Name: microdissection of primary renal tissue segments and incorporation with novel scaffold-free construct technology
Uploaded: 2018-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
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NIH 박사 제도적 교육 부여, NIH-HL-007260

아래에 설명 된 모든 동물 수술 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 의학 대학의 사우스 캐롤라이나에서 어떤 동물 수술 전에 또는 사용의 어떤 동물의 조직에 의해 승인 되었다.
1. murine 신
<ol><li>수술 용 마스크와 오염 위험을 최소화 하기 위해 bouffant 모자를 돈. 외과 영역의 설정 동안 불 임을 유지 합니다.<ol>
<li>운영 테이블에 비 fenestrated 수술 커튼을 배치 합니다.</li>
		<li>무 균 커튼에 압력가 악기의 팩을 엽니다. 신에 필요한 악기 3 작은 hemostats, 정밀한 집게 이빨, 이빨, 그리고 직선 아이리스가 위 없이 좋은 집게.</li>
		<li>운영 테이블의 센터에 다른 비 fenestrated 외과 용 드 레이프를 배치 합니다.</li>
		<li>5 mL의 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 칼슘과 마그네슘, 1% 페니실린/스 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 보충을 준비 합니다. 얼음 운영 테이블 옆에이 솔루션을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 주택 단지에서 8-12 주 오래 된 C57BL/6 마우스를 (남성 또는 여성)를 가져옵니다.</li>
	<li>마 취 유도 챔버 내부 마우스를 놓고 3.5% 흡입 isoflurane로 유도 합니다. 코 콘 2 %isoflurane 마 취 유지 보수에 대 한 사용 하 여 마우스를 놓습니다.<ol>
<li>주기적으로 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 대 한 평가 하 여 수술 내내 마 취의 적절 한 깊이 대 한 모니터.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제 모 크림을 사용 하 여 복 부 몸통에서 머리의 모든을 제거 합니다. 이 지역을 모든 머리에서 복 부 제거 되었습니다 되도록 증류수로 헹 구 십시오.</li>
	<li>최고 비 fenestrated 드 레이프에서 부정사 자리에 무 균 운영 테이블에 마우스를 전송 합니다. 그냥 마우스 복 부를 overlying 드 레이프에 2 x 2 cm2 창문 내기를 잘라.</li>
	<li>Povidone-요오드 70% 에탄올 복 부 살 균 거 즈 또는 코 튼 볼을 사용 하 여 다음 적용 됩니다.</li>
	<li>가 위 치아와 아이리스 미세 집게를 사용 하 여, 3-4 cm 수직 복 부 피부 절 개를 중간, 중간의 왼쪽에 0.5 cm에 평행 하 게 참고: 오른쪽 신장 제거 하려고,이 중간의 오른쪽에 0.5 c m 절 개 될 것입니다.<ol>
<li>아이리스가 위로 복 부 캐비티를 입력 incise을 치아 없이 좋은 집게와 복을 잡고. Hemostats 피부와 긴장을 옆으로 배치 하 고 노출 강화 복의 뛰어난 및 하 부 측면 가장자리에 적용 됩니다.</li>
		<li>섬세 하 게 노출 왼쪽된 신장에 복 부의 오른쪽 장 내용 이동. 부드럽게 복 부의 상승 신장에 견인 장소.</li>
		<li>왼쪽된 신장 hilum 걸쳐 hemostat 장소. 아이리스가 위를 사용 하 여 transect ureter과 신장 혈관.</li>
		<li>1% 왼쪽된 신장 에서도 얼음에 페니실린/스 DPBS 솔루션.</li>
		<li>포함 하는 메 마른 조직 문화 후드에 신장 튜브를 전송 합니다. 15 mL 원뿔 튜브의 신장 60 mm 페 트리 접시 (그림 1)에 전송. 칼슘과 마그네슘 5 mL DPBS를 사용 하 여 두 번으로 하는 린스 신장 5 ml DPBS 60 mm 접시에 일시 중지 하십시오.<ol>
<li>5 mL DPBS 기정 프로토콜 중 사용할 수와 함께 추가적인 60 mm 페 트리 접시를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>승인 된 IACUC 동물 프로토콜에 따라 thoracotomy와 신장, 조달 다음 exsanguination 마우스를 안락사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. murine 신장 서 신장 세그먼트 격리에 대 한
<ol><li>메 마른 기술 프로토콜, 메 마른 장갑, 수술 용 마스크를 포함 하 여의이 부분에 대 한 사용 하 여 계속 bouffant 오염 위험을 최소화 하 고.<ol>
<li>장소 살 균 영역 왼쪽 및 오른쪽 현미경의 악기에 대 한 멸 균 분야에 뿐만 아니라 스테레오 현미경 플랫폼에 커튼. 현미경 초점 손잡이에 플라스틱 접착 시트를 배치 하 고 70% 에탄올 스프레이. 무대를 빛 듀얼 목이 조명 기를 켭니다.</li>
		<li>오픈 소독된 악기 (치아, 메스 핸들, #15 메스 블레이드, 두 직선 hemostats, 두 30½ 없이 미세 집게 게이지 빈 구멍 바늘) 무 균 커튼에. 메스에 장소 #15 블레이드 지금 처리 하 고 각 바늘 어댑터/허브 그림 1에서 보듯이 나중 사용을 위한 바늘 절 개 악기를 만들려고 한 hemostat를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 mm 페 트리 디쉬, 포함 하는 DPBS와는 다른 유일한 DPBS, 현미경 영역 조직 문화 후드에서 신장 하나를 이동 합니다.<ol>
<li>목표 아래 60 mm 페 트리 접시를 놓고 신장 폭로 뚜껑을 제거 합니다. 나중에 사용에 대 한 멸 균 분야에 포함 하는 DPBS 접시를 옆에 둡니다.</li>
		<li>만 신장의 앞쪽 또는 후부 표면 (즉, 접시의 바닥을만 지 다른 얼굴로 신장의 대형 평면 얼굴) 보기에 접시를 이동 합니다. 절차의이 부분에 대 한 3.2-4 배속 줌. 비 지배적인 손을 사용 하 여, 통과 하는 신장 신장 열 등 하 고 우량한 극 근처 요리에 대 한 핀 치아 없이 미세 집게를 사용 합니다.</li>
		<li>신장 핀 장소에 비 지배적인 손을 계속. 지배적인 손을 가진 #15 블레이드를 사용 하 여 노출 된 표면에서 반투명 섬유 capsular 레이어를 제거 하. 신장 캡슐의 나머지를 제거의 노출 된 표면에서 가장 천박한 0.5 m m를 면도.</li>
		<li>#15 블레이드를 사용 하 여 조직의 약 2 m m3 크기에서, decapsulated 지역에서 거꾸로 피라미드 해 부. DPBS만을 포함 하는 60 m m 접시를 검색 하 고 깨끗 한 접시에 조직의 피라미드를 배치. 신장에의 나머지를 삭제 합니다.</li>
		<li>해 부의 나머지 부분에 대 한 1.5-2.0 X 확대를 감소. 때까지 조직 세그먼트 바늘 팁의 직경 보다 작거나 조직 조각 점차적으로 작은 조각으로 슬라이스 절단 악기 두 hemostat 바늘 악기를 사용 하 여. 크기의 신장 조직 2 m m3 는 50 개 이상의 세그먼트를 한 번 완전히 해 부를 생산할 예정 이다.</li>
		<li>조직 문화 후드에 신장 세그먼트와 60 mm 접시를 이동 합니다. 1000 µ L 피 펫 사용 DPBS를 제거 합니다. 5 mL DMEM, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충을 추가 합니다.</li>
		<li>문화 인큐베이터 또는 세포에 이식에서 37 ° C에서 3 일 동안 즉시 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 신장 세그먼트 세포질 구조 제조
<ol><li>문화 정상적인 인간 피부 섬유 아 세포 (NHDF) 그리고 인간의 지방 microvascular 내 피 세포 (HAMEC)를 105 fibroblasts x 7.2와 1.8 x 10 원하는 구조 당5 내 피 세포 몇 주 동안. 조직 문화 후드에서 agarose 금형 미리 혈관 비 계 없는 내 피 섬유 구조 (사양) 앞에서 설명한 Czajka 에 의해 형성에 막대 모양의 우물으로 (4:1) 내 피 세포를 섬유 아 세포의 적절 한 비율 씨 외 19.</li>
	<li>멸 균된 hemostat, 30½ G 바늘 및 플랫 엔드 메 마른 주걱 얻을.<ol>
<li>발음 및 신장 세그먼트를 제거 하지 않도록 주의 되 고 신장 세그먼트를 포함 하는 60 m m 플레이트에서 미디어의 대부분을 제거 합니다.</li>
		<li>세그먼트의 주입을 시각화 하기 위해 외과 Loupes 장비.</li>
		<li>10-15 세그먼트를 얻을, 주걱의 매우 끝에 따라 균등 하 게 퍼져 60 mm 접시의 바닥을 따라 부드럽게 주걱의 끝을 다쳤어요. 사양 시드 했다 잘의 입술에 최대한 가깝게 주걱의 끝을 놓습니다.</li>
		<li>우물의 가장자리를 주걱 끝에서 각 개별 세그먼트를 이동 하려면 다른 손에 hemostat 30½ G 바늘 악기를 사용 합니다. 부드럽게 잘 사용 하는 약간 이전 시드 세포 현 탁 액에 빠져들 때까지 바늘 팁에 아래로 각 세그먼트를 이동 합니다.</li>
		<li>2에서 신장 세그먼트 사양 문화: FGM-2/EGM-2/DMEM 매체 (2.5 mL 전체 볼륨)의 1:1 비율. 3 일 문화 미디어 모든 24 h를 변경 합니다. 구문에서 72 h 형에서 제거 하 고 수정 또는 플래시-동결 처리를 위해.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

메서드 구문 두 종류의 세포와 생체 재료 활용, 그리고 많은 경우에,에 관해서는 넓게 변화 신장 조직 생활 하는 데 사용 되는 오래 된 또는 하지 잘 성격을 나타낸 문학7. 많은 줄기 세포 접근을 사용 하는 또는 업과 고립에서 신장 아키텍처의 개별 구성 요소, 인위적으로 세포 현 탁 액에서 26 다른 차별화 된 세포 유형으로 전체 기관 재현의 전망 21고려를 압도. ...

만성 신장 병 (CKD)는 현재 중요 한 공중 위생 도전 전세계1중 하나입니다. 미국에서 CKD의 보급은 가장 심각한 형태, 끝 단계 신장 질병 (ESRD)2에서 고통 이상 600000 미국인과 전체 인구의 14% 이상. ESRD 있는 사람들을 위해 사용할 수 있는 현재 치료 옵션 포함 투 석 및 신장 이식. 약 25000 환자가 신장 이식 매년 받아야, 비록 환자 수가 매년 인명 기관 및 그 수신 이식3를 기다리고 그 사이 큰 차이가 이어지는 추가 됩니다. 장 수 및 삶의 질에 심각한 부정적인 영향, 뿐만 아니라 투 석 놀라운 금융 부담으로 연결 됩니다. 2014, 메디케어 클레임을 지불 ESRD 환자2$30 십억 이상 합계 했다. 제한 된 장기 공급 및 환자 투 석 요구에 아무 명백한 하향 추세, 연구 노력 투를 대체 솔루션 식별 목적으로 하 고 이식도 중요 하다. 투에 대 한 필요에도 비교적 짧은 지연 투 석 관련 비용4,,56을 연기 하는 동안 환자 수 질 조정 된 생활 년 및 생산성을 실질적으로 증가 합니다.
있으 나 ESRD에서 그런 기능 조직 손실에 대 한 솔루션 전체 기관 공학 사용 하 여 비 계 기반 organoid 제조에서까지 널리 다양 한 접근법과 조직 공학 및 재생 의학 연구소에서 현재 공부 되 고 있다 오르간 구조 세포 이식7,,89,10,11decellularized 업과 한계 또는 폐기 신장에서 복잡 한 신장 구조는 부분적 으로만 조사. 사실, 거의 20% 신장 이식에 대 한 조달의 다양 한 이유로12,13에 대 한 삭제 됩니다. 이러한 상 상속 이식에서 신장 기능 조직 활용 고 하나 또는 여러 조직 설계 구조에 통합 될 수 있습니다. 사전 연구 신장 조직 공학 목적14,15엑스트라 세포 매트릭스를 활용 하 여 이러한 폐기 장기 사용의 타당성을 설명 했다. 그러나, 몇 가지는 사용 건강 한 신장에서 기본 nephronal 조직 조직 공학 목적16,,1718.
이전 김 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 한 가지 방법은 다음 polyglycolic 산 (PGA) 건설 기계 구조물 제작16에 시드 했다 건강 한 쥐 신장에서 신장 "세그먼트"의 분리를 포함 한다. 그러나, 작은 정보 정확한 해 부 방법론에 관한 부여 되 고 세그먼트 잘 닦지 및 여과의 조합에서 입수 했다. 우리는 마찬가지로 그대로 nephronal 아키텍처, 개별 신장 세그먼트 하지만 기정 기법에 의존 하는 대신이 프로토콜의 설명. Nephrectomies는 살아있는 성인 생쥐, 신장 어디 신장 캡슐을 제거 하 고 조직을 더 해 부 해 부 현미경을 전송 후에 수행 됩니다. 작은-내경 30½ G 바늘 절삭 악기로 사용 되 고도 가이드 해 부에 은닉, 바늘으로 직경은 신장 세그먼트의 대상 직경. 격리 된,이 경우 murine, 신장 세그먼트 문화에서 생존을 유지 하 고 비 계 없는 내 피-fibroblast 세포 구조19통합. 이러한 구문은 이전 바이오 인공 췌 장20를 포함 하 여 다른 장기를 사용 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Non-fenestrated Sterile Field</td><td>Busse Hospital Disposables</td><td>696</td><td></td></tr><tr><td>Fenestrated Sterile Field</td><td>Busse Hospital Disposables</td><td>697</td><td></td></tr><tr><td>Halsted Mosquito Forceps 5 Curved</td><td>Miltex</td><td>Mil-7-4</td><td>&quot;Hemostat&quot; in manuscript</td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth</td><td>Fine Science Tools</td><td>11155-10</td><td>Fine forceps with teeth</td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Fine forceps without teeth</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Tungsten Carbide</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Iris Scissors</td></tr><tr><td>Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cotton Gauze Pad (4&quot; x 4&quot;)</td><td>Fisher Healthcare</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Solution, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson</td><td>2254845</td><td></td></tr><tr><td>Nair Hair Remover</td><td>Nair</td><td>22600-23307</td><td>Hair Removal Cream in text</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705</td><td>Diluted to 70% Ethanol Solution</td></tr><tr><td>BioLite 60mm Tissue Culture Dish</td><td>Themo-Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>Press&#039;n Seal</td><td>Glad</td><td>12587-70441</td><td>Applied to Stereoscope</td></tr><tr><td>SZX16 Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Illuminator</td><td>Cole Parmer</td><td>41720-20</td><td></td></tr><tr><td>Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23&quot; L Gooseneck</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-41720-60</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>Miltex</td><td>Mil-4-7</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15</td><td>Bard-Parker</td><td>371115</td><td></td></tr><tr><td>31 1/2 Gauge Needle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826F</td><td>Becton Dickinson 305106</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Select 100% Bovine Serum</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FS-0500-AD</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Dermal Fibroblasts</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Human Adipose Microvascular Endothelial Cells</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>7200</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Loupes (2.5x)</td><td>Orascoptic</td><td>(N/A) Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)</td><td>Lonza</td><td>CC-3131, CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)</td><td>Lonza</td><td>CC-3156, CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin-18 Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Von Willebrand Factor Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>BD Pharmingen</td><td>561908</td><td></td></tr><tr><td>Background Buster</td><td>Innovex Biosciences</td><td>NB306</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissection of primary renal tissue segments and incorporation with novel scaffold-free construct technology

신장 이식 이제 끝 단계 신장 질병을 위한 주류 치료 이다. 그러나, 대기자 명단 이식 달성이 환자의 단지 1 / 4에 대략 96000 명, 기관 실패와 그에 대 한 대안에 대 한 절박 한 필요가 있다. 그것은 지불 해야 하는 전체 의료 비용 함께 투 석의 해로운 결과 감소, 활성 조사 기관 이식에 대체 솔루션을 찾아 진행 중 이다. 이식 조직 설계 신장 세포 구조 등 가능한 방식을 한 손실된 신장 기능을 대체 있습니다. 여기, 처음으로 설명입니다 생활 corticomedullary의 격리 murine 신장 서 신장 세그먼트. 이러한 세그먼트 한번 이식 호스트 맥 관 구조와 신속한 연결 수 있는 비 계 없는 내 피-섬유 구조 내의 급속 한 합동 할 수 있다. 성인 마우스 신장 살아있는 기증자, 200-300 µ m 직경에서 신장 세그먼트를 stereoscope 서 뒤에서 조달 했다. 여러 신장 구조 한 신장에서 수확 기본 신장 세그먼트를 사용 하 여 조작 했다. 이 메서드는 기능 신장 조직 그렇지 않으면 삭제 될 것 입니다에서 구제할 수 있는 절차를 보여 줍니다.

설명 하는 프로토콜 신장 조직의 피라미드 2 mm3 섹션 당 약 50 신장 세그먼트를 생성 합니다. 처리 되 고 몇 군데 신장 세그먼트 다른 비율 ( 그림 2참조) 관 및 사 구성 요소에 있는. 그대로 세그먼트는 3 일 동안 다른 세그먼트 한 번 모든 24 h의 생존 능력을 결정 하기 위하여 분석 결과를 받게 했다. 그린 형광 calcein-오전은 세포내 esterase 활동, ?...

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Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

신장 구조 조직 설계 기관 부족 및 투 석의 해로운 효과 위한 솔루션을 제공합니다. 여기, 우리는 마이크로 프로토콜 설명 cortico 골 수 세그먼트의 격리 murine 신장 해 부. 이 세그먼트는 신장 organoids를 형성 세포 비 계 없는 구문으로 이식.

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

microdissection-primary-renal-tissue-segments-incorporation-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.4K 조회수.  Medical University of South Carolina. 신장 구조 조직 설계 기관 부족 및 투 석의 해로운 효과 위한 솔루션을 제공합니다. 여기, 우리는 마이크로 프로토콜 설명 cortico 골 수 세그먼트의 격리 murine 신장 해 부. 이 세그먼트는 신장 organoids를 형성 세포 비 계 없는 구문으로 이식.

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Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

압축 된 콜라겐에 다진 조직 : 단일 무대 재건 복구를위한 세포 함유 Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

연구

생체공학

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

발생학

<meta charset="utf8"></head><body>미세생리학적 시스템을 이용한 신장암과 건강한 조직 공동 배양

Microfluidic Co-culture of Renal Healthy and Tumor Epithelium to Model Kidney Cancer Progression

Microphysiological systems (MPS) have enabled the introduction of more complex and relevant physiological elements into in vitro models, recreating intricate morphological features in three-dimensional environments with dynamic interactions lacking in conventional models. We implemented a renal cell carcinoma (RCC) co-culture model to recreate the cross-talk between healthy and malignant renal tissue. 
This model is based on the referenced multi-organ platform and consists of co-culturing a reconstructed renal proximal tubule with RCC spheroids. Custom-designed 3D-printed chambers were used to culture human renal epithelial proximal tubule cells (RPTEC) and facilitate their self-assembly into a renal tubule contained in a collagen type I matrix. Caki-1 RCC cells were embedded in an agar collagen matrix, subsequently forming cancer spheroids. Both collagen and agar/collagen gels were optimized to maintain their integrity during cyclic perfusion and withstand shear stress during a minimum culture period of 7 days. 
The gels also enable adequate nutrient supply and cell secretions. Moreover, the agar/collagen gels limit the overproliferation of RCC cells, ensuring relatively homogeneous spheroid size. The MPS chip microfluidic circuits comprise two independent culture chambers with the size of a standard 96-microplate well. The renal tubule and RCC gels populate separate chambers and share the same culture media, which is recirculated approximately twice per minute. Under these conditions, we observed upregulation of immune factor expression and secretion in the renal tubules (interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha). The renal tubules also shift their metabolic activity towards glycolysis under the influence of RCC. This novel approach demonstrates that a co-culture-based MPS can amplify the complexity of RCC in vitro and be employed to study the impact of cancer on non-tumor cells.

<meta charset="utf8"></head><body>신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

Here, we present protocols that detail instructions for implementing 3D cell cultures using collagen and collagen-agarose matrixes in a microphysiological system. These protocols support renal proximal tubule and renal cell carcinoma spheroids co-culture, simulating in vivo conditions and enabling advanced investigation of kidney cancer cell interactions.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

Microphysiological systems (MPS) have enabled the introduction of more complex and relevant physiological elements into in vitro models, recreating ...

암 연구학

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

의학

돼지의 1단계 요로 전환 수술을 위한 콜라겐 골격 접근

Surgical Model for Single-Staged Tissue-Engineered Urothelial Tubes in Minipigs

Reconstructive surgeries are often challenged by a lack of grafting tissue. In the treatment of urogenital malformations, the conventional solution has been harvesting gastrointestinal tissue for non-orthotopic reconstruction due to its abundance to reestablish normal function in the patient. The clinical outcomes after rearranging native tissues within the body are often associated with significant morbidity; thus, tissue engineering holds specific potential within this field of surgery. Despite substantial advances, tissue-engineered scaffolds have not yet been established as a valid surgical treatment alternative, mainly due to the costly and complex requirements of materials, production, and implantation. In this protocol, we present a simple and accessible collagen-based tubular scaffold embedded with autologous organ-specific tissue particles, designed as a conduit for urinary diversion. The scaffold is constructed during the primary surgical procedure, comprises commonly available surgical materials, and requires conventional surgical skills. Secondly, the protocol describes an animal model designed to evaluate the short-term in vivo outcomes post-implantation, with the possibility of additional variations to the procedure. This publication aims to demonstrate the procedure step-by-step, with special attention to the use of autologous tissue and a tubular form.

저자 스포트라이트: 선천성 기형 및 후천적 질환에 대한 재건 수술의 결과 개선을 위한 혁신적인 접근 방식

Tissue-engineered implants for reconstructive surgery rarely progress beyond preclinical trials due to laborious ex vivo culturing, which includes complex and expensive scaffold components. Here, we present a single-staged procedure designed for urinary diversion with an accessible collagen-based tubular scaffold containing autologous micrografts.

Minipigs의 단일 단계 조직 공학 요로상피관에 대한 수술 모델

Reconstructive surgeries are often challenged by a lack of grafting tissue. In the treatment of urogenital malformations, the conventional solution has ...

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요약

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