Name: identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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현재 작품은 HD043680, MH106392, DA013137, 및 NS100624 건강 (NIH)의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 부분 기금 NIH T32 훈련 그랜트 생물 행동 과학에 의해 제공 되었다.

실험 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 사우스 캐롤라이나 대학에 의해 승인 되었다 (연방 보증 번호: A3049-01).
1입니다. 신선한 냉동된 뇌 섹션의 준비
<ol><li>F344/N 쥐 긴장을 사용 하 여: 각 성의 3 쥐 13 개월, 몸 무게 약 320 g.</li>
	<li>5% (sevoflurane의 과다) sevoflurane 농도 조정 합니다. 추가 분에 대 한 중지를 호흡 후 sevoflurane 노출을 계속 합니다.</li>
	<li>목을 벨 쥐 하 고 두뇌를 제거 합니다.</li>
	<li>15 액체 질소에 쥐 뇌 잠수함 s 조직 수확의 5 분 이내.</li>
	<li>-20 ° c에서 1 h cryostat 뇌 equilibrate</li>
	<li>30 µ m 섹션을 잘라내어 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 전송.</li>
	<li>핵 accumbens 지역 Bregma14앞쪽 2.28 m m 약 2.76 m m에서에서 섹션을 선택 하십시오.</li>
	<li>지속적으로 쥐의 stereotaxic 두뇌 구조에 따라 핵 accumbens 영역을 통해 후 각 전구에서 쥐 뇌를 슬라이스.</li>
	<li>샘플 슬라이드에 탑재 합니다. 건조 10 분 동안-20 ° C에서 섹션을 유지.</li>
	<li>즉시 미리 냉장된 4% paraformaldehyde 1 h 4 ° c.에 대 한 슬라이드를 담가</li>
	<li>실 온 (RT)에서 증가 에탄올 그라데이션에서 슬라이드 배치: 50% EtOH 5 분; 70% EtOH 5 분; 그리고 100% EtOH 5 분.</li>
	<li>신선한 100%와 반복 EtOH.</li>
	<li>흡수 성 종이에 슬라이드를 배치 하 고 건조 한 공기.</li>
	<li>장벽 펜으로 각 섹션 주위 방 벽을 그리기 ( 재료의 표참조). 1 분 동안 완전히 건조 하는 배리어를 하자.</li>
</ol>2입니다. 뇌 섹션의 전처리
<ol><li>오븐에 설정 하 고 설정 온도 40 ° c</li>
	<li>전처리 4 시 약 3 방울 (90 µ L)을 추가 ( 재료의 표참조) 각 뇌 섹션 (슬라이드 당 하나의 섹션)에.</li>
	<li>실시간에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어</li>
	<li>신선한 1 x PBS와 실시간 반복에서 1 분 동안 1 x PBS에 슬라이드 잠수함 참고: 슬라이드 1 x PBS 15 분 이상에 체류 하지 해야 합니다.</li>
</ol>3. RNA 제자리에서 교 잡 형광 다중 분석 결과
<ol><li>따뜻한 물 욕조에 40 ° C에서 10 분 동안 대상 조사와 다음 실시간에 멋진</li>
	<li>RNA 시 장소 (예를 들어, 앰프 1-4 층)에서 실시간</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>샘플 조각에 Drd1α 프로브 (C1)의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 2 h 40 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 1-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>슬라이드 1 워시 버퍼 실시간 반복에서 2 분에 대 한 신선한 1wash 버퍼와 잠수함</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>샘플 조각에 앰프 2 층의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 3-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드 잠수함</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 4-플로리다-Alt A 샘플 조각에의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드에서 과잉 액체를 제거 하 고 즉시 장착 시 약의 2 방울의 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 섹션에.</li>
	<li>22 m m 22 m m coverslip 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 뇌 섹션.</li>
	<li>건조까지 2-8 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	<li>Confocal 현미경 켜고 60 X 목표 전환.</li>
	<li>Confocal 현미경으로 Z-스택 이미지를 얻을. 공초점 이미지의 세부 절차에 대 한 보충 비디오를 참조 하십시오.</li>
	<li>핵 accumbens 영역에서 셀을 표시 하는 Drd1α의 이미지 (여기: 488 nm; 방출: 515/30 nm). 참고: 섹션 인큐베이션 단계 사이 밖으로 건조 하는 두뇌를 게 하지 마십시오.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>반 정량적 얼룩 패턴 분석: "개별 점".<ol>
<li>이미지에서 개별 셀을 지정 하려면 DAPI 얼룩 핵 표식으로 수행 합니다. 그러나, 그것은 여전히 핵 세포의 불규칙 한 모양으로 여러 종류의 세포는 뇌 조직의 특정 부분을 분석 어렵다. 여기, 두 경험이 풍부한 연구자 별도로 각 셀 셀 영역을 정의 하는 이미지에서 할당 합니다.</li>
		<li>시각적으로 특정 조건 (그림 1B)를 사용 하 여 셀 당 도트 수에 따라 대표 confocal 이미지 내의 각 셀 점수.</li>
		<li>각 카테고리에 총 셀 수를 결정 하 고 모든 조직 단면도 (그림 2A)와 남성 및 여성에 대 한 각 범주 내에서 세포의 백분율 주파수를 표시 하는 상대 주파수 그래프를 만들 총 셀 수 x100로 나누면 별도로 (그림 2E).</li>
		<li>모든 이전 범주 내에서 셀의 합계를 별도로 셀과 남성과 여성에 대 한 모든 조직 단면도 (그림 2B)에 대 한 누적 횟수를 확인 하려면 총 셀 수 x100 나누어 (그림 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>통계적으로 분석 하는 "개별 점" 얼룩 패턴 (선택 사항).<ol>
<li>여 지 없이 변수 (즉, 낮은 셀 식 (1)에서 가장 높은 셀 식 (9) 각 순위 범주에가 셀 수) 자연에 서 수를 제공 하는 셀 당 도트 수 검사 추가 통계 분석에 대 한.</li>
		<li>검사 후 기술 통계의, 세 가지 주요 방법을 사용 하 여: 벽난로-Haenszel 통계, 맨-휘트니 U 테스트 및 Kruskal-월리스 테스트. 비록 정확한 통계 접근에 의존 될 것입니다 관심, 통계 의사 결정 트리 (그림 4)의 실험 설계 및 연구 질문의 분석 방법에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼룩 패턴에 대 한 관심 (ROI)의 신호 강도 계량: "클러스터".<ol>
<li>다음 수식을 사용 하 여 각 이미지의 신호 강도 계산. 신호 강도 = 투자 수익 이미지-(평균 배경 강도 × 총 이미지 영역)의 총 강도</li>
		<li>셀 당 대략적인 신호 식 계산 ROI 이미지 내의 셀의 총 수를 계산 합니다. 신호 강도/이미지 셀/이미지의 수에 있는 그룹 차이 신호 식/셀에서 본 그룹 차이에 기여할 수 있는 메커니즘을 고려 하는 관심 있을 수 있습니다 (그림 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"클러스터" (선택 사항) 패턴을 얼룩이 지는 통계적으로 분석 합니다.<ol>
<li>신호 식/추가 통계 분석에 대 한 연속 변수를 제공 하기 위해 셀을 검사 합니다. 독립 샘플 t-테스트 및 분산 분석 (ANOVA), 과목 사이의 요인의 수에 따라 두 가지 방법, 디자인에 포함 된 사용 합니다. 통계적 의사 결정 트리 (그림 4)는 가장 적절 한 통계적 접근에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

선언 하는 관심의 없습니다 충돌을 확인 하 고 있습니다.

이 프로토콜에 우리가 현장에서 교 잡 신선한 냉동 두뇌 분할 영역 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR) 지역에서 평가 하의 소설 기법을 설명 합니다. 우리는 또한 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공: "개별 점" 또는 "클러스터".
교 잡 시험 현장에서 성공적인 멀티플렉스 형광 RNA에 대 한 중요 한 단계가 포함 ...

부전 striatal 도파민 시스템의 여러 neurocognitive 질병에서 관찰 하는 임상 증상의 진행에 포함 된다. 도파민 D1 수용 체는 두뇌의 전 두 엽 피 질 (PFC) 지역과 striatal에 존재 하 고 무 겁 게 영향 인지 프로세스1, 작동 메모리, 시간 처리, 및 기관차 동작2,3 등 , 4 , 5 , 6 , 7. 이전 연구는 도파민 D1 수용 체의 변화 주의 적자 과다 장애 (ADHD)8, 정신 분열 증9, 에 neurocognitive 증상의 진행과 관련 된 했다 해명 10 , 스트레스 감수 성11. 특히, 정신 분열 증, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 연구 엽 외피가 있는 도파민 D1 수용 체의 바인딩을 능력 높은 인식 적자와 부정적인 증상11의 존재에 관련 된 표시. 전 두 엽 피 질 도파민 D1 수용 체에 의해 통제에서 흥분 성의 뉴런의 수지상 성장 스트레스 민감성을 완화 한다. 또한, 내측 전 두 엽 피 질 (mPFC) 신경 수용 체 D1의 최저 사회 패배 스트레스로 사회적 회피12향상 시킬 수 있습니다.
여기, RNA 교 잡 제자리에서 신선한-냉동 조직 샘플 셀에 단일 RNA 분자를 시각화의 새로운 기술을 소개 합니다. 현재 기술은 현재 문학 내에서 존재 하는 방법에 비해 여러 장점이 있습니다. 첫째, 현재 프로시저는 조직의 공간 및 형태학 컨텍스트를 유지 하 고 신선한 요구 하는 다른 절차, 조직에 포함 되지 않은 현재 방법으로 결합 될 수 있습니다 있도록 신선한 냉동 조직 샘플에서 수행 되었다. 포 르 말린 고정 및 파라핀 끼워 넣어진 조직에 유사한 절차는 단일 전송 해상도는 RNA 제자리에서 교 잡 기술은13를 사용 하 여 달성 될 수 있다 설명 했다. 우수한 감도 낮은 복사 번호 식으로 다른 핵 산 탐지 방법으로 얻을 수 없는 개별 셀 수준에서 유전자 발현을 비교 하는 기회를 제공 하는 단일 전사 수준에서 RNA의 검출 같은 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기술. 현재 메서드의 단일 대상 RNA 사본에 때 교배 하 고 순차적으로 신호 증폭 분자 검출에의 묶인 매우 구체적인 RNA 프로브를 통해 높은 신호 대 잡음 비율을 사용 하 여 이미지를 유지 하는 또한, 시스템입니다. 마지막으로, 현재 기술 우리의 조사 시스템 관련 마커 단백질에 의해 감지와 같은 단 하나의 클래스를 제한 하는 것 보다는 그것의 특정 대상 독점 프로브, 여러 생물 학적 시스템을 평가 하는 기회 제공 immunohistochemistry 방법입니다.
우리의 연구에서 우리 둘 다 남성과 여성 F344/N 쥐의 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR)에서 평가를이 소설 RNA 제자리에서 교 잡 사용. 교 잡 제자리에서 혁신적인 RNA 우리 모두 다 통풍 관 및 다 출시 동시에 영향을 미치는, striatal 다 시스템의 복잡성에 대 한 우리의 이해를 향상 시키는 메커니즘을 조사를 활성화. 신선한 냉동 뇌 조각 및 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공 절차, 설명: "개별 점" 또는 "클러스터".

<table><tbody><tr><td>HybEZ Oven system</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>317031</td><td>Color channel 1, Green</td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Color channel 2, Orange</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek staining dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precision General Purpose Baths</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Pretreatment 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>ProLong Gold anti-fade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>EZ-C1 software package</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>version 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td><td>version 9.4</td></tr></tbody></table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

중앙 신경 조직에서 D1-알파 하위 수용 체 (Drd1α)은 가장 풍부한 도파민 (DA) 수용 체, 조절 신경 성장 및 개발에 중요 한 역할을. 그러나, Drd1α 수용 체 이상 행동 응답을 중재 하 고 변조 작업 메모리 기능을 기본 메커니즘을 아직 명확 하지 않다. 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 사용 하 여, 현재 연구 식별 도파민 Drd1α 수용 체와 티로신 hydroxylase (TH) RNA 식 핵 accumbens (NAc) 지역과 substantia nigra 지역 (SNR)에 다 관련 회로에서 각각. Drd1α 식은 NAc에 얼룩 패턴 "개별 점"을 보여줍니다. 분명 성 다름 Drd1α 식에서 관찰 되었다. 반면, 일 "클러스터 된" 얼룩 패턴을 보여 줍니다. 일 식에 관한 여성 쥐 남성 동물을 기준으로 셀 당 더 높은 신호 식 표시. 여기에 제시 된 방법을 중앙 신 경계 질환의 진행 하는 동안 변경 내용을 도파민 시스템 장애에서를 조사 소설 현장에서 교 잡 기술을 제공 합니다.

현재의 연구는 관찰 F344/N 쥐 (그림 1A)에서 NAc의 도파민 D1-알파 수용 체 (Drd1α)에서 RNA 식에 대 한 패턴을 얼룩이 지기 "개별 점". 개별 형광 신호 쉽게 확인 하 고 각 셀 내에 단일 RNA 사본을 나타내는 단일 "점"으로 볼 수 있습니다. "이산 점 들" 얼룩 패턴을 표시 하는 NAc에서 이미지에 대 한 우리 반 정량 분석 (그림 1A, <strong class="...

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Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

8.5K 조회수.  University of South Carolina. 핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

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Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

연구

신경과학

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

빠른<em&gt; 현장에서</em세로토닌 증후군 쥐의 파라 포름 알데히드 - 접두사 뇌에 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여&gt; 하이브리드

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된<em&gt; 초파리 Melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

생물학

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

시투 혼성화에서 멀티플렉스를 사용하여 마우스 Vagal afferent 뉴런에서 G 단백질 결합 수용체 발현의 검출

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

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Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출

빠른

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된

시투 혼성화에서 멀티플렉스를 사용하여 마우스 Vagal afferent 뉴런에서 G 단백질 결합 수용체 발현의 검출