우리는 물 샘플의 분석에 대 한 감사는 UAntwerpen와는 시간적의 작물 보호 학과의 구체 그룹에. 이 프로젝트 중 지원 우수 센터에 의해 제공 된 ' 환경 및 사회 진화 역학 (PF/10/007) 구 루벤 연구 기금. AFG (11Q0516N) 및 ESJT (FWO-SB151323)로 박사 투자 했다 고 FWO 플랑드르 (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek)에서 박사 후 연구원으로 TP (12F0716N).

여기에 설명 된 모든 방법은 KULeuven의 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 화 명 furzeri 의 일반 유지 보수
<ol><li>준비 물고기 14 ° C의 온도에서 매체 (pH 7)와 600 µS/c m (24 ° C)의 전도도에 추가 표준화 된 소금, 정제 타입 II 물을 추가.</li>
	<li>표준화 된 조건13에서 저장 된 GRZ (Gona-토크쇼-Zhou) 연구소 라인에서 계란을 선택 합니다. (즉 해치 준비), DIII 단계에서 계란을 선택 인식할 수 있는 황금 눈9 의 그리고 부드럽게 존재에 의해 그들 핀셋의 부드러운 쌍을 전송 플라스틱 2 리터 탱크 (탱크 당 더 이상 약 30 알). 참고: 하기 위해서는 건강 한 시험 생물의 충분 한 수, 필요한 물고기 애벌레의 수로 두 번 많은 계란 해치.</li>
	<li>12 ° C에서 물고기 매체의 1 cm를 추가 하 고 물 온도 실내 온도 (24 ° C)9점차 수렴 하 게. 물고기는 처음 12 h 이내 해치 것입니다.</li>
	<li>24 시간 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemianauplii 집중된 투여 (대 한 음식의 양과 주파수에 자세히 Polačik 외. 20169번 식 프로토콜을 참조)에 의해 5 cm에 물 깊이 증가 물고기 매체 추가.</li>
	<li>36 h 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemia nauplii 의 다른 집중된 투여 하 고 물고기 매체 물 깊이 10 cm를 증가 추가 합니다.</li>
	<li>14 h:10 h에서 일정 한 온도 조건 (예: 보육, 기후 실 또는 온수 물 목욕) 물고기 컨테이너를 품 어 빛: 다크 정권.</li>
	<li>실험을 시작 하기 전에 복잡 한 물고기 컨테이너 (물고기) 노출 노출 매체의 높은 농도 함께 그들을 작성 하는 것 그것을 떠날 하 여 복합 하룻밤 실제 컨테이너에 유독의 전송을 제한 하려면 실험입니다.</li>
	<li>해칭, 후 48 h 노출 실험을 시작 하는 건강 한 부 력 애벌레를 선택 합니다. 무시 하 고 결과적으로 장애인된 부 력 그들의 수영 방광을 채우기 할 수 없었던 소위 배 슬라이더 (지속적으로 바닥에 싱크).</li>
</ol>2. 단기 노출 프로토콜
참고: 연구원 치료 당 적어도 20 복제 (별도 항아리에 20 물고기)에 대 한 목표로 한다. 용 매를 사용 하 여 화합물의 재고 솔루션을 준비 하는 경우 모든 권한 치료 뿐만 아니라 용 매 제어는 포함 되어야 합니다. 솔벤트 컨트롤 최고 노출 농도에서 용 매 농도 인 용 매의 양을 포함 해야 합니다.
<ol><li>그들 하 고 적절 한 노출 매체 (다른 toxicant 농도)와 그들을 작성 하는 것에 의해 실험 용기 (0.5 L 유리 항아리)를 준비 합니다. 정확한 농도 얻기 위해 화합물을 추가 합니다.</li>
	<li>컨테이너 (개별 모니터링에 대 한 컨테이너 당 1 물고기)에 애벌레 (48 h 후 부 화)를 개별적으로 전송 합니다. 참고: 물고기 음식과 침략에 대 한 경쟁 등 사회적 상호 작용의 잠재적인 혼란 효과 최소화 하기 위해 개별적으로 노출 됩니다. 그러나, 물고기 실험 동물 사용에 대 한 윤리 기준에 따라에서 시각적으로 상호 작용할 수 있습니다.</li>
	<li>최대 2 주 동안이 급성 노출 후속. 그 시간 동안, 물고기 먹이 광고 libitum Artemia nauplii 두 번 하루, 7 일/주를.</li>
	<li>새로 고침 매체 매일 수 질을 유지 하 고 복합 저하의 잠재적인 영향을 최소화 합니다. 주요 물 변수 모니터링 (용 존된 산소 수준 80%를 초과 한다, 전도도 해야 600 그리고 700 µS/c m, pH 7.8와 8.2, 고 경도 (CaCO3)로 사이 350와 450 mg/L, 최적의 양육 조건의 범위 내 명. furzeri 9)에 대 한. 전과 후 실제 화합물 농도 결정 하는 매체 물 샘플을 가져가 라.</li>
	<li>끝점<ol>
<li>물고기 사망, 스트레스에 대 한 확인 (예: 탈 선 행동: 거꾸로 수영) 또는 질병 매일 (아침, 저녁). Shedd 외 의 게시를 참조 하십시오 (1999) 사망률, 스트레스 또는 질병의 관찰에 대 한 내용은 12 .</li>
		<li>LC 계산 복용량 응답 곡선 (리츠와 Streibig, 2005)를 사용 하 여 다른 시간 지점에서 사망률에 따라50 값. Drm 함수를 사용 하 여 R v3.2.3 (연구 개발 핵심 팀, 2016) drc 패키지에서 또는 유사한 통계 접근.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 만성 노출 프로토콜
참고: 상태 생선/25 비뚤어진된 섹스 률의 가능성을 최소화 하 고 자연적인 원인으로 인 한 잠재적인 배경 사망률에 맞게 실험의 발병의 최소 목표 (즉. 연령 관련 사망률).
<ol><li>(참조 1) 부 화</li>
	<li>차 전 (2 일 후-16 일 후 부 화 부 화)<ol>
<li>2.1-2.4에 설명 된 대로 프로토콜을 따라</li>
		<li>실험의 두 번째 단계 동안 매체 주 (없음 다, 아래 참조)에 걸쳐 떨어집니다. 화합물의 비슷한 저하를 허용 하기 위하여 큰 불활성 용기에 1 주일에 대 한 매체의 필요한 양을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단계 II (16 일 후 부 화-끝)<ol>
<li>2 L 준비 실험 유리 항아리 complexing에 의해 그들 화합물으로. 정확한 노출 매체와 항아리와 항아리 공기에 쐬는 공기 튜브를 추가. 실험의 나머지 부분에 대 한 이러한 항아리에 개별적으로 집 물고기. 윤리 기준에 맞게 시각적 상호 작용을 허용 합니다.</li>
		<li>주 당 한 번 매체를 새로 고칩니다. 동일한 노출 매체를 포함 하는 새 항아리에 그물과 물고기를 전송. 각 농도 처리에서 화합물의 저하를 모니터링 하는 데 1 주일 동안 매일 물 샘플을 가져가 라. 각 치료 경우 여러 스트레스에 대 한 저하 곡선 테스트 (예: 다른 온도 정권에서 화합물의 독성)를 계산 합니다. 주 당 세 번 abiotic 매개 변수 (pH, 온도, 용 존 % 산소, 전도도)를 측정 합니다.</li>
		<li>2 일 후 부 화 (dph) 23 dph까지, 하루에 두 번, 주 ad libitum Artemia nauplii 당 7 일 물고기를 먹이. 24 dph-37 dph에서에서 다진된 Chironomus 애벌레와 광고 libitumArtemia 다이어트를 보완. 에 38 dph에서 두 번 하루, 7 일 주일 광고 libitum Chironomus 애벌레 냉동 물고기를 먹이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>끝점<ol>
<li>매일 물고기 사망, 스트레스 또는 질병12에 대 한 확인 합니다.</li>
		<li>결정 성장, 페 트리 접시에 생선을 전송 하 여 (9 dph-16 dph-21 dph-...) 주간 기준 본문 크기를 측정 하는 그들의 저수지에서 매체 가득 합니다. (고정된 높이)에서 4-5 위에서 물고기의 보정 크기 사진을가 고 디지털 공간 측정 프로그램 (예: ImageJ)를 사용 하 여 그들을 분석. 참고: 성인 물고기에 대 한 전체 프로세스를 측정 하는 동안 잠긴 모든 물고기를 유지 하 여 처리 스트레스를 최소화 하기 위해 높은 페 트리 접시를 사용 합니다.</li>
		<li>남성 성숙에 대 한 시각적으로 매일 15 dph 이후부터 채색에 대 한 물고기를 검사 합니다. 결혼식 채색 (2 차 성적 특성)의 첫 번째 징후에 대 한 지 느 러 미를 확인 하십시오. 이 표시 됩니다 프록시 남성 성숙으로 첫 날을 사용 합니다.</li>
		<li>커플 비 sexed 물고기 같은 치료 그룹의 남성 또는 주당 3 회 실험 비 남성 30 dph에서 이후 여성 성숙 시간 (첫 번째 계란 입금 일)을 결정 하기 위하여. 이 위해, 3.4.5에 설명 된 산란 프로토콜을 사용 합니다.</li>
		<li>통치에 대 한 몇 가지 성숙한 성숙한 남성과 여성 3 회 / 30 dph 주 이후, 그들의 처리에서 사용 하 여 횡단 계획.<ol>
<li>산란 탱크 (1 L) 기판 산란 보충 남성 수족관에서 노출 매체를 사용 하 여 각 커플에 대 한 준비 (미세 모래 < 500 µ m).</li>
			<li>산란 탱크에 남성과 여성 모두 전송 및 2 시간 동안 산란 하도록 허용. 인간의 활동 또는이 프로세스 동안 산란 컨테이너 주위 방해를 최소화 합니다.</li>
			<li>그 후, 부드럽게 물고기 다시 전송 그들의 원래 주택 컨테이너 산란 기판에 달걀을 소용돌이 물의 불필요 한 혼합 없이.</li>
			<li>500 µ m 메쉬 위에 산란 기질을 붓는 의해 계란을 필터링. 계란을 계산 하 고 그들을 전송 (사용 하 여 부드러운 핀셋) 접시9,14에서 축축한 물 이끼를.</li>
			<li>매일 죽은 계란을 제거 합니다. 후 주, 물개는 페 트리 필름 밀봉 된 접시와 온도에 저장 제어 28 ° C에서 인큐베이터와 14시 10분 h 빛: 다크 DIII 단계 (즉, 약 3 주 후 해치 준비)을 즉시 개발 주기. 장기 보관을 위해 따라 계란 휴면 단계를 입력 하 고 가능한 여러 년 남아 지속적인 암흑에서 17 ° C에 계란을 저장. 14:10 h 28 ° C 조건 실험, 휴면이 계란에서 모집 물고기 전송 휴면 계란 빛: 다크 DIII 단계로 개발 수 있도록 약 3 주에 대 한 주기.</li>
		</ol>
</li>
		<li>성인 물고기의 중요 한 열 최대 (CTmax) (15성능 측정)를 측정 합니다.<ol>
<li>0.33 ° C/min의 일정 한 속도로 열 물 목욕을 사용 하 고 물을 지속적으로 순환 됩니다. 각 개별 물고기에 대 한 몇 가지 1 L aquaria을 추가 합니다. 참고: 물 목욕에서 공간 제약을 감안할 때, 그것은 여러 시리즈에서 일 필요가 있다. 시리즈 중 조건에서 잠재적인 차이 계정에 임의의 요소로 ' 시리즈'를 포함 하 여 통계 분석을 수행할 때 취해야 한다.</li>
			<li>수족관에 물에는 물고기 (일반적으로 28 ° C)의 실험적인 양육 온도 도달 했습니다 때 수족관에 물고기를 추가 하 여 재판을 시작 합니다. 디지털 온도계 (0.1 ° C 스케일)를 사용 하 여 모든 5 분 1 L aquaria CTmax 목욕의 온도 모니터링 합니다.</li>
			<li>물고기 dorso ventrally 수직 위치를 유지 하거나 무 겁 게16,17꿈 틀 시작 때 재판을 종료. 중요 한 최대 온도 1 L 수족관에서 온도 측정 합니다. 물고기는 그것의 실험 주택 복구에 대 한 다시 전송.</li>
		</ol>
</li>
		<li>건조 모리 아 티와 무게 보트에 전송 하 여 실험의 마지막 날에는 생선의 무게 (0.1 mg 정확도)를 측정 합니다. 참고: 모든 생선 창 자에서 음식 무게 표준화에 마지막 수 유 후 4 시간 측정 한다.</li>
		<li>0.1%를 사용 하 여 물고기를 안락사 Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Transgenerational 노출 프로토콜
주: 명. furzeri에 오염 물질의 transgenerational 효과 측정 하는 1 세대에 대 한 위에서 설명한 만성 노출 프로토콜을 따릅니다.
<ol><li>매주 두 번, 28 ° C에 저장 된 생산된 계란 (즉 2 세대)의 개발 확인 14시 10분 DIII 단계에서 배아의 배양 접시를 검사 하 여 h 빛: 다크 주기 조건 (Polačik 외. 참조 20169)입니다. 각 부모의 치료의 50 개 이상의 복제 완전히 개발 되는 때, 1.1에서 프로토콜을 따르고 그들을 해치.</li>
	<li>건강 한, 잘 뜨는 물고기 정확 하 게 동일한 설치 및 부모의 물고기 치료를 노출.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 작품 Nothobranchius furzeri, 신흥 모델 유기 체, 개인 연구를 사용 하 여 새로운 생물을 설명 하 고 유독 다른 스트레스의 장기적인 효과 결합. 제시 프로토콜 성공적으로 유독 (구리, 카드뮴, 3, 4-dichloroaniline, 및 chlorpyrifos)의 배열에 종의 감도 측정에 적용 했다. 그것의 빠른 수명 주기 때문이 척추 모델 sublethal의 평가 대 한 허용 하 고 transgenerational 4 개월 이내 효과. 이 어류를 사용 하 여 독성 ...

전략적으로 선택한 유독 종족의 감도 프로필 유럽 도달 법안 (등록, 평가, 승인, 및 화학 물질의 제한)에 대 한 설명된1 되었습니다. 급성 또는 단기 독성 테스트 그들은 종족의 감도의 빠른 알려주지이 목적을 위해 주로 사용 했다. 그러나, 그들의 자연 환경에서 유기 체는 더 이상 기간 동안 노출 하 고 전체 수명 주기 또는 심지어 여러 세대 수 있습니다 영향을 받는2키를 누릅니다. 또한, 오염 된 환경에 있는 유기 체는 일반적으로 노출 이상의 스트레스를 한 번에, 서로 상호 작용 수 있는 시너지 효과3발생할. 따라서, 안전한 농도 계산된에 따라 급성, 단일 스트레스 독성 테스트 이용과 자연 환경에 의해 부과 된 실제 위험을 과소 평가 수 있습니다. 그것은, 그러므로, 또한 유럽 위원회4,5 와 USEPA (미국에 의해 주 창으로 환경 관련 컨텍스트에서 이용과의 sublethal 농도의 만성 및 대가족제 효과 공부 하는 것이 좋습니다. 미국 환경 보호국)6,7. 특히 척추 연구, 노동, 돈, 그리고 시간 비용에 높은 척추 동물 무척 추 동물 모형 유기 체에 비해 상대적으로 긴 수명으로 인해 만성 및 대가족제 노출 연구를 수행할 때. 따라서, 그것은 가장 적절 한 물고기 모델 유기 체, 연구 질문에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 또한, 광범위 한 척 추가 있는 종 규정 가장 민감한 종에 따라 적응 수 종에 걸쳐 응답의 보편성을 테스트 하기 위해 사용할 수 있어야. 지금, 새로운, 척추 모델 종 척추 동물7,8에 만성와 대가족제 노출 수행의 비용을 줄이고 짧은 주기가 특징으로 효율적인 프로토콜을 개발 하는 필요가 있다.
청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 는 짧은 성숙 시간과 라이프 사이클 (생성 시간 4 주9미만) 때문에 같은 장기 노출 실험에 사용 하는 재미 있는 물고기 모델입니다. 즉, 성숙 시간과 통치 등 생태 관련 끝점 다른 물고기 모델7에 비해 짧은 시간 프레임 내에서 공부 될 수 있다. 또한,이 물고기 유지 함으로써 지속적인 문화9에 대 한 필요성을 제거 하는 표준 조건 하에서 저장 될 때 몇 년 동안 가능한 가뭄 방지, 휴면 계란 생산. Ecotoxicological 연구에서이 또한 물고기 수 모두 해치 할 정확한 동일한 순간에 서로 다른 시간에 생산 하는 계란의 배치 중 에서도 모든 동물에 대 한 시간 synchrony에 결과 복제를 의미 합니다. GRZ 스트레인 실험실을 사용 하 여 노출 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 이 긴장 실험실 조건 하에서 잘 수행, homozygous (성 염색체)를 제외 하 고는 게놈은 잘 성격 나타낸된10,11.
Ecotoxicological 연구에서 그것은 시험 농도의 적절 한 범위를 선택 하는 것이 중요입니다. 여러 가지 보완적인 방법을이 끝을 사용할 수 있습니다. 공칭 농도 범위 Nothobranchius guentheri12등 관련된 동물의 감도 기반으로 수 있습니다. 또는, 범위는 표준 어 모델, 대부분 유독 (필립 외 에 비해 감도가 zebrafish (Danio rerio)2 의 감도에 근거 할 수 있다 (에서 검토)). 함께, 이러한 옵션을 모두 찾는 실험 범위 명목상 농도 범위를 선택 하 실시 한다. 급성 테스트에 대 한 연구는 toxicant에 노출의 24 시간 후 100% 사망률, 중간 사망률 0% 사망률과 집중 치료에 대 한 목표로 한다. 테스트용 만성, 그것은 찾는 경우 높은 테스트 농도 조건에서 애벌레 사망률이 기준 기간 동안 10%를 초과 하지 않는 확인 하려면 2 주 동안 실험 범위를 실행 하는 것이 좋습니다.
프로토콜은 스트레스 두 개인 및 세포 수준에서의 잠재적인 효과 조사 waterborne 오염 물질에 급성 및 만성 노출 명. furzeri에 수행 하는 기준으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 높은 생태 관련성, 다른 유독한 화합물을 혼합 또는 오염 및 다른 자연 스트레스 (예: 포식) 간의 대화형 효과 공부에 맞게 멀티 스트레스 연구를 수행 하 사용 될 수 있습니다 또는 anthropogenic 스트레스 (예: 기후 변화로 인해 지구 온난화).

<table><tbody><tr><td>purified water Type 1 (milli Q)</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2L plastic tank</td><td>SAVIC</td><td></td><td>Always separate material for control and toxicity treatments</td></tr><tr><td>1L plastic tank (spawning)</td><td>Avamoplast</td><td></td><td>Always separate material for control and toxicity treatments</td></tr><tr><td>nets</td><td>Aqua bilzen</td><td></td><td>Always separate material for control and toxicity treatments</td></tr><tr><td>2L glass jars</td><td>Sepac-Flacover</td><td></td><td>Always separate material for control and toxicity treatments</td></tr><tr><td>0,5L glass jars</td><td>Sepac-Flacover</td><td></td><td>Always separate material for control and toxicity treatments</td></tr><tr><td>Artemia eggs</td><td>Ocean Nutrition</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chironomus</td><td>Ocean Nutrition</td><td></td><td>frozen</td></tr><tr><td>tricaine</td><td>Sigma aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>petri dishes</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipettes</td><td>MLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tweezers</td><td>FST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;micro;m mesh sieve</td><td>/</td><td></td><td>self-made</td></tr><tr><td>microcentrifuge tube (2ml)</td><td>BRAND</td><td></td><td>To store fish in freezer</td></tr><tr><td>glass vials</td><td>Sigma aldrich</td><td></td><td>For water analysis</td></tr><tr><td>weighing boat</td><td>MLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jiffy 7c pellets</td><td>Jiffy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td>Gilac</td><td></td><td>for Ctmax</td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td>Air liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>digital thermometer</td><td>Testo AG</td><td>testo 926</td><td></td></tr><tr><td>HETO therm heater</td><td>Anker Schmitt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>calibrated balance</td><td>Mettler-Toledo AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>platform for camera</td><td>/</td><td></td><td>self-made</td></tr><tr><td>Multiparameter kit</td><td>HACH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-80&amp;deg;C)</td><td>Panasonic Ultra low temperature freezer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fysio&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homogenisation buffer</td><td>VWR</td><td></td><td>0.1&amp;nbsp;M TRIS&amp;ndash;HCl, pH 8.5, 15&amp;nbsp;% polyvinyl pyrrolidone, 153&amp;nbsp;&amp;micro;M MgSO4&amp;nbsp;and 0.2&amp;nbsp;% Triton X-100</td></tr><tr><td>chloroform:methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glyceryl tripalmitate</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>amyloglucosidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7420</td><td></td></tr><tr><td>glucose assay reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3293</td><td></td></tr><tr><td>Biorad protein dye</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well microtiter plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 microtiter plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml glass tubes</td><td>Fiers</td><td></td><td>For fat analysis</td></tr><tr><td>2,5ml eppendorf tubes</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>homogeniser</td><td>Ultra-turrax TP 18/10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>photospectrometer</td><td>Infinite M200 TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>heater for glass tubes</td><td>Hach COD REACTOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf Centrifuge 5415 R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Bumako</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for acute and chronic ecotoxicity testing of the turquoise killifish nothobranchius furzeri

송사리 Nothobranchius furzeri ecotoxicology의 분야에서 신흥 모델 유기 체 이며, 급성 및 만성 ecotoxicity 테스트에 그것의 적용은 입증 되었습니다. 전반적으로, 독성 화합물을 종족의 감도, 또는 이상, 다른 모델의 범위입니다.
이 작품 명. furzeri에 대 한 단일 및 결합 된 스트레스 효과의 급성, 만성, 및 대가족제 생물 검정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 짧은 성숙 시간 및 주기,이 척추 모델 4 개월 이내 끝점 성숙 시간과 통치 등의 연구를 수 있습니다. Transgenerational 전체 수명 주기 노출 시험 빠르면 8 개월만에 수행할 수 있습니다. 이 종 가뭄 방지 계란을 생산 하 고 있기 때문에 가능한 오랫동안 유지, 종족의 현장 문화 필요 하지 않습니다 하지만 개인 필요할 때 채용 될 수 있습니다. 프로토콜은 측정 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 설계 되었습니다.

명. furzeri 의 구리의 다른 농도 급성 노출의 결과 2.5.2에서 계산, cleardose-응답 관계 (그림 1). Toxicant 농도 증가와 사망률에서 증가 있다. LC50 값 시간이 지남에 감소는 농도 감소와 함께 더 많은 시간 복제 다의 50% 통과 의미. 에 대 한 자세한 결과 다른 종에 비해 종 감도의 비교 뿐만 아니라 구리 하 명 furzeri 의 급성 및 만성 노출 ?...

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Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

급성 및 만성 Ecotoxicity 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 의 테스트에 대 한 프로토콜

이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

7.4K 조회수.  University of Leuven. 이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.

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Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.

Endocrine Disrupting Compounds (EDC) pose a substantial risk to the aquatic environment. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. The methodology provided in this paper allows for an assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to EDC removal.

폐수 처리 프로세스의 효능의 평가를위한 화학 및 생체 독성 방법의 배터리를 사용하면 에스트로겐 효능을 제거하는 방법

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in ...

연구

환경과학

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

해양 박테리아와 생태 독성 학적 방법<em&gt; 비브리오 앵 귈라 룸</em&gt; 환경 오염 물질의 급성 독성 평가

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae are a preeminent model for the neurobehavioral study of environmental pollutants. Here, a detailed experimental protocol is provided for the evaluation of the neurotoxicity of environmental pollutants using zebrafish larvae, including the collection of the embryos, the exposure process, neurobehavioral indicators, the test process, and data analysis. Also, the culture environment, exposure process, and experimental conditions are discussed to ensure the success of the assay. The protocol has been used in the development of psychopathic drugs, research on environmental neurotoxic pollutants, and can be optimized to make corresponding studies or be helpful for mechanistic studies. The protocol demonstrates a clear operation process for studying neurobehavioral effects on zebrafish larvae and can reveal the effects of various neurotoxic substances or pollutants.

A detailed experimental protocol is presented in this paper for the evaluation of neurobehavioral toxicity of environmental pollutants using a zebrafish larvae model, including the exposure process and tests for neurobehavioral indicators.

제브라피시 유충에 대한 환경 오염물질의 신경행동 효과 연구

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae ...

Ecotoxicological Methodologies to Evaluate Biomarkers at Different Scales in Neotropical Anurans

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that improve not only the interpretation of the effects of environmental stressors on organisms but also the determination of their possible impact. It is well known that the use of ecotoxicological biomarkers at different levels of organization allows for the prediction of the biological responses of organisms to environmental stressors, which is useful in environmental risk assessment. 
Nevertheless, it is necessary to consider the optimization of basic procedures, to generate historical data in control groups, and to employ specific bioassays to evaluate responses in organs and tissues in order to elucidate the nature and variation of the effects observed. Therefore, the present work aims to describe several ecotoxicological methodologies employed in all stages of neotropical anurans at different ecological levels and to validate them as useful biomarkers to be used both in wildlife and in laboratory conditions. In this work, these biomarkers were applied at the individual/organismic level (body condition index), histological/physiological level (histopathology, histometric, and pigmentary analyses), biochemical level (oxidative stress enzymes), and genetic level (direct and oxidative damage in DNA by comet assay). 
Although these methodologies have small variations or modifications depending on the species, these techniques provide effective biomarkers for evaluating the effect of xenobiotics on anurans, which possess certain characteristics that make them useful indicator species of aquatic and terrestrial ecosystems. In conclusion, the battery of biomarkers employed in the present study has proven to be adequate for estimating toxic responses in Neotropical anurans and can be further recommended as bioindicators for identifying the impact of pollutants on the aquatic ecosystems of the region. Finally, it is recommended to achieve the standardization of these important biomarkers for anurans in specific regions as well as to possibly include them in risk assessments and decision-making.

<meta charset="utf8"></head><body>신열대성 아누란에서 다양한 규모의 바이오마커를 평가하기 위한 생태독성학적 방법론

In this paper, standardized ecotoxicological methods for the evaluation of biomarkers in neotropical anuran species are presented. Specifically, this paper details several methodologies at different scales of ecotoxicological evaluation, such as the genetic, cellular-histological, biochemical, morphological, and individual levels.

신열대성 아누란에서 다양한 규모의 바이오마커를 평가하기 위한 생태독성학적 방법론

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that ...

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.

Measuring the impacts of environmental contaminants on fish behavior is often subjective and challenging particularly when dealing with sublethal endpoints. We describe methods including video technology to quantify swimming behavior of early life stage white sturgeon (Acipenser transmontanus) during and after 96 hr acute exposures to various concentrations of copper.

컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

신경과학

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

생물학

성인 제브라피쉬의 신경 독성 효과를 평가하기 위한 행동 테스트 배터리

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

저자 스포트라이트: 성체 제브라피시의 환경 및 약물 유발 행동 변화 평가 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

급성 및 만성 Ecotoxicity 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 의 테스트에 대 한 프로토콜

요약

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해양 박테리아와 생태 독성 학적 방법

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제브라피시 유충에 대한 환경 오염물질의 신경행동 효과 연구

신열대성 아누란에서 다양한 규모의 바이오마커를 평가하기 위한 생태독성학적 방법론

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컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana

단일 탱크에서 행동 테스트 배터리를 사용한 성인 Danio rerio 의 신경 독성 평가

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