다. 그러나, 그들의 자연 환경에서 유기 체는 더 이상 기간 동안 노출 하 고 전체 수명 주기 또는 심지어 여러 세대 수 있습니다 영향을 받는2키를 누릅니다. 또한, 오염 된 환경에 있는 유기 체는 일반적으로 노출 이상의 스트레스를 한 번에, 서로 상호 작용 수 있는 시너지 효과3발생할. 따라서, 안전한 농도 계산된에 따라 급성, 단일 스트레스 독성 테스트 이용과 자연 환경에 의해 부과 된 실제 위험을 과소 평가 수 있습니다. 그것은, 그러므로, 또한 유럽 위원회4,5 와 USEPA (미국에 의해 주 창으로 환경 관련 컨텍스트에서 이용과의 sublethal 농도의 만성 및 대가족제 효과 공부 하는 것이 좋습니다. 미국 환경 보호국)6,7. 특히 척추 연구, 노동, 돈, 그리고 시간 비용에 높은 척추 동물 무척 추 동물 모형 유기 체에 비해 상대적으로 긴 수명으로 인해 만성 및 대가족제 노출 연구를 수행할 때. 따라서, 그것은 가장 적절 한 물고기 모델 유기 체, 연구 질문에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 또한, 광범위 한 척 추가 있는 종 규정 가장 민감한 종에 따라 적응 수 종에 걸쳐 응답의 보편성을 테스트 하기 위해 사용할 수 있어야. 지금, 새로운, 척추 모델 종 척추 동물7,8에 만성와 대가족제 노출 수행의 비용을 줄이고 짧은 주기가 특징으로 효율적인 프로토콜을 개발 하는 필요가 있다.
청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 는 짧은 성숙 시간과 라이프 사이클 (생성 시간 4 주9미만) 때문에 같은 장기 노출 실험에 사용 하는 재미 있는 물고기 모델입니다. 즉, 성숙 시간과 통치 등 생태 관련 끝점 다른 물고기 모델7에 비해 짧은 시간 프레임 내에서 공부 될 수 있다. 또한,이 물고기 유지 함으로써 지속적인 문화9에 대 한 필요성을 제거 하는 표준 조건 하에서 저장 될 때 몇 년 동안 가능한 가뭄 방지, 휴면 계란 생산. Ecotoxicological 연구에서이 또한 물고기 수 모두 해치 할 정확한 동일한 순간에 서로 다른 시간에 생산 하는 계란의 배치 중 에서도 모든 동물에 대 한 시간 synchrony에 결과 복제를 의미 합니다. GRZ 스트레인 실험실을 사용 하 여 노출 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 이 긴장 실험실 조건 하에서 잘 수행, homozygous (성 염색체)를 제외 하 고는 게놈은 잘 성격 나타낸된10,11.
Ecotoxicological 연구에서 그것은 시험 농도의 적절 한 범위를 선택 하는 것이 중요입니다. 여러 가지 보완적인 방법을이 끝을 사용할 수 있습니다. 공칭 농도 범위 Nothobranchius guentheri12등 관련된 동물의 감도 기반으로 수 있습니다. 또는, 범위는 표준 어 모델, 대부분 유독 (필립 외 에 비해 감도가 zebrafish (Danio rerio)2 의 감도에 근거 할 수 있다 (에서 검토)). 함께, 이러한 옵션을 모두 찾는 실험 범위 명목상 농도 범위를 선택 하 실시 한다. 급성 테스트에 대 한 연구는 toxicant에 노출의 24 시간 후 100% 사망률, 중간 사망률 0% 사망률과 집중 치료에 대 한 목표로 한다. 테스트용 만성, 그것은 찾는 경우 높은 테스트 농도 조건에서 애벌레 사망률이 기준 기간 동안 10%를 초과 하지 않는 확인 하려면 2 주 동안 실험 범위를 실행 하는 것이 좋습니다.
프로토콜은 스트레스 두 개인 및 세포 수준에서의 잠재적인 효과 조사 waterborne 오염 물질에 급성 및 만성 노출 명. furzeri에 수행 하는 기준으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 높은 생태 관련성, 다른 유독한 화합물을 혼합 또는 오염 및 다른 자연 스트레스 (예: 포식) 간의 대화형 효과 공부에 맞게 멀티 스트레스 연구를 수행 하 사용 될 수 있습니다 또는 anthropogenic 스트레스 (예: 기후 변화로 인해 지구 온난화).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>purified water Type 1 (milli Q)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L plastic tank</td>
			<td>SAVIC</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L plastic tank (spawning)</td>
			<td>Avamoplast</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nets</td>
			<td>Aqua bilzen</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass jars</td>
			<td>Sepac-Flacover</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5L glass jars</td>
			<td>Sepac-Flacover</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia eggs</td>
			<td>Ocean Nutrition</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chironomus</td>
			<td>Ocean Nutrition</td>
			<td></td>
			<td>frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipettes</td>
			<td>MLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers</td>
			<td>FST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;m mesh sieve</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
			<td>self-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube (2ml)</td>
			<td>BRAND</td>
			<td></td>
			<td>To store fish in freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td></td>
			<td>For water analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>weighing boat</td>
			<td>MLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy 7c pellets</td>
			<td>Jiffy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Gilac</td>
			<td></td>
			<td>for Ctmax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital thermometer</td>
			<td>Testo AG</td>
			<td>testo 926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HETO therm heater</td>
			<td>Anker Schmitt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calibrated balance</td>
			<td>Mettler-Toledo AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platform for camera</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
			<td>self-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiparameter kit</td>
			<td>HACH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80&#176;C)</td>
			<td>Panasonic Ultra low temperature freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fysio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenisation buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>0.1&#160;M TRIS&#8211;HCl, pH 8.5, 15&#160;% polyvinyl pyrrolidone, 153&#160;&#181;M MgSO4&#160;and 0.2&#160;% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform:methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glyceryl tripalmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amyloglucosidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose assay reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G3293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad protein dye</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 microtiter plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass tubes</td>
			<td>Fiers</td>
			<td></td>
			<td>For fat analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5ml eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogeniser</td>
			<td>Ultra-turrax TP 18/10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photospectrometer</td>
			<td>Infinite M200 TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heater for glass tubes</td>
			<td>Hach COD REACTOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5415 R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Bumako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for acute and chronic ecotoxicity testing of the turquoise killifish nothobranchius furzeri

송사리 Nothobranchius furzeri ecotoxicology의 분야에서 신흥 모델 유기 체 이며, 급성 및 만성 ecotoxicity 테스트에 그것의 적용은 입증 되었습니다. 전반적으로, 독성 화합물을 종족의 감도, 또는 이상, 다른 모델의 범위입니다.
이 작품 명. furzeri에 대 한 단일 및 결합 된 스트레스 효과의 급성, 만성, 및 대가족제 생물 검정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 짧은 성숙 시간 및 주기,이 척추 모델 4 개월 이내 끝점 성숙 시간과 통치 등의 연구를 수 있습니다. Transgenerational 전체 수명 주기 노출 시험 빠르면 8 개월만에 수행할 수 있습니다. 이 종 가뭄 방지 계란을 생산 하 고 있기 때문에 가능한 오랫동안 유지, 종족의 현장 문화 필요 하지 않습니다 하지만 개인 필요할 때 채용 될 수 있습니다. 프로토콜은 측정 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 설계 되었습니다.

명. furzeri 의 구리의 다른 농도 급성 노출의 결과 2.5.2에서 계산, cleardose-응답 관계 (그림 1). Toxicant 농도 증가와 사망률에서 증가 있다. LC50 값 시간이 지남에 감소는 농도 감소와 함께 더 많은 시간 복제 다의 50% 통과 의미. 에 대 한 자세한 결과 다른 종에 비해 종 감도의 비교 뿐만 아니라 구리 하 명 furzeri 의 급성 및 만성 노출 ?...

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Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

급성 및 만성 Ecotoxicity 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 의 테스트에 대 한 프로토콜

이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

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Research

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Environment

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

7.4K 조회수.  University of Leuven. 이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

연구

환경과학

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

토양 코어 Lysimeters를 수집 및 구축을위한 프로토콜

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

Protocol for Measuring the Thermal Properties of a Supercooled Synthetic Sand-water-gas-methane Hydrate Sample

Methane hydrates (MHs) are present in large amounts in the ocean floor and permafrost regions. Methane and hydrogen hydrates are being studied as future energy resources and energy storage media. To develop a method for gas production from natural MH-bearing sediments and hydrate-based technologies, it is imperative to understand the thermal properties of gas hydrates.
The thermal properties' measurements of samples comprising sand, water, methane, and MH are difficult because the melting heat of MH may affect the measurements. To solve this problem, we performed thermal properties' measurements at supercooled conditions during MH formation. The measurement protocol, calculation method of the saturation change, and tips for thermal constants' analysis of the sample using transient plane source techniques are described here.
The effect of the formation heat of MH on measurement is very small because the gas hydrate formation rate is very slow. This measurement method can be applied to the thermal properties of the gas hydrate-water-guest gas system, which contains hydrogen, CO2, and ozone hydrates, because the characteristic low formation rate of gas hydrate is not unique to MH. The key point of this method is the low rate of phase transition of the target material. Hence, this method may be applied to other materials having low phase-transition rates.

We present a protocol for measuring the thermal properties of synthetic hydrate-bearing sediment samples comprising sand, water, methane, and methane hydrate.

과냉각 합성 모래 - 물 - 가스 메탄 하이드레이트 샘플의 열적 특성을 측정하기위한 프로토콜

Methane hydrates (MHs) are present in large amounts in the ocean floor and permafrost regions. Methane and hydrogen hydrates are being studied as future ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

바다 표면 및 샘플 분석에 Microplastics 샘플링을위한 프로토콜

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

해양 박테리아와 생태 독성 학적 방법<em&gt; 비브리오 앵 귈라 룸</em&gt; 환경 오염 물질의 급성 독성 평가

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which promotes growth of large weaponry and body size. Populations of the same species display each phenotype depending on environmental conditions. Although antler and body size of male white-tailed deer (Odocoileus virginianus) varies by physiographic region in Mississippi, USA and is strongly correlated with regional variation in nutritional quality, the effects of population-level genetics from native stocks and previous re-stocking efforts cannot be disregarded. This protocol describes how we designed a controlled study, where other factors that influence phenotype, such as age and nutrition, are controlled. We brought wild-caught pregnant females and six-month-old fawns from three distinct physiographic regions in Mississippi, USA to the Mississippi State University Rusty Dawkins Memorial Deer Unit. Deer from the same region were bred to produce a second generation of offspring, allowing us to assess generational responses and maternal effects. All deer ate the same high-quality (20% crude protein deer pellet) diet ad libitum. We uniquely marked each neonate and recorded body mass, hind foot, and total body length. Each subsequent fall, we sedated individuals via remote injection and sampled the same morphometrics plus antlers of adults. We found that all morphometrics increased in size from first to second generation, with full compensation of antler size (regional variation no longer present) and partial compensation of body mass (some evidence of regional variation) evident in the second generation. Second generation males that originated from our poorest quality soil region displayed about a 40% increase in antler size and about a 25% increase in body mass when compared to their wild harvested counterparts. Our results suggest phenotypic variation of wild male white-tailed deer in Mississippi are more related to differences in nutritional quality than population-level genetics.

Phenotypic differences among cervid populations may be related to population-level genetics or nutrition; discerning which is difficult in the wild. This protocol describes how we designed a controlled study where nutritional variation was eliminated. We found that phenotypic variation of male white-tailed deer was more limited by nutrition than genetics.

뿔과 긴 Cervid에 대 한 신체 성장에 환경 및 유전학의 상대적 효과 평가 하기 위한 프로토콜

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

수성 미디어에 나노 재료의 분산: 프로토콜 최적화 쪽으로

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

On the Preparation and Testing of Fuel Cell Catalysts Using the Thin Film Rotating Disk Electrode Method

We present a step-by-step tutorial to prepare proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) catalysts, consisting of Pt nanoparticles (NPs) supported on a high surface area carbon, and to test their performance in thin film rotating disk electrode (TF-RDE) measurements. The TF-RDE methodology is widely used for catalyst screening; nevertheless, the measured performance sometimes considerably differs among research groups. These uncertainties impede the advancement of new catalyst materials and, consequently, several authors discussed possible best practice methods and the importance of benchmarking.
The visual tutorial highlights possible pitfalls in the TF-RDE testing of Pt/C catalysts. A synthesis and testing protocol to assess standard Pt/C catalysts is introduced that can be used together with polycrystalline Pt disks as benchmark catalysts. In particular, this study highlights how the properties of the catalyst film on the glassy carbon (GC) electrode influence the measured performance in TF-RDE testing. To obtain thin, homogeneous catalyst films, not only the catalyst preparation, but also the ink deposition and drying procedures are essential. It is demonstrated that an adjustment of the ink&#39;s pH might be necessary, and how simple control measurements can be used to check film quality. Once reproducible TF-RDE measurements are obtained, determining the Pt loading on the catalyst support (expressed as Pt wt%) and the electrochemical surface area is necessary to normalize the determined reaction rates to either surface area or Pt mass. For the surface area determination, so-called CO stripping, or the determination of the hydrogen underpotential deposition (Hupd) charge, are standard. For the determination of the Pt loading, a straightforward and cheap procedure using digestion in aqua regia with subsequent conversion of Pt(IV) to Pt(II) and UV-vis measurements is introduced.

Preparing and testing Pt/C fuel cell catalysts is subject to continuous discussion in the scientific community with respect to reproducibility and best practice. With the presented work, we intend to present a step-by-step tutorial to make and test Pt/C catalysts, which can serve as benchmark for novel catalyst systems.

준비 및 연료 전지 촉매 박막 자전 디스크 전극 메서드를 사용 하 여 테스트

We present a step-by-step tutorial to prepare proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) catalysts, consisting of Pt nanoparticles (NPs) supported on a ...

The Hawaii Protocol for Scientific Monitoring of Coffee Berry Borer: a Model for Coffee Agroecosystems Worldwide

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at capturing and quantifying the dynamics and impact of this invasive insect pest as well as the development of its host plant across a heterogeneous landscape. The cornerstone of this comprehensive monitoring system is timely georeferenced data collection on CBB movement, coffee berry infestation, mortality by the fungus Beauveria bassiana, and coffee plant phenology via a mobile electronic data recording application. This electronic data collection system allows field records to be georeferenced through built-in global positioning systems, and is backed by a network of weather stations and records of farm management practices. Comprehensive monitoring of CBB and host plant dynamics is an essential part of an area-wide project in Hawaii to aggregate landscape-level data for research to improve management practices. Coffee agroecosystems in other parts of the world that experience highly variable environmental and socioeconomic factors will also benefit from implementing this protocol, in that it will drive the development of customized integrated pest management (IPM) to manage CBB populations.

Comprehensive monitoring of coffee berry borer and host plant dynamics is essential for aggregating landscape-level data to improve management of this invasive pest. Here, we present a protocol for scientific monitoring of coffee berry borer movement, infestation, mortality, coffee plant phenology, weather, and farm management via a mobile electronic data recording application.

커피 베리 보어의 과학적 모니터링을 위한 하와이 프로토콜: 커피 Agroecosystems 전세계에 대 한 모델

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at ...