Name: magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model at JoVE.com

이 연구는 다음 교부 금에 의해 재정적으로 지원 되었다: 중국의 자연 과학 재단 (No. 81572198; No. 81772394); 심천 대학 (No. 2016031638); 높은 수준의 의료 분야 건설을 위한 기금 광 동성, 중국 (번호의 의료 연구 재단 A2016314); 심천 과학 및 기술 프로젝트 (제 JCYJ20170306092215436; 롤 JCYJ20170412150609690; 롤 JCYJ20170413161800287; 롤 SGLH20161209105517753; 롤 JCYJ20160301111338144)입니다.

모든 동물 실험 지역 윤리 위원회 지침에 따라 실시 했다 그리고 모든 동물성 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 심천 제 2 인민 병원, 심천 대학으로 승인 했다.
1. 격리와 rbSF-MSCs 문화
<ol><li>
동물 절차에 대 한 준비
	<ol>
<li>RbSF의 컬렉션에 대 한 skeletally 성숙 여성 뉴질랜드 백색 토끼를 준비-MSCs. 마 취와 arthrocentesis 절차 전에 어느 날 토끼의 임상 시험 수행. 참고: 검 무게 (2.0-2.5 k g), 성별 (여성), 고 체온, 호흡 속도 심장 박동을 포함 해야 합니다. 임상적으로 건강 한 토끼에 대 한 매개 변수 간격 있으며 호흡 속도 대 한 30-50 분, 심장 박동에 대 한 220-280 분 38-39 ° C 온도 대 한.</li>
		<li>동물 마 취 전에 6 h에 대 한 빠른.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비 및 동물 마 취에 대 한 절차
	<ol>
<li>감 금 소를 가진 토끼를 억제 ( 재료의 표참조), 다음 3 %pentobarbital 나트륨 전신 마 취에 대 한 1 mL/kg의 복용량에 한계 귀 정 맥에 주사 하 고.</li>
		<li>토끼 편안한 휴식 등 쪽 위치에 놓습니다.</li>
		<li>마 취 동안 토끼의 체온, 심장 박동, 호흡 속도 모니터링 합니다.</li>
		<li>그것의 눈에 안과 연 고를 사용 하 여 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해.</li>
		<li>Guedel의 분류14다음 마 취의 깊이 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MSCs 절연 및 재배에 대 한 준비
	<ol>
<li>RbSF-MSCs를 육성, 상업 문화 매체의 500 mL 준비 보충 ( 재료의 표참조) 10% 상업 보충 ( 재료의 표참조), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1% 페니실린-스.</li>
		<li>물 욕조에 37 ° C에서 배양을 품 어.</li>
		<li>세포 분리 및 세포 세척에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>무릎 구멍 arthrocentesis 절차에 대 한 100 mL isotonic 식 염 수 솔루션의 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
토끼의 무릎에서 관절 활 액 흐름이 uid의 컬렉션
	<ol>
<li>크기는 무릎 주위에 지역 약 5 x 5 cm를 선택 하 고 안전 전기 면도기를 사용 하 여이 영역에서 토끼 머리를 면도.</li>
		<li>또는 소독 절차 사이트 3 povidone 요오드 솔루션 및 75% 에탄올 x. 영역은 완전히 말린 후, 무 균 커튼 적용.</li>
		<li>3-4 x, isotonic 식 염 수 솔루션을 사용 하 여 살 균 피하 주사기 (2 mL), 측면 관절 공간에서 무릎 관절 구멍으로 무릎을 이동 1-2 mL를 주사 하 고 실 온에서 모든 활 액 액체를 빨 아.</li>
		<li>4 h 이내 어떤 파편 든 지 제거 하 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 synovial ﬂuid를 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF-MSCs의 문화
	<ol>
<li>50 mL 원심 분리기 튜브에 실 온에서 10 분 원심 1500 rpm에서 필터링 된 ﬂuid를 수집 합니다.</li>
		<li>원심 분리 후에 상쾌한 삭제, PBS 가진 펠 릿을 세척, 완전 한 문화 매체와 펠 릿 resuspend 그리고 접시 100mm 요리에서 매체.</li>
		<li>37 ° c 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 요리를 품 어.</li>
		<li>48 h 후 어떤 비 부착 한 세포를 제거 하는 신선한 매체와 요리를 보충. 대체 매체 통로 0 (P0)으로 2 주 동안 일주일에 두 번. 참고: 약 1 × 104 부착 셀을 하 고 있어야 합니다. SF에서 가능한 셀/ml은 약 2 × 102/mL.</li>
		<li>14 일 후 초기 도금 따르고, 많은 식민지 문화 요리에서 형성 해야한다. 직경에서 2 m m 보다 큰 식민지를 선택 합니다. 선택 된 식민지 접시 바닥에 그들의 둘레를 추적 하 여 위치를 표시 합니다.</li>
		<li>식민지 < 2 폭 mm, 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 삭제 합니다. 복제 실린더를 사용 하 여 0.25 %trypsin 약 5 µ L로 선택 된 식민지를 소화 하 고 통과 1 (P1)로 새로운 접시에 식민지를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술 동물 치료
	<ol>
<li>수술 후 모니터링 및 마 취에서 회복 기관 표준 운영 절차를 따르십시오.</li>
		<li>의식 회복 될 때까지 10 분 마다 토끼의 생체 신호를 모니터링 합니다. 마지막으로, 의식 동물 케이지 전송. 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 수술을 겪고 있다 토끼를 반환 하지 않습니다.</li>
		<li>후 작업, 0.1 %povidone 요오드, 2 3 일 동안 하루 x 사이트를 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90 긍정적인 자기 활성화 셀 정렬 (맥) rbSF-MSCs 및 주 문화
<ol><li>
샘플 준비
	<ol>
<li>80 %confluency, 매체, 발음 한 다음 0.25%의 1-2 mL을 추가 셀 주위에 도달 하는 때 각 요리에 트립 신-EDTA.</li>
		<li>셀 분리 수 있도록 2-3 분 요리를 품 어.</li>
		<li>세포 분리는 일단 비활성화는 트립 신 문화 매체의 동일한 금액을 추가 합니다.</li>
		<li>40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 통과, 15 mL 튜브에 여과 액을 수집 하 고 실 온에서 10 분 600 × g에서 셀 아래로 회전.</li>
		<li>버퍼를 실행 하는 맥에서 셀 펠 릿 resuspend (PBS, pH 7.2, 0.5% 소 혈 청 알 부 민와 2 mM EDTA) 및 셀 수를 계산 하는 다음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마그네틱 라벨 참고: 자기 활성화 셀 정렬 열, 서, 및 구분 기호 ( 자료의 표참조)를 포함 하는 키트 rbSF-MSCs를 정렬 합니다.<ol>
<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 300 × g에서 세포 현 탁 액을 원심 완전히는 상쾌한 발음.</li>
		<li>107 총 셀 당 물의 resuspension 버퍼의 80 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>107 총 셀에 대 한 단일 클로 널 항 토끼 CD90 항 체로 활용 하는 microbeads의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 15 분 동안 4 ° C에서 그들을 품 어 다음 자석 구슬 및 셀 튜브에 균등 하 게 섞는다.</li>
		<li>튜브, 107 셀 당 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 셀을 씻어 4 ° C에서 10 분 동안 300 × g에서 원심. 원심 분리 후에 상쾌한 폐기.</li>
		<li>107 셀 당 버퍼의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
자력 분리
	<ol>
<li>장소는 열 열 자석 분리기의 자기장으로 앞에 날개.</li>
		<li>107 셀 당 버퍼의 500 µ L 자석 분리기 (MS) 열을 씻어.</li>
		<li>열에 단일 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 이러한 레이블이 셀을 삭제 하는 자기장을 통과 하는 부정적인 세포를 하자.</li>
		<li>107 셀 당 열 버퍼의 500 µ L 1-2 x를 세척 하 고 흐름을 통해 삭제.</li>
		<li>원심 분리기 튜브 (15 mL)에 열을 전송 합니다.</li>
		<li>107 셀 당 버퍼의 1 mL는 열을 추가 하 고 즉시에 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시 열에 플런저를 밀어.</li>
		<li>CD90의 순도 높이기 위해 두 번째 MS 열 상기 절차 반복+ 세포, eluted 분수의 질을 높일 수 있습니다.</li>
		<li>10 분 동안 300 × g에서 세포 현 탁 액을 원심, 상쾌한, 발음 그리고 문화 매체와 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화는 CD90의+ rbSF-MSCs
	<ol>
<li>마그네틱 활성화 된 세포 분류 후 100 mm 접시에 셀을 예방.</li>
		<li>5% CO2습도 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 요리를 품 어.</li>
		<li>주 문화의 합류 점 80-90% 달성, 약 7-10 일 때 0.25% Trypsin EDTA와 통로와 부착 세포 소화 통로 2 (P2)을 1:2 희석에 그들.</li>
		<li>통과 셀 통로 3 (P3), 체 외에서 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 동일한 메서드를 사용 합니다. 참고: 하위 문화 정화 후 약 1 x 107 rbSF-MSCs 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. rbSF-MSCs의 식별
<ol><li>
Cytometry에 의해 rbSF MSCs의 표면 표식 확인
	<ol>
<li>MSCs P3에 80-90% 합칠 때, PBS로 세포 세척 하 고 0.25%의 1 mL와 함께 그들을 치료 트립 신-EDTA. 그런 다음 셀 분리 될 때까지 2-3 분 동안 37 ° C에서 MSCs 품 어.</li>
		<li>PBS의 10 mL를 사용 하 여 셀을 수확, 원뿔 튜브 (15 mL)에 그들을 전송 하 고 실 온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심.</li>
		<li>supernatants 삭제 합니다. PBS의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
		<li>FITC 활용 및 PE 활용 된 항 체의 (isotype, FITC CD34/PE CD45, FITC CD105/PE CD44) 4 ° c.에 어둠 속에서 1 시간에 1: 100 희석을 품 어</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 300 × g에이 혼합물을 원심 고 PBS로 두 번 셀 때마다 5 분 300 × g에서 원심 분리 하 여 세척. supernatants 삭제 합니다.</li>
		<li>PBS의 500 µ L에 셀 resuspend, 라운드-하단 튜브 (5 mL)에 세포 현 탁 액 전송 및 교류 cytometer를 사용 하 여 분석. 참고: 두 개의 형광 채널을 갖춘 cytometer에서 데이터 수집: 533/30 고 585/40. 각 isotype 형광에 isotype 컨트롤을 사용 하 여 적절 한 레이저 전압을 조정 하 고 피크의 왼쪽 및 오른쪽 가장자리를 표시 하는 형광 막대 그래프를 얻을 하는 데 필요한 최소 강도 설정 합니다. 통계 분석에 대 한 10000 이벤트의 최소를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF-MSCs의 multidifferentiation 참고: 사용 P3 rbSF-MSCs는 생체 외에서 multidifferentiation 분석 실험에 대 한.<ol>
<li>
Osteogenic 차별화
		<ol>
<li>Osteogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1x) L-아 스 코르 빈 산-2-인산 염, α-glycerophosphate의 10 m m 100의 50mm 포함 dexamethasone의 nM.</li>
			<li>6 잘 조직 문화 접시에 103 셀/c m2 에서 셀 씨 고 osteogenic 유도 매체에 문화.</li>
			<li>3 주 동안 3 일 마다 유도 매체를 변경 합니다.</li>
			<li>분화가 완료 된 후 실 온에서 30 분 동안 4% 포름알데히드와 셀을 수정, 셀 얼룩 5 분, 그리고 다음 세척 그들 3에 대 한 1% 알리자린 레드 PBS15x.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Adipogenic 차별화
		<ol>
<li>Adipogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1 x) indomethacin의 100 m m, 재조합 인간 인슐린의 10 mg/mL, dexamethasone의 1 m m와 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine의 구성 된.</li>
			<li>Adipogenic 유도 매체에 3 주 동안 P3 rbSF-MSCs를 취급 합니다.</li>
			<li>3 주 후, 기름 빨간 O를 사용 하 여 adipogenic 차별화를 확인 하는 중립 지질 그들을 얼룩. 실 온에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 셀을 수정 하 고 그들을 씻어 다음 PBS163 배.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Chondrogenic 차별화
		<ol>
<li>Chondrogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1 x)으로 구성 된 TGFβ1, 1%의 10 ng/mL의 그것의 보충, L-프롤린, 100 nM dexamethasone의, 나트륨 pyruvate의 L-아 스 코르 빈 산-2-인산 염, 및 1 m m의 50mm의 0.35 m m.</li>
			<li>펠 릿 chondrogenic 유도 배양을 사용 합니다. 5 × 105 P3 rbSF-MSCs는 펠 릿을 형성 하는 폴 리 프로필 렌 튜브 (15 mL)에서 10 분 1500 rpm에서 원심</li>
			<li>Chondrogenic 유도 매체와 3 주 동안 알 약을 문화.</li>
			<li>3 주 동안 3 일 마다 매체를 변경 합니다.</li>
			<li>3 주 유도 후 파라핀으로 셀 펠 릿을 포함, 4 m m 조각으로 섹션 및 0.1%를 사용 하 여 얼룩 톨루이 블루 실내 온도17시 30 분.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
총 RNA 추출 및 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석
	<ol>
<li>분리 상업 RNA 적 출을 사용 하 여 3 주 분화 유도 후 세포의 총 RNA 키트 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>문화 접시에 있는 문화 매체를 제거 하 고 격리 시 약의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>솔루션은 동 질 때까지 반복 pipetting으로 세포를 lyse. 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
			<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.</li>
			<li>클로 프롬의 100 µ L을 추가 하 고 손으로 15 x, 그것을 흔들어 3 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
			<li>4 ° c.에 15 분 동안 12000 × g에서 관을 원심 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관으로는 supernatants 전송.</li>
			<li>소 프로 파 놀의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 RNA 침전.</li>
			<li>12000 × g에서 원심 분리기는 10 minat 위한 4 ° c. RNA 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 표시 되어야 합니다.</li>
			<li>제거는 상쾌한 고 75% 에탄올 500 µ L를 추가 합니다. 짧게 RNA 펠 릿을 세척을 몇 초 동안 튜브를 회전 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 7500 × g에서 원심</li>
			<li>잔여 에탄올을 제거 합니다.</li>
			<li>DEPC 물 10 µ L에서 RNA 펠 릿을 녹이 고 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>반대로 cDNA DNA 합성으로 총 RNA 녹음 키트 ( 재료의 표참조). 참고: 얼음에 모두 다음 절차를 수행 합니다.<ol>
<li>반전 녹음 방송 마스터 믹스를 준비 합니다.</li>
			<li>RNA의 1 µ g 각 튜브를 DNase 취급 RNA의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>PCR 열 cycler를 사용 하 여 다음과 같은 온도에서 혼합물을 품 어: 26 ° C (anneal 하 임의 hexamers 수 있도록) 10 분, 45 분 (반전 녹음 방송)와 75 ° C 10 분 (비활성화는 역전사) 42 ° C.</li>
			<li>즉시 분석 정량 실시간 PCR에 의해 결과 cDNA 또는-20 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
		</ol>
</li>
		<li>실시간 정량 PCR 시스템과 유전자 표정 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>QRT-PCR 주인 혼합 사용 ( 재료의 표참조) PCR을 수행 하. GAPDH, Runx2, Agg를 가진 PCR 뇌관은 표 1에 나열 됩니다.</li>
			<li>유전자 발현 2−ΔΔCT 메서드를 사용 하 여 계산 합니다.</li>
			<li>표준 통계 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 독립 표본 t-검정을 사용 하 여 그룹 방법 비교.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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C. W., Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+isolate+and+purify+human+bone+marrow+stromal+stem+cells.">A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells.</a> Mesenchymal Stem Cells. , 45-57 (2008).</li><li>Krawetz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+progenitors+expressing+CD90++from+normal+but+not+osteoarthritic+joints+undergo+chondrogenic+differentiation+without+micro-mass+culture.">Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture.</a> PLOS One. 7 (8), e43616 (2012).</li><li>Ogata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+human+synovium+mesenchymal+stem+cells+as+a+good+resource+for+cartilage+regeneration.">Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration.</a> PLOS One. 10 (6), e0129096 (2015).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells:+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Gauci, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+chondrocyte+hypertrophy+in+growth+plate+and+osteoarthritic+cartilage.">Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interact. 8 (4), 308 (2008).</li><li>Cooke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+three-dimensional+co-culture+of+mesenchymal+stem+cells+with+chondrocytes+promotes+chondrogenic+differentiation+without+hypertrophy.">Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).</li><li>Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+articular+chondrocytes+secrete+parathyroid+hormone-related+protein+and+inhibit+hypertrophy+of+mesenchymal+stem+cells+in+coculture+during+chondrogenesis.">Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

활 액 액체에 MSCs의 존재 휴대에 기초를 둔 치료에 대 한 대안을 제공합니다. 이전 연구 부상 사이트 후 부상 기간5와 긍정적으로 상관 될 수 있습니다 그들의 활 액 액체에 중간 엽 줄기 세포의 높은 금액을 포함 나타났습니다. 활 액 액체에 MSCs 부상18,19후 자연 치유 향상을 위한 조직에 도움이 될 수 있습니다. 문학에서 SF MSCs의 임상 ?...

MSCs 연골 병 변을 위해 특히 재생 의학에 대 한 귀중 한 소스 제안 되어 있다. MSCs, chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, 골격 myocytes 및 내장 stromal 세포를 포함 하 여 광범위 하 게 그들의 높은 확장 속도 멀티 혈통 차별화 잠재적인1인해 줄기 세포 이식에 대 한 영역을 확장 합니다. MSCs는 골격 근육, 막, 골 수 및 지방 조직2,,34에서 격리 될 수 있습니다. 결과 또한 conﬁrmed 활 액 액체에서 MSCs의 존재 그리고 이전 연구는 관절 재생5,6유망한 후보자로 활 액 액체 파생 MSCs (SF-MSCs)를 발견 했다.
그러나, 연구와 임상 실험 인간의 샘플에 많은 윤리적 문제에 적용 됩니다. 대신, 토끼 고 가장 일반적으로 사용 되는 동물 종 MSCs의 이식 연골 손상을 복구할 수 있습니다 설명 하기 위해 계속. 최근 몇 년 동안, 연구원의 증가 수는 토끼 중간 엽 줄기 세포 (rbMSCs) 모두 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서이 세포는 그들의 세포질 생물학 및 조직 생리학에서 인간의 비슷합니다 MSCs. 마찬가지로, rbMSCs는 인간의 MSCs에서 스핀 들 섬유 형태를 표시 하는 플라스틱 표면에 고착 할 수 있다. 또한, 토끼 중간 엽 샘플 간단 하 고 쉽게7을 얻을 수 있다. 또한, 가장 중요 한 포인트는 rbMSCs CD44, CD90, CD105, 등 표면 마커를 표현 하 고 기준으로 MSC 인구의 식별에 대 한 동의 잠재적인 다중 계보 차별화 유지 되는 세포 치료8,9에 대 한 국제 사회에 의해 정의. 특히, synovial 유체 chondroprogenitors 때 TGF-β1, 따라서 그들 phenotypically 관절 연골 재생10,11, 적당 한 셀 소스 만들기에 의해 유도 된 비 hypertrophic chondrogenesis 할 수 있다 12.
그러나, SF MSCs의 절연 탯, 지방 조직, 말 초 혈액 및 골 수를 포함 하 여 다른 조직에서 크게 다르다. 현재, 비록 흐름 cytometry 방법을 사용 하려면 특정 환경 및 매우 비싼 악기13cytometry 및 immunomagnetic 구슬 기반 정렬 정화 및 SF-MSCs의 정렬에 대 한 가장 일반적인 방식입니다.
이 문서는 흰 토끼 뉴질랜드에서 활 액 액체 샘플의 간단 하 고 최소한 침략 적 컬렉션에 대 한 절차를 제공합니다. 절차 동안, rbSF-MSCs 안정적으로 확장 된 생체 외에서 그리고 CD90 긍정적인 자기 비드 기반 절차와 격리. 마지막으로, 프로토콜에는 높은 순도와 수확된 셀 소스에서 생존 MSCs를 구하는 방법을 보여 줍니다.
이 프로토콜에서 격리 rbSF-MSCs는 그들의 형태학, 특정 마커 및 pluripotency 줄기 세포에 대 한 표현에 따라 특징 이다. CD45와 CD34의 표현 부정적인 반면 교류 cytometry 기반 immunophenotyping CD44 및 CD105의 중요 한 긍정적인 표현을 보여준다. 마지막으로, 분석 결과 생체 외에서 rbSF-MSCs에 대 한이 셀의 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>MesenGro Supplement</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Component of MSCs culture medium</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>MSCs differentiation medium</td></tr><tr><td>Isotonic saline solution</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>Cavity arthrocentesis procedure reagent</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, free of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Component of MSCs culture medium</td></tr><tr><td>Povidone iodine solution</td><td>Guangdong, China</td><td>150605</td><td>Sterilization agent</td></tr><tr><td>75% ethanol</td><td>Lircon, china</td><td>170917</td><td>Sterilization agent</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Cell dissociation reagent</td></tr><tr><td>1% Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Component of MSCs medium</td></tr><tr><td>MACS Running Buffer</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA</td></tr><tr><td>CD90 antibody conjugated MicroBeads</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Component of MSCs osteogenic differentiation</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0.5 mM, Component of adipogenic differentiation</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Component of adipogenic differentiation</td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-glycerophsphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Component of MSCs osteogenic differentiation</td></tr><tr><td>CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>Hematopoietic stem cells marker</td></tr><tr><td>Mouse antirabbit CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)</td></tr><tr><td>CD45 (Monoclonal Antibody)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>Hematopoietic stem cells marker</td></tr><tr><td>CD105 antibody</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>MSCs marker</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Precipitates RNA extraction organic phases</td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Wenge, China</td><td>61553</td><td>Extract total RNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Isolate total RNA</td></tr><tr><td>SYBR green master mix</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR420A</td><td>PCR test</td></tr><tr><td>cDNA synthesis kit</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR047A</td><td>Reverse-transcribed to complementary DNA</td></tr><tr><td>Alizarin Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Staining of calcium compounds</td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Staining of cartilaginous tissue</td></tr><tr><td>Oil Red O solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Lipid vacuole staining</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &amp;mu;m nylon</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Cell counting</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Cell culture dish</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNA Extraction and PCR</td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>Gamma-sterilized</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Centrifuge cells</td></tr><tr><td>Carbon dioxide cell incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Instrument</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>Real-Time quantitative polymerase chain reaction</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Cell analyzer</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Transfer the liquid</td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Isolate and pick individual cell colonies</td></tr><tr><td>Sterile hypodermic syringe</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>Arthrocentesis procedure</td></tr><tr><td>Rabbit cage</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>Restrain the rabbit</td></tr></tbody></table>

magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 세포 기반 치료에 대 한 주요 셀 소스. 관절 강 활 액 액체에서 MSCs 연골 조직 공학에 잠재적으로 사용할 수 있었습니다. 활 액 액체 (SF-MSCs)에서 MSCs 간주 되었습니다 관절 재생을 위한 유망한 후보자 그리고 그들의 잠재적인 치료 혜택 했다 그들 중요 한 연구 주제를 늦게. 뉴질랜드 백색 토끼의 무릎 구멍에서 SF-MSCs 인간의 재생 의학을 평가 하는 최적화 된 변환 모델로 사용할 수 있습니다. CD90 기반 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 기술을 통해이 프로토콜 성공적으로 토끼 SF-MSCs (rbSF-MSCs)이 토끼 모델에서 가져오고 더 완벽 하 게 유도 하는 그들을 차별화 하 여 이러한 셀의 MSC 표현 형 보여줍니다. osteoblasts, adipocytes, 그리고 chondrocytes입니다. 따라서,이 방법은 세포 생물학 연구와 간단한 장비 및 절차를 사용 하 여 조직 공학에 적용할 수 있습니다.

고립, 정화, 및 rbSF-MSCs의 문화: 이 프로토콜 맥을 사용 하 여 rbSF-MSCs, MSC 표면 마커 CD90의 식에 따라 분리. RbSF-MSCs의 고립, 정화, 그리고 특성화 및 생체 외에서 문화 프로토콜의 공정 흐름도 그림 1에 표시 됩니다.
마그네틱 활성화 셀 CD90와 (맥)을 정렬 후 셀 형태: 첫째,...

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Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K 조회수.  Guangzhou Medical University. 이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

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Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

연구

발생학

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

의학

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

생물학

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

생체공학

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

CD146의 분리<sup&gt; +</sup쥐 폐에서&gt; 주민 폐 중간 엽 기질 세포

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

혈관벽에서 murine CD34+ 줄기 세포의 분리 및 자기 분리

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

저자 스포트라이트: Magnetic Bead Screening-Coupled Flow Cytometry를 사용한 혈관벽 거주자 쥐 CD34+ 줄기 세포의 향상된 분리 및 특성 분석

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

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지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리

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섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

CD146의 분리

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34⁺ 줄기 세포의 면역자기 분리

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34⁺ 줄기 세포의 면역자기 분리

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34⁺ 줄기 세포의 면역자기 분리