이 프로토콜은 낮은 밀리그램 규모의 전장 huntingin 변이체의 생산을 위해 개발되었습니다. HD 연구자에게 필수적인 일관된 고품질 단백질을 제공합니다. 이 절차를 시연하는 것은 쿠리아 연구소의 연구 과학자 인 마이클 해리스 (Michael Harris)가 될 것입니다.
1 리터의 내 독소 자유 물에 1 그램의 폴리에틸렌 이민 25K를 첨가하여 시작하고 잘 저어줍니다. 100 밀리몰 염산을 사용하여 pH를 2.0으로 조정하고 모든 폴리에틸렌 이민이 용해 될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 100 밀리몰 수산화 나트륨 용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조정하고 0.2 마이크로 미터 필터를 통해 용액을 통과시킵니다.
여과 된 용액의 분취량을 만들어 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 293 세포를 섭씨 37도, 90 RPM, 5 % 이산화탄소의 가습 셰이커 인큐베이터에서 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 성장 배지에서 18-24 시간 동안 전파합니다. 형질감염 1일 전에, 세포를 5리터 삼각 플라스크에서 2 리터의 성장 배지 중의 6 밀리리터당 약 1.2 x 10의 밀도로 세포를 희석하고, 18 내지 24시간 동안 배양한다.
배양이 끝나면 제조업체의 지침에 따라 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 밀도와 생존율을 측정합니다. 형질감염에 필요한 폴리에틸렌이민 및 플라스미드의 양을 계산한 후, 폴리에틸렌이민 및 플라스미드를 PBS 100ml에 개별적으로 희석하고 실온에서 5분 동안 배양한다. 이어서, 희석된 플라스미드와 폴리에틸렌이민을 부드럽게 소용돌이치면서 혼합하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
혼합물을 세포 배양에 추가하고 부드럽게 소용돌이치며 혼합합니다. 이제 세포가 24 시간 동안 자라도록하십시오. 다음날, 부티르산 나트륨 용액을 2 밀리몰 응집 방지 및 소포제의 최종 농도에 1 : 1, 000 부피비로 첨가하여 배양하고 가습 셰이커 인큐베이터에서 48 시간 동안 세포를 배양한다.
세포 생존율 및 밀도를 측정한 후, 세포를 2, 000 G에서 30분 동안 원심분리하여 수확하고, 정제 전에 영하 80°C에서 세포 펠렛을 보관하였다. FPLC를 사용한 안티 FLAG 정제의 경우, 버퍼 A를 사용하여 분당 4 밀리리터의 유속으로 빈 컬럼에 12-25 밀리리터의 안티 FLAG 수지를 포장하고 플런저의 높이를 조정하여 플런저 끝과 수지 베드 사이의 간격을 제거합니다. 다음으로, 해동 된 세포 펠릿을 냉장 용해 완충액에 현탁시키고 세포 현탁액을 평방 인치당 1, 000 파운드의 압력에서 고전단 균질 기를 통해 한 번 통과시킨다.
호환 가능한 고정각 로터가 장착 된 원심 분리기를 사용하여 20, 000 G에서 1 시간 동안 용해물을 정화하십시오. 분석법 창에서 FPLC를 프로그래밍하고, 샘플 펌프를 통해 정화된 용해물을 로드하고, 텍스트 원고에 설명된 대로 원하는 컬럼 부피의 버퍼 A, B, C, D 및 용리 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 실행이 완료되면 SDS-PAGE를 사용하여 10 마이크로 리터의 피크 분획을 분석합니다.
피크 분획을 원하는 순도와 결합하고 추가 SDS-PAGE 분석을 위해 결합된 용리액을 약 50마이크로리터 저장합니다. FPLC를 사용하여 SEC 컬럼의 평형을 시작하고 50밀리리터 수퍼루프를 통해 FLAG 용출액 방지액을 로드합니다. SEC 버퍼를 실행한 후 섭씨 4도에서 밤새 SEC 분리가 발생하도록 합니다.
용리 프로파일을 표준 HTT 용리 프로파일과 비교하여 단량체, 이량체 및 고차 올리고머 피크를 구별합니다. SEC 컬럼의 용리 프로파일에 기초하여 단량체 HTT 분획을 풀링하고, 원하는 경우 고차 올리고머 및 이량체 HTT 분획을 별도로 풀링한다. 풀링된 HTT 단백질을 섭씨 4도에서 100킬로달톤 원심 농축기를 사용하여 농축합니다.
단백질 농도를 계산한 후, 정제된 HTT 단백질을 100 마이크로리터 미만의 분취량을 극저온 안전 마이크로원심분리 튜브에 넣는다. 액체 질소를 사용하여 분취량을 급속 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. UV 검출기, 다각 광산란 검출기, 시차 굴절률 검출기와 결합된 HPLC 시스템에서 섭씨 4도에서 모든 분석 SEC-MALS를 수행하고 HTT의 굴절률 증분으로 0.185를 사용합니다.
여과된 HPLC 등급의 물로 펌프와 검출기를 퍼지하고 UHPLC 컬럼을 시스템에 연결합니다. 컬럼을 여과된 물로 평형을 이룬 다음 모든 검출기 신호가 기준선에 도달할 때까지 SEC-MALS 버퍼를 사용합니다. 주입 당 15 분 동안 분당 0.3 밀리리터의 유속으로 2 마이크로 리터의 BSA 용액을 주입하십시오.
데이터 품질을 검사하고, BSA 프로파일을 기반으로 정규화, 피크 정렬 및 대역 확장 보정을 수행하고, 다음 HTT 샘플 실행을 위한 템플릿을 생성합니다. 플로트를 사용하여 실온의 수조에서 FL Q23-HTT 샘플의 바이알을 신속하게 해동시킨다. 0.1마이크로미터 스핀 필터를 통해 HTT를 필터링합니다.
2-4 마이크로 리터의 HTT 샘플을 주입하고 분당 0.3 밀리리터의 유속으로 섭씨 4도에서 15 분 동안 실행합니다. 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 크로마토그래피 및 광산란 데이터를 분석하고 Zimm 플롯을 생성하여 각 피크에 대한 중량 평균 분자량을 결정합니다. 본 연구에서는 2단계 컬럼 공정을 사용하여 HTT에 대해 95% 이상의 순도를 얻었으며 주요 오염 물질은 샤페론 Hsp70이었으며, 이는 FLAG 친화성 방지 정제 단계 동안 염화마그네슘 및 ATP로 광범위하게 세척하여 제거되었습니다. FL HTT의 과발현은 단백질의 단편화를 초래할 수 있지만 350킬로달톤의 정확한 분자량을 가진 단일 밴드로 분해된 방법으로 생성된 FL Q23-HTT는 없음을 나타냅니다. 조각화.
항체와 FL Q23-HTT의 반응 후 웨스턴 블롯 분석은 임의의 추가적인 단편-관련 밴드가 관찰되지 않았기 때문에, 단백질이 유의한 검출 가능한 절단없이 단리되었음을 입증하였다. FL HTT poly-Q 길이 분산, Q23, Q48 및 Q73은 웨스턴 블롯에서 예상대로 반응하여 Q 길이 증가와 상관관계가 있는 poly-Q-지향 모노클로날 항체 MW1에 대해 점진적으로 더 강한 신호를 보여줍니다. 테스트된 HPLC 컬럼 중 SEC 컬럼은 몰 질량을 구별할 수 있도록 HTT 단량체와 이량체 사이에 충분한 분리능을 보여주었습니다.
SEC로부터 정제된 FL HTT는 올리고머화 상태에 상응하는 다수의 밴드를 나타냈는데, 이는 겔 내에서 이동하는 동안 고차 올리고머의 형성에 기여하는 몇몇 소수성 패치의 존재 때문일 수 있다. 정제된 HTT는 각각 HTT의 단량체, 이량체 및 삼량체 종을 나타낼 가능성이 있는 643, 927 및 1, 070킬로달톤의 추정 분자량을 갖는 청색 천연 PAGE 상에 3개의 주요 밴드를 나타내었다. 정제된 헌팅틴의 적절한 취급은 가용성 응집체에서 고차 올리고머 생성을 방지하는 데 필수적입니다.
최종 사용자는 급속 냉동 전에 샘플을 사전 냉각된 튜브에 분주하기 위해 신속하게 작업해야 합니다. 장기 안정성 테스트는 섭씨 영하 80도에서 장기간 보관된 샘플에 대해 수행할 수 있습니다. 반복 HPLC SEC-MALS 분석을 통해 샘플의 단량체 함량에 변화가 있는지 확인할 수 있습니다.
