AFB, MAV와 NJG 라이언 Quinton 원고와 아드리안 Salic TDRFP NLS 구문에 대 한 의견 감사 하 고 싶습니다. AFB, MAV NIGMS 바이오 약리학 훈련 그랜트 5T32GM008541에 의해 재정 지원 됩니다. NJG은 Shamim Ashraf Dahod 유 방 암 연구 실험실의 일원 이다와 NIH 교부 금 GM117150 및 CA 154531, 카린 Grunebaum 재단, 스미스 가족 보너스 프로그램, Searle 학자 프로그램 그리고 흑색 종 연구에 의해 지원 됩니다. 얼라이언스입니다.

이 프로토콜 비 변형 및 chromosomally 안정 망막 안료 상피 (RPE-1) 셀 라인을 사용 하 여 라이브 셀 이미징 실험에 집중 한다. 그러나,이 프로토콜으로 세포 배양 조건을 필요에 따라 조정 됩니다 어떤 부착 셀 라인에 적응 될 수 있다. 모든 절차는 기관 biosafety 및 윤리 지침을 준수 해야 합니다.
1. 라이브 셀 이미징에 대 한 셀을 준비합니다.
<ol><li>
갓 해 동 하 고 초기 통로 RPE-1 셀 인간의 히스톤 H2B 형광 단백질 (예: H2B GFP), 융합 또는 FUCCI 시스템 (FUCCI 표현 하는 세포를 생성 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜 참조45에서 찾을 수 있습니다)를 표현 사용 mitotic 세포 운명 평가 하기
	<ol>
<li>핵 파열의 주파수 측정, H2B GFP와 단일 핵 지 방화 신호 (NLS TDRFP)를 융합 하는 빨간 형광 단백질의 탠덤 이합체 RPE-1 셀을 사용 합니다. 참고: 3 개의 녹색 형광 단백질의 구조는 단일 핵 지 방화 신호에 연동에서 융합 (GFP3-NLS) 또한 (참조42)에서 파열을 보여 주기 위해 사용 되었습니다.</li>
		<li>적절 한 성장 매체에 10cm 조직 문화 접시에 셀을 유지 합니다. RPE-1 셀에 유지 됩니다 페 놀 레드-무료, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 IU/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 보충 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM:F12).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀에서 매체를 발음, 살 균, 실내 온도 버퍼링 인산 염 분 (PBS) 나머지 매체를 제거 하 고 PBS 발음의 10 mL와 함께 조직 문화 접시를 세척.
	<ol>
<li>0.25%의 2 개 mL를 추가 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 세포를 트립 신, 또는 세포의 대다수는 접시에서 분리 될 때까지 3 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 필요 이상 trypsin에 세포를 보관 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 mL 혈 청 학적인 stripette와 trypsinized 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 분배 하는 완전 한 매체의 10 mL를 추가 합니다.
	<ol>
<li>실내 온도에 3 분 동안 180 x g 에서 원심 분리 하 여 셀을 펠 렛.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발음 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 상쾌한 고 철저 하 게 resuspend 펠 릿 10 ml 신선한 매체의 매체 serological stripette에 아래로 pipetting 부드럽게 하 여.</li>
	<li>
계산 셀46hemocytometer 또는 자동된 셀 카운팅 기계를 사용 합니다.
	<ol>
<li>30, 000 셀/ml 전체 매체의 새로운 원뿔 튜브에 세포를 희석.</li>
		<li>30000 RPE-1 (볼륨 1 mL) 당 세포 12 잘 유리 바닥 (#1.5 두께)의 다음날 (30-50% 합칠) 필요한 세포 밀도 달성 하기 위해 접시 이미징 플레이트. 참고: 항상 장갑과 접시를 처리 하 고는 유리 바닥을 터치 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>때까지 그들은 완벽 하 게 연결 하 고 유리 바닥 이미징 접시에 평평 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 셀 4 h 만큼 적게 첨부할 수 있습니다, 하는 동안 셀 약물 치료와 다음 날까지 몇 군데 되지는 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>
Paclitaxel (디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 용 해) 완전 한 매체와 혼합에 원하는 최종 농도를 철저 하 게 추가 합니다.
	<ol>
<li>완전 한 매체 제어로 사용 하 여 혼자 DMSO의 동일한 볼륨을 준비 합니다.</li>
		<li>따뜻한 셀에 추가 하기 전에 37 ° C에 마약 또는 DMSO를 포함 하는 매체. 이것은 갑작스런 온도 변화로 인해 초점 드리프트를 방지 합니다.</li>
		<li>Paclitaxel 또는 12 잘 이미징 접시의 개별 우물 혼자 DMSO를 포함 하는 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 설정 라이브 셀 이미징에 대 한 현미경
<ol><li>모든 지문 또는 이미지를 방해할 수 있는 먼지를 제거 하려면 광학 청소기 이미징 접시의 유리 바닥을 청소 합니다. 충분 한 광 청소기를 사용 하 여 전체 유리 표면에 젖은.</li>
	<li>유리 하단 접시 이미징 접시 어댑터에서 현미경 단계에, 요리에서 플라스틱 커버를 제거 놓고 유리 올랐다 챔버와 함께 요리를 커버 합니다. 챔버는 5% CO2의 구성 된 공기의 지속적인 흐름을 허용 하도록 밸브를 확인 합니다. 참고:을 축이다 5% CO2, 가스 배관 살 균 물 목욕 주택에 삽입을 통해 이동은. 95% 습도에 equilibrated 될 가스에 대 한 수 있습니다.</li>
	<li>시작/보정 현미경 제어 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 인코딩된 무대. 이 정확한 X Y 좌표를 확인 하 고 초점 드리프트를 방지 합니다.</li>
	<li>단계 대조 광학을 사용 하 여 셀에 집중 하 고 (자세히 설명 참조47) 빛을 집중 하 고 최적의 대비를 제공 하는 Kohler 조명 수행.</li>
	<li>
수집 소프트웨어를 사용 하 여 흰 빛과 모든 형광 채널 사용 되 고 (노출 카메라에 게 75% 픽셀 채도 이상적인, 빛의이 금액은 세포에 독성 제공)에 대 한 최적의 노출 시간을 결정.
	<ol>
<li>수집 소프트웨어를 사용 하 여 여러, 선택 겹치지 시야 이미징 각 우물에서. 셀은 유리 바닥 잘 준수 하 고 50%와 70% 합칠 사이 이미지 영역을 선택 합니다. 이 후속 분석을 어렵게 만들 것입니다 이멀전의 셀의 영역을 피하십시오. 참고: 두 번 같은 셀을 추적 하지 않으려면 각 우물에서 겹치지 않는 시야를 중요 하다. 셀 매우 운동 있다면, 그것은 중앙 점과 함께 하나의 큰 시야를 만들기 위해 다시 스티치에서 밖으로 발산 하는 여러 이미지를 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유지 하려면 모든 포인트 초점에 실험의 기간에 대 한 현미경의 autofocusing 기능을 활성화 합니다.</li>
	<li>Mitotic 세포 운명 평가, 수집 이미지에서 볼 때 각 선택한 필드 마다 10 분에 대 한 최대 96 h. Unperturbed에 유사 분열 정도 20-40 분, 10 분 간격으로 세포 분열 하는 경우를 식별 하려면 충분 한 샘플링을 제공 합니다 따라서 이미징 소프트웨어를 설정 합니다. 일시적인 이벤트 인 핵 파열을 식별 하려면 이미지 마다 5 분을 취득 합니다. 참고: 이미지 수집 소프트웨어를 구동 하는 컴퓨터는 자동 업데이트, 화면 보호기, 및 에너지 절약 모드 비활성화, 이들은 종종 긴 실험을 통해 이미지 수집 방해 수 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>이미징 실험을 시작 합니다. 정기적으로 이미지 수집 비디오의 과정을 통해 원활 하 게 실행 중인 확인 하십시오.</li>
</ol>3. 비디오 분석 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 식별 하
<ol><li>군데 세포 이미징 실험의 과정을 통해 건강 한가 확인 합니다. 실용적이 고 적극적으로 확산 제어 셀 DMSO로 치료 해야 합니다. 참고: 셀을 전시 하는 경우, 긴장의 표시 하지 비디오 quantitate 고 이미징 조건48를 최적화에 초점을 대신. 이미징 스트레스의 증상 blebbing/죽어가는 셀, 셀 첨부/확산에, 실패 하는 및 낮은 mitotic 색인 및 장기간된 유사 분열을 표시 하는 셀을 포함 합니다. 스트레스의 가능한 소스 변동 온도 또는 이미징 챔버 또는 phototoxicity48안으로 CO2 레벨에 포함합니다.</li>
	<li>10 X 20 X 목표와 전체 필드 보기는 이미징 때 개별 셀의 수백 존재할 수 있습니다. 따라서, 정량 지원, 보기의 필드 사용할 수 있는 소프트웨어 도구를 사용 하 여 작은 사분면으로 나눕니다. 각 사분면 내에서 셀을 별도로 (단계 3.3.1–3.6.2에서와 같이) 점수.</li>
	<li>
비디오 분석, 위상 대조 및 형광 이미지를 사용 하 여 병합 된 보기에서 각 셀을 추적 합니다. 소프트웨어 분석 도구를 사용 하 여 병합 된 뷰를 만드는.
	<ol>
<li>비디오의 시작 부분에서 시작, 단일 interphase 셀을 식별 하 고 세포 주기 단계 광학을 사용 하 여 진행률 추적. 단일 셀을 추적 하려면 관찰 셀 프레임을 눈으로 합니다. Interphase 셀 (평가 단계 대조 하 여)로 병합 된 그들의 형태학과 DNA 응축의 그들의 부족 (H2B GFP에 의해 평가)를 식별 (그림 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 (를 사용 하 여 단계 대조 광학) 반올림의 관찰에 의해 유사 분열을 입력 하는 셀을 식별 및 염색체 응축 (H2B GFP를 사용 하 여) (그림 1A-C). 두 셀 반올림 및 염색체 응축 쉽게 눈으로 시각화 됩니다.
	<ol>
<li>주석을 셀 유사 분열은 시간. 그것은 그것의 운명 (3.5 단계, 단계 3.6.1에서 유사 분열에서 세포 죽음 또는 단계 3.6.2 에서처럼 mitotic 미끄럼 anaphase)에 도달할 때까지 셀을 추적 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제어 셀 효율적으로 그들의 염색체를 정렬 하 고 anaphase 1 h (그림 1D) 안에 입력 해야 합니다. 셀 2로 또는 poleward를 이동 염색체 H2B GFP (그림 1A)와 표시의 시각화를 통해 대 타를 시작으로 단계 대조 광학 여 anaphase를 시각화. 주석을 시간 때 셀 anaphase 겪 습.</li>
	<li>
대조적으로, 세포 paclitaxel 치료 몇 시간 (3-40 h) (그림 1B-D)에 대 한 압축 된 염색체를 가진 둥근 유지 됩니다.
	<ol>
<li>세포의 죽음을 받 다 mitotically 체포 셀을 식별 합니다. 참고: 유사 분열 동안에 죽는 세포는 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 시각, 셀으로 bleb, 축소, 또는 파열 (그림 1B). H2B GFP를 이미징 하는 경우 염색체 세포 죽음 동안 또한 조각화 됩니다.</li>
		<li>셀 미끄럼을 받아야 하는 mitotically 체포 셀을 식별 합니다. 참고: 셀 mitotic 미끄럼을 받 다 관찰 된다 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 그들은 interphase에 다시 밖으로 평평 하 고 염색체 anaphase (그림 1C)을 겪고 하지 않고 decondense. Mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀을 일으키 다 큰 tetraploid 셀 그는 종종 multinucleated (그림 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>원래 시야에서 세포를 추적 계속. 보기의 전체 필드를 추적 하는 일단 잘 동일한에서 인수 별도 필드의 보기를 이동 하 고 세포를 추적 계속.</li>
</ol>4. 비디오 분석 셀 운명 Mitotic 미끄럼 다음 식별을
<ol><li>
세포 운명 다음과 같은 mitotic 미끄럼 (3.6.2 단계에서 설명)를 평가 FUCCI 시스템을 표현 하는 RPE-1 셀을 사용 하 여. 단계 대조 이미징, 뿐만 아니라 그것은 빨간 형광 (G1 단계 지표) 및 녹색 형광 (S/G2/M의 지표) 이미지 획득 하는 데 필요한).
	<ol>
<li>FUCCI RPE-1 셀 3.7 통해 3.3 단계에서 설명한 대로 추적 합니다.<ol>
<li>FUCCI 시스템은 제대로 작동 하는지 확인, 해당 컨트롤을 유효성 검사를 적절 하 게 라이브 셀 이미징 데이터의 분석에서에서 빨간색과 녹색 형광 단백질의 대체 식 세포. 제어 셀 G1 에서 S 단계 세포 진행으로 interphase 동안 완전히 핵 녹색 형광을 전시에 완전히 핵 빨간색 형광을 전시에서 전환 해야 합니다. 세포는 유사 분열의 완성을 통해 녹색 형광을 전시 계속 해야 합니다. 유사 분열, 즉시 다음 셀 다시 한번 interphase 동안 완전히 빨간색 형광을 전시 한다. 참고: 형광 흔적49를 사용 하 여 단일 셀의 FUCCI 시스템에서 RFP 및 GFP 형광 강도 계량 방법 존재이 종종 필요는 없습니다 형광 색상 변화는 강력 하 고 눈으로 볼 수 없습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 유사 분열에 체포 하는 셀을 식별 하 고 그들 mitotic 미끄럼을 받을 때까지 3.4 및 3.6.2에 설명 된 대로 추적 합니다. 셀 G1 단계 (그림 2A-C) 빨간색 형광에 유사 분열 동안 녹색 형광을 전시에서 슬립 유사 분열 그리고 interphase로 다시 변경 됩니다.
	<ol>
<li>단계 대조 및 epifluorescent 이미징 사용 하 여 셀 (2D 그림) 그들의 세포 운명 평가 하는 눈으로 미 끄 러이 추적 합니다.<ol>
<li>세포 주기를 다시 입력 하는 셀을 식별 합니다. 이 세포는 빨강-녹색 변화 G1/S 전환 (그림 2A)를 나타내는 FUCCI 시스템을 사용 하 여 형광 식에 의해 식별 됩니다.</li>
			<li>G1 세포 주기 검거를 받아야 하는 셀을 식별 합니다. 이 세포는 지속 되는 붉은 형광의 식으로 식별 된 > 24 h (그림 2B).</li>
			<li>Interphase에 셀을 식별 합니다. 이 세포는 파열/blebbing/축소 위상 대비 영상 (그림 2C)를 사용 하 여 셀에 의해 식별 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 비디오 분석 핵 파열의 주파수를 식별 하
<ol><li>RPE-1 셀 H2B GFP와 TDRFP NLS를 사용 하 여 평가 핵 파열. 위상 대비 영상, 뿐만 아니라 빨간색 형광 (TRITC)와 녹색 형광 (FITC) 이미지를 모두 획득. 파열을 시각화 이미지 마다 5 분을 취득 합니다. 참고: 셀 라인 있는 TDRFP NLS 효율적으로 가져올 핵으로 최소한의 세포질 형광으로 생성에 중대 하다.</li>
	<li>이미지 셀 3.4 통해 3.3 단계에서 설명한 대로. TDRFP-NLS 형광 신호 및 H2B GFP 공동 interphase 동안 지역화 해야 합니다. 유사 분열 (세포 단계 광학 및 염색체 응축 H2B GFP에 의해를 사용 하 여 반올림 하 여 시각)으로, 시 핵 봉투는 침착 하 고 TDRFP NLS 신호 세포질 (그림 3A) 될 것 이다. 유사 분열, 다음 핵은 딸 세포에 개혁 그리고 TDRFP NLS 신호 핵 될 것입니다.</li>
	<li>라이브 셀 이미징에 의해 후속 interphase 동안 딸 세포를 추적 합니다. 주변의 세포질에 핵 지역화 TDRFP NLS의 일시적인 버스트를 관찰 하 여 핵 파열 이벤트를 식별 합니다. 분 이내에, 핵은 복구 되 고 TDRFP NLS 핵 (그림 3A)에 relocalized 것입니다. 참고: 종종, 핵 DNA H2B GFP에 의해 시각 것입니다 볼 수 작은 bleb으로 파열 사이트 밖에 내 다.</li>
	<li>Interphase 동안 파열 이벤트를 받아야 하는 핵의 일부를 점수. 이 분수를 점수, 셀의 총 수는 파열 이벤트를 받아야 하는 셀의 개수를 추적 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

장기 라이브 셀 이미징의 가장 중요 한 측면은 몇 군데 되 고 세포의 건강을 하도록 하 고 있다. 세포 온도, 습도, 및 CO2 레벨에 관한 이하의 조건 등 최소한의 외부 환경 스트레스에 노출 될 필수적 이다. 로 셀 동작50영향을 알려져 있다 스트레스 이미징 photodamage 형광 여기 조명에서 제한 하는 것이 중요 이기도 합니다. Photodamage 제한 하는 것은 여러 가지 방법으로 다른<su...

반대로 mitotic 마약과 긴 단단한 종양의 다양 한 종류의 화학요법 식이요법에 사용 되었습니다 종종 위대한 효능1,2,3를 표시. Mechanistically, 이러한 약물 정상적인 mitotic 진행 하 고 급속 하 게 확산에 mitotic 체포 홍보 암 세포. 그러나, 셀 mitotic 체포에 대 한 응답에서 운명이 매우 변수: 셀의 일부 유사 분열에서 세포 죽음을 겪 습, 하는 동안 다른 유사 분열에서 나가고 interphase tetraploid 셀 (프로세스 라고 mitotic 미끄럼)으로 돌아갑니다4, 5,6,,78. 이러한 interphase 세포 apoptosis를 실행, 영구 세포 주기 검거를 받아야 하거나 입력할 수 있습니다 심지어 다시는 세포 주기4,,56,7,8,9 ,,1011. Interphase, 다시 약물 제거 다음 세포 주기를 입력에에 걸리고 여 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀은 암 세포 인구의 재 출현에 따라서 기여할 수 있습니다. 또한, 세포 유사 분열에서 슬립 tetraploid, 고 홍보는 종양 염색체 불안정 하 알려져 tetraploidy12,13,,1415재발. 세포 운명 안티 mitotic 약물 치료에 대 한 응답에서을 제어 하는 요소를 정의 하는 것은 따라서 현재 치료제를 최적화 하기 위해 중요 한입니다.
이 프로토콜에서 우리가 직접 관찰 하 고 장기간된 mitotic 체포 안티 mitotic 마약 paclitaxel에 대 한 응답에서을 받아야 하는 셀의 운명을 연구 하는 방법을 설명 합니다. Paclitaxel는 설립은 병원에서 치료는 유 방, 난소, 그리고 폐16,17,,1819, 의 그들을 포함 하 여 많은 종양 종류에 높은 효능 입증 20. 주목 나무의 껍질에서 파생 된 식물 알칼로이드는 Paclitaxel microtubules 안정화 및 따라서 그들의 통합과21,22를 방지. Paclitaxel에 의해 microtubule 역학의 감쇄 미치지 않습니다 G1 부터 G2 에서 세포 주기 진행 하는 동안 약 이어질지 않습니다 유사 분열 동안 스핀 들 어셈블리 검사점의 지속적인된 활성화 방해 하 여 kinetochore-microtubule 첨부 파일 (여기 심층에서 검토23,24)25. 결과적으로, anaphase 발병 paclitaxel 치료 세포와 장기 mitotic 체포에서 결과 방지 된다.
이 프로토콜 먼저 라이브 셀 이미징 실험에 mitotic 세포를 식별 하는 방법을 설명 합니다. 유사 분열은 두 눈에 띄는 셀 생물 학적 변경 부착 조직 배양 세포에서 구상 될 수 있다. 첫째, 염색체 핵 붕괴 직전 높은 응집 된다. 동안 종종 표준 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 감지, 염색체 응축 수 더 명확 하 게 검출 될 형광을 사용 하 여 태그를 레이블 염색체 (예: 붙일 표시 된 히스톤 단백질). 두 번째, mitotic 세포는 또한 셀 반올림에 기인 하는 극적인 형태학 변화에 의해 식별할 수 있습니다.
이 프로토콜 것입니다 다음 라이브 셀 이미징 접근을 사용 하 여 장기간된 mitotic 체포를 발생 하는 셀의 운명을 추적 하는 방법을 보여 줍니다. 세포 유사 분열에서 체포 중 세 가지 운명을 겪는 다. 첫째, 세포는 유사 분열 동안에 세포 죽음을 받을 수 있습니다. 이 현상은 죽어가는 세포 축소, bleb, 또는 파열 관찰은 가벼운 현미경 검사 법에 의해 쉽게 시각화 됩니다. 둘째, 세포는 유사 분열에서 종료할 수 그리고 interphase 염색체 분리 또는 cytokinesis 없이 다시 복귀, 프로세스 라고 mitotic 미끄럼. 염색체의 decondensation 또는 쉽게 mitotic 셀 병합이 프로세스를 식별 합니다. 유사 분열에서 슬립 셀도 종종 불규칙 한, 다중 lobed 핵을 표시 하 고 자주 여러 micronuclei5항구. 셋째, 세포 유사 분열에서 체포 anaphase 시작 하 고 긴 지연 후 유사 분열을 진행할 수 있습니다. 드문 높은 약물 농도에, 하는 동안이 동작 체포 셀 스핀 들 어셈블리 검사점을 만족 수 있습니다 또는 스핀 들 어셈블리 검사점은 부분적으로 약화 또는 결함이 있는 제안 합니다. Anaphase 발병 염색체 분리 및 후속 cytokinesis 라이브 셀 이미징 사용 하 여 구상 될 수 있다.
겪고 mitotic 미끄럼에 의해 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀의 운명을 추적 하 라이브 셀 이미징 방법은 또한 설명 합니다. Mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀 후속 interphase에, 튼튼한 G1 세포 주기 검거, 실행 하거나 다시 세포 분열4의 새로운 라운드를 시작 하는 세포 주기를 입력 합니다. Mitotic 미끄럼 다음 세포 주기를 다시 입력 하는 셀의 일부분을 FUCCI (형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기) 시스템을 사용 하 여 접근 방식을 설명 합니다. FUCCI G1/S 전환의 직접적인 시각화 가능 하며 장기 라이브 셀 이미징 생체 외에서 그리고 vivo에서26,27와 함께 사용 될 수 있습니다. FUCCI 시스템은 두 개의 붙일 레이블된 단백질, hCdt1의 잘린된 형태 활용 (chromatin 라이선스 및 DNA 복제 요소 1) 및 hGeminin, 누구의 수준 진동 세포 주기 위치에 따라. hCdt1 (빨간 형광 단백질을 융합) SCFSkp2 G1 단계 어디 그것 복제, DNA를 라이센스 하는 역할을 하지만 E3 유비퀴틴 리가 여 ubiquitinated 동안 높은 수준에서 현재 고 방지 하기 위해 S/G2/M 단계 동안 저하 다시 복제 DNA26의입니다. 대조적으로, hGeminin (녹색 형광 단백질에 융합), hCdt1의 억제제 인 레벨 피크 S/G2/M, 동안 이지만 E3 유비퀴틴 리가 APC에 의해 ubiquitinatedCdh1 G1 에 걸쳐 유사 분열의 끝에 타락 26. 셀 S/G2/M 동안 G1, 및 녹색 형광 동안 빨간색 형광을 전시로 FUCCI 세포 주기 단계, 간단한 형광 판독을 제공 따라서. FUCCI 시스템은 중요 한 사전 (bromodeoxyuridine 얼룩) 등 다른 방법을 통해 증식 세포, 셀 고정 필요 하지 않습니다에 대 한 필요 없이 단일 셀 이미징에 대 한 추가 허용 하기 때문에 약리 세포 인구를 동기화 하는 치료. 이 프로토콜에 설명 하지, 하지만 추가 라이브 세포 센서 또한 G128, DNA 리가 RFP29 및 PCDNA GFP30 센서 helicase B 센서를 포함 하 여 세포 주기 진행을 시각화 하기 위해 개발 되었습니다. S 단계, 및 최근 FUCCI-4 센서는 세포 주기31의 모든 단계를 감지합니다.
마지막으로, 핵 파열을 감지 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다. 최근 연구는 암 세포의 핵 봉투는 불안정 하 고, 하는 경향이 수 있도록 nucleoplasm와 혼합할 하 세포질의 내용을 밝혀 있다. 이 현상, 핵 파열 되 나 DNA 손상 및 타고 난 면역 반응32,33,,3435,36,37, 의 자극을 홍보할 수 있습니다. 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. 핵 파열의 근본적인 원인은 불완전 특징이 유지, 핵 구조에서 변형 핵 파열42의 발생률이 증가 연관 알려져 있다. Paclitaxel 치료의 한 잘 알려진 효과 유사 분열; 다음 기 막히게 비정상적인 핵 구조의 생성 따라서, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 핵 파열을 계량 하는 방법을 설명 합니다, 또한 paclitaxel 치료 핵 파열 이벤트의 빈도 증가 하는 경우를 탐험 하면서. 핵 파열 (예: 탠덤 이합체 핵 지 방화 신호, TDRFP-NLS를 융합 하는 RFP의 반복) 세포질에 핵-타겟 형광 단백질의 관찰된 누설에 의해 감지할 수 있습니다. 이 누설 파열 이벤트의 간단한 정량 가능 눈으로 분명히 표시 됩니다.
이 프로토콜 인코딩된 무대와 autofocusing 소프트웨어 widefield epifluorescence 현미경을 필요 합니다. 인코딩된 단계 자동 소프트웨어 이미징 기간 동안 셀에 초점을 유지 하는 동안 정의 된 X-Y 좌표, 정밀 자동화 된 운동에 대 한 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 장비와 37 ° C에서 셀 5% CO2 습도 유지 필요로 분위기. 이 온도 내에서 전체 현미경을 포함 하 여 달성 될 수 있다 고 분위기 제어 인클로저, 또는 그 로컬 무대 최고 장치를 사용 하 여 온도 및 환경 유지. 이 프로토콜에 사용 되는 단계 대조 목표는 계획 형 석 10 x 0.30의 숫자 조리개와. 그러나, 20 X 목표 단일 초점 평면에서 두 둥근된 mitotic 그리고 평평 interphase 셀을 식별 하기에 충분 한 있습니다. 단계 대조를 수행 하는 경우 (이 방법에 설명 된) 대로 이미징, 커버 수 유리 또는 플라스틱. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경을 사용 하는 경우 빛의 도발은 방지 하기 위해 유리 커버를 사용 하는 것이 필수적입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>phenol red-free, DMEM:F12 media</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3027202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>50-753-3104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well glass bottomed imaging dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>TSZ Chem</td>
			<td>RS036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NC0215085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>In Vivo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7432000201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm polystyrene tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5804R 15 amp Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>97007-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 microliters Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>p1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette Tips</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Galaxy 170S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO17011005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Boy</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H117P1N4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>500-H31XYZE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Digital Camera</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>D10NLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS Elements AR Software</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA LED Illuminator for Fluorescence</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>SOLA-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>Ti-IVS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEP59391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL51000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEL56200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te-C LWD Ph1 Module</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MEH41100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective</td>
			<td>Micro Video Instruments, Inc.</td>
			<td>MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel

라이브 셀 이미징은 직접 시간의 연장된 기간 동안 단일 세포에서 생물 학적 현상을 시각화 하는 데 사용할 수 있는 강력한 기술입니다. 지난 10 년간, 새롭고 혁신적인 기술을 크게 라이브 셀 이미징의 실용성을 향상 했다. 세포는 이제 초점에 보관 하실 수 있습니다 하 고 지속적으로 유지에서 37 °C, 5% CO2 동안 몇 일 동안 셀 문화 조건 군데. 또한, 다른 실험 조건을 나타내는 여러 필드 볼 수 있습니다 취득 될 동시에, 따라서 높은 처리량 실험적인 데이터를 제공 하. 라이브 셀 이미징 직접 시각화 및 동적 셀룰러 이벤트의 시간 정량 함으로써 고정 셀 이미징에 상당한 이점을 제공 합니다. 라이브 셀 이미징 또한 그렇지 않으면 되었습니다 놓친 것 인구 기반 분석을 사용 하 여 단일 셀의 행동에 변화를 식별할 수 있습니다. 여기, 우리 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하기 위해 라이브 세포 이미징 프로토콜을 설명 합니다. Mitotically 여부를 시각화 하는 방법을 체포 유사 분열 또는 interphase에 다시 슬립에서 직접 셀 다 설명 합니다. 우리는 또한 형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기 (FUCCI) 시스템을 사용 하 interphase 셀 mitotic 미끄럼에서 태어난 세포 주기를 다시 입력 할 수 있는 부분을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 핵 파열 이벤트를 식별 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, H2B GFP를 표현 하는 RPE-1 셀 안티 mitotic 또는 차량 제어 (DMSO)로 치료 되었고 라이브 셀 이미징으로 분석. 분석은 100% 제어 mitotic RPE-1 세포의 유사 분열 (그림 1A, 1d)를 입력 한 후 anaphase 22 분의 평균을 시작 밝혔다. 대조적으로, RPE-1 셀 paclitaxel 치료 몇 시간 (그림 1D) 지속 깊은 mitot...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

long-term-live-cell-imaging-to-assess-cell-fate-response-to

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.8K 조회수.  Boston University School of Medicine. 라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

비디오: Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

연구

암 연구학

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis remains incomplete. In vivo models are paramount for metastasis research, but require refinement. Tracking spontaneous metastasis by non-invasive in vivo imaging is now possible, but remains challenging as it requires long-time observation and high sensitivity. We describe a longitudinal combined radionuclide and fluorescence whole-body in vivo imaging approach for tracking tumor progression and spontaneous metastasis. This reporter gene methodology employs the sodium iodide symporter (NIS) fused to a fluorescent protein (FP). Cancer cells are engineered to stably express NIS-FP followed by selection based on fluorescence-activated cell sorting. Corresponding tumor models are established in mice. NIS-FP expressing cancer cells are tracked non-invasively in vivo at the whole-body level by positron emission tomography (PET) using the NIS radiotracer [18F]BF4-. PET is currently the most sensitive in vivo imaging technology available at this scale and enables reliable and absolute quantification. Current methods either rely on large cohorts of animals that are euthanized for metastasis assessment at varying time points, or rely on barely quantifiable 2D imaging. The advantages of the described method are: (i) highly sensitive non-invasive in vivo 3D PET imaging and quantification, (ii) automated PET tracer production, (iii) a significant reduction in required animal numbers due to repeat imaging options, (iv) the acquisition of paired data from subsequent imaging sessions providing better statistical data, and (v) the intrinsic option for ex vivo confirmation of cancer cells in tissues by fluorescence microscopy or cytometry. In this protocol, we describe all steps required for routine NIS-FP-afforded non-invasive in vivo cancer cell tracking using PET/CT and ex vivo confirmation of in vivo results. This protocol has applications beyond cancer research whenever in vivo localization, expansion and long-time monitoring of a cell population is of interest.

We describe a protocol for preclinical in vivo tracking of cancer metastasis. It is based on a radionuclide-fluorescence reporter combining the sodium iodide symporter, detected by non-invasive [18F]tetrafluoroborate-PET, and a fluorescent protein for streamlined ex vivo confirmation. The method is applicable for preclinical in vivo cell tracking beyond tumor biology.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found overexpressed in many diseases, including cancer. TGF-&#946; is strongly implicated in metastasis during late stage cancer progression, activating a subset of migratory and invasive tumor cells. Current methods for signaling pathway analysis focus on endpoint models, which often attempt to measure signaling post-hoc of the biological event and do not reflect the progressive nature of the disease. Here, we demonstrate a novel adenovirus reporter system specific for the TGF-&#946;/Smad3 signaling pathway that can detect transcriptional activation in live cells. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. The use of a fluorescent reporter allows for imaging of live single cells in real-time with direct identification of transcriptionally active cells. Stimulation of infected cells with TGF-&#946; displays only a subset of cells that are transcriptionally active and involved in specific biological functions. This approach allows for high specificity and sensitivity at a single cell level to enhance understanding of biological functions related to TGF-&#946; signaling in vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 transcriptional activity of cells implanted in vivo can be analyzed through conventional IVIS imaging and monitored live during tumor progression, providing unique insight into the dynamics of the TGF-&#946; signaling pathway. Our protocol describes an advantageous reporter delivery system allowing for quick high-throughput imaging of live cell signaling pathways both in vitro and in vivo. This method can be expanded to a range of image based assays and presents as a sensitive and reproducible approach for both basic biology and therapeutic development.

Here, we present a protocol for live cell imaging of TGF-&#946;/Smad3 signaling activity using an adenovirus reporter system. This system tracks transcriptional activity in real-time and can be applied to both single cells in vitro and in live animalmodels.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell lines or increasing its expression with overexpression cell lines. Transient and stable transfection are two methods that are often used for exogenous gene expression. Transient transfection is only useful for short-term expression, whereas stable transfection allows exogenous genes to be integrated into the host cell genome where it will be continuously expressed. As a result, stable transfection is usually employed for research into long-term genetic regulation. Here we describe a simple protocol to generate a stable cell line overexpressing tagged death receptor 3 (DR3) to explore DR3 function. We picked single clones after a retroviral infection in order to maintain the homogeneity and purity of the stable cell lines. The stable cell lines generated using this protocol render DR3-deficient HT29 cells sensitive to antimitotic drugs, thus reconstituting the apoptotic response in HT29 cells. Moreover, the FLAG tag on DR3 compensates for the unavailability of good DR3 antibody and facilitates the biochemical study of the molecular mechanism by which antimitotic agents induce apoptosis.

Establishing a stable cell line overexpressing a gene of interest to study gene function can be done by stable transfection-picking single clones after transfecting them via retroviral infection. Here we show that HT29-DR3 cell lines generated in this way elucidate the mechanisms by which death receptor 3 (DR3) contributes to antimitotics-induced apoptosis.

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth factors and matrix-associated proteins in the microenvironment in vivo. Furthermore, readily available reagents for the modeling of microenvironments in vitro typically utilize complex mixtures of proteins that are incompletely defined and suffer from batch to batch variability. The microenvironment microarray (MEMA) platform allows for the assessment of thousands of simple combinations of microenvironment proteins for their impact on cellular phenotypes in a single assay. The MEMAs are prepared in well plates, which allows the addition of individual ligands to separate wells containing arrayed extracellular matrix (ECM) proteins. The combination of the soluble ligand with each printed ECM forms a unique combination. A typical MEMA assay contains greater than 2,500 unique combinatorial microenvironments that cells are exposed to in a single assay. As a test case, the breast cancer cell line MCF7 was plated on the MEMA platform. Analysis of this assay identified factors that both enhance and inhibit the growth and proliferation of these cells. The MEMA platform is highly flexible and can be extended for use with other biological questions beyond cancer research.

The purpose of the method presented here is to show how microenvironment microarrays (MEMA) can be fabricated and used to interrogate the impact of thousands of simple combinatorial microenvironments on the phenotype of cultured cells.

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.