생화학적 생체지표를 평가하는 기법이 광범위하게 활용되고 있지만, 이 프로토콜은 신열대성 아누란에서 방법론을 표준화하고 복제하기 위한 중요한 세부 정보를 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 저렴한 비용, 복제성 및 적용성입니다. 이 기술은 내부 멜라닌의 변화를 평가하기 위한 정량적 데이터를 얻기 위해 적용할 수 있습니다.
혜성 분석은 특정 화합물에 의해 유도된 유전 독성 효과를 결정할 수 있는 민감하고 다재다능하며 간단한 기술입니다. 모든 유형의 진핵 세포에 적용하여 DNA 손상, DNA 복구 및 세포의 항산화 상태를 평가할 수 있습니다. 시작하려면 Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어를 열고 메뉴와 도구 모음을 생물학적으로 선택하십시오.
멜라닌이 차지하는 면적을 정량화하려면 measure(측정)를 선택한 다음 사진 현미경 사진을 찍는 데 사용되는 배율의 공간 보정을 선택합니다. 조직학적 이미지를 연 후 도구 수를 선택한 다음 물체를 측정합니다. 색상 선택 및 스포이드 도구를 사용하여 이미지에서 측정할 색상을 표시한 다음 창을 닫습니다.
count, view 및 statistics를 클릭하여 결과를 시각화합니다. PBS, 과산화수소 및 샘플의 혼합물을 경로 길이가 1cm인 3밀리리터 석영 큐벳에 배양합니다. 그런 다음 500 마이크로리터 원심분리기 튜브에 보관된 샘플을 제거하고 석영 큐벳에 추가합니다.
UV 분광 광도계에서 2분 동안 240나노미터에서 카탈라제 동역학을 읽고 화면에 표시된 방정식을 사용하여 효소 활성을 계산합니다. 수집된 혈액 샘플을 PBS 1밀리리터로 희석합니다. 381G에서 9분 동안 원심분리하고 펠릿을 50밀리리터의 PBS로 재현탁시킵니다.
혈액 샘플 30마이크로리터를 0.5% 농도의 저융점 아가로스 또는 LMPA 70마이크로리터에 혼합하여 2층을 형성합니다. 0.5% 정상 융점 아가로스 100마이크로리터를 포함하는 레이어 1로 이전에 코팅된 슬라이드에 50마이크로리터의 레이어 2를 놓습니다. 슬라이드를 커버 슬립으로 덮고 섭씨 4도의 추위에 10 분 동안 두어 2 층을 응고시킵니다.
응고 후 커버슬립을 제거하십시오. 0.5%LMPA 100마이크로리터를 깔아 세 번째 층을 형성하고 슬라이드를 다시 덮습니다. 세 번째 층이 응고된 후 커버슬립을 제거하고 같은 날 준비된 용해액이 들어 있는 100밀리리터 코플린 병에 각 슬라이드를 담그십시오.
코플린 항아리를 섭씨 4도의 차가운 욕조에 넣고 어두운 곳에서 1시간 동안 용해가 일어나도록 합니다. 용해가 끝나면 슬라이드를 제거하고 DNA가 풀릴 수 있도록 섭씨 4도에서 15분 동안 전기영동 탱크의 전기영동 완충 용액에 담그십시오. 핵 DNA를 푼 후 동일한 완충액에서 섭씨 4도에서 25볼트 및 250밀리암페어에서 10분 동안 전기영동을 수행합니다.
전기 영동이 끝나면 5 분 동안 2 밀리리터의 트리스 염화 용액을 3 번 첨가하여 슬라이드의 샘플을 중화시킵니다. 섭씨 4도에서 95% 알코올이 들어 있는 100밀리리터 코플린 병에 샘플을 넣어 샘플을 탈수합니다. 슬라이드 중앙에 10마이크로리터의 DAPI를 추가하여 샘플을 염색합니다.
그런 다음 커버슬립으로 샘플 전체에 염료를 펴 바릅니다. NU 필터가 있는 형광 광현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 핵체에서 DNA 이동 길이를 평가하여 DNA 손상을 정량화합니다.
이 경우 겹치지 않고 무작위로 선택된 100개의 셀에서 시각적으로 결정하십시오. 그런 다음 DNA 손상을 4가지 등급으로 분류하는데, 0에서 1은 손상이 없음, 2는 최소 손상, 3은 중간 손상, 4는 최대 손상입니다. 데이터를 손상된 세포의 평균 개수와 각 처리 그룹에 대한 평균 혜성 점수로 표현합니다.
마지막으로, 이 데이터에서 화면에 표시된 방정식을 사용하여 각 테스트 유기체에 대한 유전적 손상 지수 또는 GDI를 계산합니다. Boana pulchella 및 Leptodactylus luctator 성인의 스케일 된 질량 지수가이 그림에 나와 있습니다. 스케일링된 질량 지수의 분석을 위해 스케일링 지수를 결정하기 위해 종의 SVL과 체질량 사이의 전력 함수 관계를 보여주는 비선형 회귀 분석을 수행했습니다.
스케일링 질량 지수는 동일한 종의 성인 또는 청소년 그룹을 비교하는 데 유용합니다. Boana raniceps 간의 조직 학적 단면도가 여기에 제시되어 있습니다. 간세포의 더 많은 양과 간세포의 핵의 더 큰 차원을 이 섹션에서 관찰할 수 있습니다.
Boana pulchella의 제초제 시나리오 노출에서 세포유전학적 바이오마커의 다양하고 보완적인 반응이 이 그림에 나와 있습니다. 여기서 검은색 막대는 48시간을 나타내고 회색 막대는 96시간을 나타냅니다. 특정 시간이나 농도가 손상을 유발하기에 충분하지 않을 수 있으므로 노출 시간과 농도는 항상 여기에서 요인으로 고려되어야 합니다.
대표 이미지는 바이오마커가 바이오마커 반응 지수와 어떻게 관련되어 있는지 설명합니다. 여기서 파란색은 대조군을 나타내고 주황색, 노란색 및 녹색은 BDE 209에 대한 노출 시나리오를 나타냅니다. 이 데이터는 카탈라아제가 스트레스 요인이 가장 높은 농도로 존재하는 스트레스 상황에 대한 효과적인 바이오마커임을 나타냅니다.
신체 상태 지수를 계산할 때는 같은 거리에서 일관되게 사진을 찍으십시오. 올챙이의 경우 깃 지느러미를 제외하고 배설관까지의 SVL 몸 길이를 측정합니다. 이 접근법은 양서류 생리학과 환경 변화의 영향을 안전하게 다룹니다.
잠재적으로 침습적인 대체 바이오마커가 존재하지만 이러한 방법은 산화 스트레스, 독성 역학 및 독성 유전학에 대한 통찰력을 제공합니다. 산화 스트레스와 관련된 추가 효소 측정은 대체 방법론이 될 수 있습니다. 색상 차이 분석 기법은 색상 차이를 기반으로 현미경 사진에서 조직 반응을 평가합니다.
색소 시스템의 경우 프로그램의 보정이 현미경 사진과 일치하는지 확인하십시오. 이 첨단 기술은 생체 이물질이 다양한 세포 유형의 DNA에 직접 영향을 미치는지 여부를 조사하고, 다른 세포 유전학 기술로는 해결할 수 없는 유전 물질의 산화 손상 및 복구 과정에 대한 질문을 해결하는 데 중요한 역할을 합니다.
