이 방법은 신장 병의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 특히 정상 및 병이 있는 상태에서 구체의 이해에. 구체 생물학은 존재하는 다양한 세포 모형 및 그들의 유일한 구조 때문에 공부하기 어려울 수 있습니다.
이 기술의 주요 장점은 간단한 방법과 장비를 사용하여 그대로 구사염기의 쉽게 사용할 수있는 소스를 제공하는 것입니다. 이 기술은 정상 및 병은 신장에 여과 장벽의 우리의 이해에 대 한 의미를 가지고. 특히, 구엽 손상이 소변으로 혈청 단백질의 비정상적으로 높은 분비로 이어지는 단백증 만성 신장 질환에 대한 우리의 이해를 밝힐 수 있습니다.
일반적으로, 이 기술에 새로운 개별은 최종 견본에 있는 적당한 수율 그리고 순도를 얻기 어려움이 있을 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 브리트니 러쉬 (Brittney Rush)가 될 것입니다. 시작하려면 헤어 클리퍼를 사용하여 안락사 된 쥐의 앞쪽 복부에서 머리카락을 제거하십시오.
70%에탄올을 사용하여 노출된 피부를 청소하십시오. 그런 다음 외과 가위를 사용하여 피부에 중간 절개를합니다. 내부 장기를 노출하려면 근육 층을 통해 중간 절개를 하십시오.
신장을 찾아 분리하고 행크의 완충 된 소금 용액 또는 HBSS의 30 밀리리터와 멸균 50 밀리리터 플라스틱 원판 튜브에 배치 얼음에 배치. 얼음에 튜브를 멸균 세포 배양 후드로 옮기다. 신장을 얼음 위에 놓인 5밀리리터의 멸균 페트리 접시로 옮기다.
가위와 날카로운 집게를 사용하여 페리엔지방을 제거하고 폐기하십시오. 제거하고 신장을 둘러싼 캡슐을 폐기하려면 작은 피상적 인 절개를 한 다음 날카로운 집게를 사용하여 신장에서 부드럽게 당깁니다. 두 번째 페트리 접시에 5밀리리터의 페트리 접시에 신장을 놓고 각 신장을 중간 처질 섹션을 통해 반으로 나눕니다.
메스를 사용하여 어두운 색상과 중앙 위치로 식별할 수 있는 메둘라를 제거하고 폐기합니다. 주로 신장 피질을 포함하는 나머지 조각을 HBSS의 5 밀리리터와 세 번째 페트리 접시로 옮기. 멸균 면도날을 사용하여 조각의 크기가 1mm 미만일 때까지 또는 페이스트가 형성될 때까지 다진다.
1%BSA PBS를 사용하여 500밀리리터 폐기물 비커위에 180마이크로미터 체의 상단과 하단을 적시면 됩니다. 이 단계는 단백질로 체를 코팅하고 다음 수율을 향상시킬 것입니다 구체의 준수를 감소시키기 때문에 중요하다. 체의 작은 가장자리에 혼합 된 피질을 놓습니다.
10 밀리리터 일회용 주사기의 질감있는 플런저 플랜지를 사용하여 체를 통해 조직을 얼음 위에 놓은 하단 팬으로 머쉬합니다. HBSS를 사용하여 시료 희석을 피하고 체를 헹구기 위해 아래팬에서 유체 수집을 재사용하십시오. 체질이 완성된 후, 조심스럽게 느슨하게 부착 된 글로메룰리를 캡처팬의 바닥에서 HBSS로 체의 바닥을 씻어.
20 게이지 바늘이 장착 된 10 밀리리터 주사기로 하단 팬에서 모든 유체를 분할합니다. 바늘을 통해 유체를 적어도 세 번 아래 팬에 전달합니다. 마지막 컬렉션의 경우, 90 마이크로미터 체를 통과할 준비가 될 때까지 주사기에 액체가 함유된 소동을 유지하십시오.
한편, 1 % BSA PBS로 플러시하고 폐기물 비커로 하부 팬을 씻어. 1%BSA PBS를 사용하여 90 마이크로미터 체의 상단과 하단을 적시고 아래쪽 팬 위에 놓습니다. 주사기의 샘플을 체의 한 가장자리에 적용합니다.
텍스처 플런저 플랜지를 사용하여 이전과 마찬가지로 체를 통해 조직을 mush. 하단 팬의 용액을 사용하여 조직을 세척하고 체의 한 가장자리에서 모든 것을 수집하십시오. 체질이 완료되면, 조심스럽게 느슨하게 부착 될 수있는 어떤 사구를 캡처팬의 바닥에서 HBSS 버퍼로 체의 바닥을 씻어.
하단 팬에서 50 밀리리터 플라스틱 원문 튜브로 모든 유체를 수집합니다. 1%BSA PBS를 사용하여 바닥 팬을 폐기물 비커로 세척합니다. 그런 다음 1%BSA PBS를 사용하여 75 마이크로미터 체의 상단과 하단을 적시면 됩니다.
체는 얼음 위에 놓인 하단 팬 위에 놓습니다. 샘플을 체의 한 가장자리에 쉽게 흐르는 액체로 바하십시오. 최소 20밀리리터의 1%BSA PBS를 폐기물 비커에 넣고 체 바닥을 조심스럽게 씻어 내다.
75 마이크로미터 체의 상단에 남아 있는 글로메룰리를 수집하려면 페트리 접시에 글로메룰리를 수집하는 데 필요한 만큼의 HBSS로 체를 거꾸로 헹구습니다. 체형 사구를 얼음 위에 50밀리리터 플라스틱 원판 튜브로 채집합니다. 섭씨 4도에서 5분간 1800회 G에서 원심분리한 후 파이펫을 사용하여 상퍼를 조심스럽게 제거합니다.
차가운 HBSS의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 샘플을 결합하고 원심 분리를 반복합니다. HBSS의 5 밀리리터에서 글로메룰리를 다시 중단합니다.
총 사구를 계산하려면 유리 슬라이드에 샘플10 마이크로 리터 드롭을 넣고 현미경으로 계산하고 총 수율을 얻으려면 500으로 다중 으로 계산하십시오. 격리 된 구조는 관 구조없이 거의 모든 사구로 메갈리로 이루어져야합니다. 튜블러가 존재하고 다운스트림 응용 프로그램에 영향을 미치는 경우 전체 샘플을 90 마이크로미터 체에 적용하고 그 시점부터 프로토콜을 반복하여 제거할 수 있습니다.
여기서 설명된 프로토콜은 사구를 분리하는 데 효율적이며 최종 서스펜션은 95% 이상의 순도와 관 세그먼트 또는 다른 세포 유형에서 최소한의 오염으로 구체로 밀집되어 있습니다. 이 글로메룰리는 헤마톡시린과 에신 얼룩으로 염색하여 형태를 볼 수 있습니다. 또한 처리 후에도 전체 프로토콜에 걸쳐 구조를 유지합니다.
그(것)들은 온전하고 실행 가능한 podocytes, 심상 세포 및 내피 세포를 유지합니다. 고립된 사구는 생체 병리학에서 시뮬레이션하기 위하여 화학 상해에 드러졌습니다. 특히 사구여장벽의 전하를 방해하는 황산염.
건강한 사구와는 달리, 프로타민 황산염 치료 구엽술리, nephron의 눈에 띄는 감소와 WT1에 대한 긍정적 인 핵의 수를 가지고있다. 전송 전자 현미경 검사법으로 볼 때, 건강한 구체는 전형적인 발 과정을 보여줍니다. 프로타민 황산염 치료 후, 발 과정은 포도시테 부상을 나타내는 길쭉하거나 절제됩니다.
격리된 사구에서 세포 생존가능성을 결정하기 위해, 갈라진 카스파세는 세포증 마커로서 관찰되었다. 칼로메룰리를 고립한 후 0과 1시간에 카스파스 3개가 없었다. 몇몇 세포는 시간이 지남에 따라 점진적인 증가와 함께 2 그리고 4 시간에 세포 사멸의 표시를 보여주었습니다.
세포세포의 가장 많은 수는 24 시간 및 48 시간에 지적되었습니다. 이러한 결과에 따라 대부분의 실험에서 격리된 직후에 격리된 글로메룰리를 사용하는 것이 좋습니다. 이 절차를 수행할 때는 신속하고 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다.
신장이 고립되는 순간부터, 사구는 악화되기 시작합니다. 구물갈기를 더 빨리 분리할수록 포즈, 격리, 조작을 더 많이 해야 합니다. 격리 후, 분리된 사구는 생리적 또는 병리학적 조건을 자극하기 위해 화학적 또는 생물학적 제제에 노출될 수 있다.
그리고 견본은 단백질 또는 RNA 격리, 조직학 또는 면역형광 및 전자 현미경 검사법을 위한 처리일 수 있습니다. 1950 년대에 그것의 개발 이후, 이 기술은 사구 생물학을 공부에 있는 연구원을 원조했습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 정상 및 병이 있는 상태에서 온전한 사구의 형태학적 및 세포 특성을 평가하는 방법을 제공한다.
이 방법은 단백증 만성 신장 질환에 대한 우리의 이해를 돕고 미래 치료의 발달을 도울 수 있습니다.
