Name: a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

이 작품은 R & D 계획의 광 동성 (중국 홍보) (2016A050503028)에 의해 재정적으로 지원 되었다.

모든 인간의 혈액 수집 절차는 Sun 야만 센 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. GPC3-S-팹 디자인 전략
<ol><li>안티-GPC3 (humanized GC3313)는 안티 CD16 VHH14 (그림 1)의 공장을 연결 하 여 GPC3-S-팹을 디자인 합니다.</li>
	<li>합성 하 고 이전에 보고 된12VH-CH1-CD16-VHH 및 VL-CL pET26b 및 pET21a 벡터에 복제.</li>
</ol>2. 변환 및 문화
<ol><li>추가 100 VH-CH1-CD16 (그림 1A) 및 100를 포함 하는 pET26b의 ng의 유능한 BL21 100 µ L에 VL-CL (그림 1A)를 포함 하는 pET21a의 ng (DE3) 세포. 잘 혼합 하 고 30 분 품 45-90 s, 전송, 42 ° C 물 목욕에 대 한 얼음에 품 어 3-5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>BL21 포함 된 튜브에 lysogeny 국물 (파운드) 매체의 500 µ L를 추가 (DE3) 세포와 다음 37 ° C, 45-60 분에 대 한 150 rpm에서 확산 100 µ L BL21의 품 어 파운드-한 천 (DE3) 셀 플레이트 포함 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 그리고 다음 37 ° C 12-16 h에서 품 어.<ol>
<li>Lysogeny 국물 (파운드) 매체를 준비: 1 %wt / 집 tryptone, 0.5 %wt / 권 효 모 추출 물, 1 %wt / 권 NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하룻밤 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 슈퍼 국물 (SB) 매체의 5 mL로 단일 식민지에서 세포를 접종. 다음, 대 의 50 µ g/mL와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 4 h 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 100 mL으로 문화의 1 mL를 접종. 다음, 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 1 리터에 10 mL 문화의 전송.<ol>
<li>슈퍼 국물 매체 준비: 3.2 %wt / 집 tryptone, 2 %wt / 권 효 모 추출 물, 0.5 %wt / 권 NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 에 도달 하면 0.6-0.8, 0.2 m m의 최종 농도에 이소프로필-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)를 추가 합니다. 16 ° C, periplasmic 식 36-48 h에 대 한 180 rpm에서 문화.</li>
</ol>3. GPC3-S-팹 Periplasmic 정화
<ol><li>Periplasmic 분수 준비<ol>
<li>4000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 매체, 삭제 셀 무게.</li>
		<li>Resuspend 셀 셀의 그램 당 차가운 자당 해결책 (pH 7.5 Tris HCl의 20 m m, 25% (wt/vol) 자당 및 EDTA의 1 m m)의 4 mL에 철저 하 게 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>원심 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정된 각으로 터)에서 4 ° C 20 분 제거 상쾌한 (자당 분수)와 저장 얼음에.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 5mm MgCl2 의 그리고 1 밀리미터 PMSF (4 mL 당 그램 셀)의 혼합에 산 탄을 resuspend. 그램, 당 lysozyme 주식 (15 mg/mL)의 40 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>20 분 전송 상쾌한 (periplasmic 분수) 4 ° C에서 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정 각으로 터), centrifuge 고 얼음에 저장 합니다.</li>
		<li>자당 분수와 periplasmic 분수, 결합 하 고 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에 30000 x g, 4 ° C에서 30 분 제거는 상쾌한 고 저장 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni NTA 친 화력 정화<ol>
<li>균질 정지 달성, 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 Ni NTA agarose의 1 mL을 제거 하 고 10 열 볼륨 (CV) 평형 버퍼 추가를 철저 하 게 혼합 하 여 Ni NTA agarose의 1 mL를 resuspend (25mm Tris HCl, pH 7.5;의 NaCl의 1 M) equilibrate에.</li>
		<li>5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다. 그런 다음, 자당 분수와 periplasmic 분수를 포함 하는 50 mL 튜브에 Ni NTA agarose를 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.</li>
		<li>400 x g에서 혼합물을 원심, 4 ° C 5 분에 대 한 신중 하 게 상쾌한 언바운드 분수 다른 신선한 얼음 튜브를 제거. 중력 열에 Ni NTA agarose를 전송 합니다.</li>
		<li>10 추가 버퍼 세척의 이력서 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 1 M NaCl의; 20 m m, 30mm 또는 이미의 40 m m) 열을 수집 세척 분수 elute. 참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>3 추가 차입의 이력서 열 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 300 mM NaCl의, 100mm, 200mm, 300mm 또는 이미의 400 m m)를 버퍼링 하 고 차입 분수 1, 2, 3, 및 4는 elute 수집. 참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>투 석 PBS (137 mM NaCl, 2.7 m m의 KCl, 10mm 나2HPO4, KH2포4, pH 7.4의 2 mM)의 2 L에 eluted 분수 12 %GPC3-S-팹의 존재를 확인 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 SDS 페이지 다음에 의해 Coomassie 파란 얼룩입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG CH1 친 화력 정화<ol>
<li>IgG CH1 선호도 수 지의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 PBS 가진 구슬을 먼저 씻어. 그런 다음 단계 3.2.6 후 GPC3-S-팹을 포함 된 dialyzed 솔루션을 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.</li>
		<li>5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기, 4 ° c. 조심 스럽게 상쾌한 다른 신선한 얼음 튜브를 제거 하 고 중력의 열 수 지를 전송.</li>
		<li>10 추가 세척의 이력서는 열 (PBS)를 버퍼링 하 고 세척 분수 차입을 수집.</li>
		<li>트리 스 pH 9.0 (각 eluted 분수의 mL 당 0.1 mL)의 1m를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 3 이력서 차입 버퍼 (글리신-HCl, pH 2.7의 0.1 m M)와 함께 elute 및 수집 eluted 분수; 3 회 반복 한다.</li>
		<li>투 석 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 PBS의 2 L에 eluted 분수를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>Ultramicrospectrophotometer에 의해 단백질 농도 결정 (어 금 니 소 광 계수: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS 페이지와 서 부 럽 분석
<ol><li>SDS 로딩 버퍼 x 5 샘플의 10 µ L를 고려 하 고 잘 섞으십시오. 5 분 동안 100 ° C에서 단백질 혼합물을 끓인 다.<ol>
<li>SDS 로딩 버퍼 x 5를 준비: Tris HCl, pH 6.8, 10 %wt / 집 SDS의 250 m m, 0.5 %wt / 집 bromophenol 블루, 50 %vol / vol 글리세롤, 5 %vol / vol 베타-mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>앞에서 설명한26,,2728는 SDS 페이지 젤 로드 젤 (5%)와 분리 젤 (12%)를 준비 합니다.</li>
	<li>삶은 단백질 혼합물의 단백질 마커, 10 µ L을 로드 하 고 실행 SDS 페이지.</li>
	<li>젤 Coomassie 화려한 블루 솔루션, 20 분 동안 흔들어 하 여 얼룩 하 고 destaining을 수행 합니다.</li>
	<li>PVDF 막에 전송 후 서 부 럽 TBST (20 mM Tris HCl의 NaCl, 0.1 %vol / vol 트윈 20의 150 m m)와 막 차단 + 5 %wt / vol 흔들어 동안 실 온에서 1 h 동안 우유를 탈지 합니다.</li>
	<li>1 차 항 체를 막 품 어 (반대로 그의 또는 반대로 플래그) 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에 희석.</li>
	<li>TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.</li>
	<li>이차 항 체 (HRP 연결 방지 마우스 Fc 항 체) 희석 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에에서 막 품 어.</li>
	<li>TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.</li>
	<li>영화 당 HPR 기판의 1 mL을 추가 하 고 개발 이미지.</li>
</ol>5. 젤 여과 분석
<ol><li>다음 열을 사용 하 여: 열 양의 24 mL; 재래식 버퍼 PBS pH 7.4;의 온화한; 룸에서 0.5 mL/min의 유량 200 µ L의 샘플 볼륨입니다.</li>
	<li>다음 단백질의 양과 농도 사용 하 여: 1.2 mg/mL GPC3-S-팹의 500 µ L. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.</li>
	<li>단백질 마커 볼륨 및 농도 대 한 하나의 튜브 (2 mg/mL, 12.4 kDa)는 시 토 크롬 C의 100 µ L, 탈수 (3 mg/mL, 29 kDa)의 140 µ L, 알 부 민 (10mg/mL, 66 kDa)의 140 µ L 및 알콜 효소 (5 mg/mL, 150 kDa)의 200 µ L 걸릴. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.</li>
	<li>각 실행 하기 전에 적어도 2 씻고 증류수 0.5 mL/min 흐름 속도로 이력서.</li>
	<li>적어도 2 열 equilibrate 평형 버퍼 (PBS, pH 7.4) 0.5 mL/min 유량의 이력서.</li>
	<li>자동으로 샘플을 로드 0.5 mL/min에서 샘플을 주입.</li>
	<li>0.5 mL/min에서 재래식 버퍼 elute 고 280 그리고 215 nm에서 검출.</li>
</ol>6. 교류 Cytometry 분석
<ol><li>문화는 HepG2 (긍정적인 GPC3) Hep3B (긍정적인 GPC3), Huh7 (GPC3 양수), 및 MHCC-97 H (GPC3 제외) 셀 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리 DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 µ g/mL), 및 37 ° C에서 스 (50 µ g/mL) 5% CO2.</li>
	<li>문화 조 (GPC3 제외) 세포와 조/GPC3 세포는 전체 길이 인간의 GPC3 cDNA (GPC3 긍정적인) 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2RPMI 1640 매체에에서 은닉.</li>
	<li>NK92/CD16 전체 길이 인간의 CD16 cDNA (CD16 긍정적인) 은닉 RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2를 포함 하는 25 c m2 플라스 크에 문화.</li>
	<li>셀 70-90% 합칠 때, 매체를 삭제 하 고 2 mL의 PBS로 세포를 씻어. 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 2-3 분 (또는 때까지 세포 표면에서 분리를 시작) 37 ° C에서 품 어. 중화 하는 트립 신 고 다시 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 중단 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 Trypan 블루 세포 생존 능력을 감지.</li>
	<li>각 셀 라인 3 x 106 셀을 수집 합니다. 1 mL의 PBS + 0.2 %BSA 다시 셀을 일시 중지를 추가 합니다. 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분 두 번 반복에 대 한.</li>
	<li>0.3 mL PBS + 0.2 %BSA 다시 셀, 일시 중지를 추가 하 고 각 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브를 100 µ L (약 1 백만)를 전송. 참고: 여기에서 모든 단계는 튜브를 얼음에 차가운 유지 한다 있는지 확인 하십시오. 항 체를 세포 표면 항 원에 바인딩할 때 복잡 한 내 면화 하기 시작 합니다. 유지 함으로써 그것은 감기, 과정은 크게 둔화.</li>
	<li>모든 튜브에 1 차 항 체 (GPC3-S-팹 또는 인간 IgG1, 최종 농도 5 µ g/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.</li>
	<li>다시 PBS + 0.2 %BSA 100 µ L에서 중단 하 고 이차 항 체 (반대로 인간 IgG(H+L)-488, 최종 농도 10 µ g/mL)의 0.5 µ L을 추가 1 헤 주 ice에 품 어:이 단계에서 하십시오 빛에서 세포를 유지.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.</li>
	<li>29표준 프로토콜 따라 교류 cytometer 세포 분석. 여기 488 nm 레이저로 세포를 획득 합니다.</li>
</ol>7. 세포 독성 분석 실험
<ol><li>종양 세포를 준비 합니다.<ol>
<li>문화 HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC-97 H, 그리고 조 세포 라인 단계 6.1-6.5에에서 설명 된 대로.</li>
		<li>0.5 × 105/mL, 셀을 희석 하 고 100 µ L 셀 (5000 잘 당) 96 잘 접시에 접시. 연결할 셀 수 있도록 6-8 h 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 준비 합니다.<ol>
<li>50 mL 원뿔 튜브에 PBS의 동등한 양 가진 신선한 준비 된 혈액을 희석. 예를 들어 혈액의 PBS의 10 mL와 10 mL 희석.</li>
		<li>신선한 50 mL 원뿔 관으로 림프 구 분리 매체의 15 mL를 가져가 라. 천천히 희석된 혈액 튜브 측면을 따라 림프 구 분리 매체에 전송 합니다. 참고: 수직 튜브를 유지. 림프 구 분리 매체의 표면을 휴식 하지 않습니다.</li>
		<li>브레이크에서 실 온에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심.</li>
		<li>천천히 위 플라즈마 레이어를 제거 하 고 플라즈마-림프 구 분리 매체 인터페이스에서 PBMCs를 포함 하는 백색 혈액 레이어.</li>
		<li>PBS + 2% 더블 볼륨 PBMCs 희석 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심.</li>
		<li>씻어 PBS + 2%로 두 번 셀 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기 단계 6.5에서에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK 세포를 준비 합니다.<ol>
<li>5 x 107 셀/mL PBS + 2 %FBS, 및 장소에서의 농도 PBMCs 정지 준비 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 그들.</li>
		<li>셀의 50 µ L/mL에서 농축 칵테일 인간 NK 세포를 추가 합니다. 잘, 그리고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>Resuspend 그들은 균일 하 게 pipetting으로 일시 중단 되도록 NK 세포 농축 키트, 잘 믹스에서 자석 입자 고 아래 5 번 보다 더 적극적으로. 세포 현 탁 액에 100 µ L/mL에서 resuspended 자석 입자를 전송. 잘, 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>PBS + 2% 추가 하 여 최대 2.5 mL의 총 볼륨 세포 현 탁 액을가지고 FBS. 부드럽게 위아래로 2-3 번 pipetting으로 튜브에 세포를 혼합. 자석으로 (모자) 없이 튜브를 놓습니다. 마그네틱 구슬 실 온에서 2.5 분에 대 한 진정 하자.</li>
		<li>자석을 제거 합니다. 한 연속 움직임에 새로운 튜브에 풍부한 세포 현 탁 액을 붓는 튜브 반전.</li>
		<li>6.5 단계에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 독성 반응을 설정 합니다.<ol>
<li>5 × 105 셀/ml 해당 문화 매체를 사용 하 여 NK 세포를 희석. 96 잘 접시에 도금 하는 종양 세포를 NK 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>30 µ g/mL, 3 희석, 9 포인트 (3 복제)의 최종 농도에 높은 복용량과 함께 다른 농도에서 GPC3-S-팹 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 72 h에 품 어.</li>
		<li>외피의 72 h 후 매체, 제거 그리고 DMEM 매체 포함 하는 CCK8 시 약 96 잘 접시에 잘 각 하의 10 µ L의 100 µ L를 추가 하 고 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>450에 접시를 읽고 1, 2, 3, 및 4 h CCK8 시 약을 추가한 후에 nm.</li>
		<li>데이터를 분석 합니다. 생존 율을 계산 하는 (OD450 GPC3-S-팹 + 이펙터 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 -OD450 매체) × 100%, (OD450 GPC3-S-팹 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 - OD450 매체) × 100%. 효과 기 세포는 NK 세포 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs.">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).</li><li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment.">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li><li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+therapeutics,+antibody+engineering,+and+the+merits+of+protein+stability.">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li><li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+bispecific+antibodies:+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles.">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li><li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+interactions+in+the+Fab+fragment:+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability.">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li><li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors.">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications.">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).</li><li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention,+Detection,+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases.">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bispecific+antibody,+S-Fab,+induces+potent+cancer+cell+killing.">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells.">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32 (2016).</li><li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells.">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li><li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+(CD16)+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells.">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li><li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+single-domain+antibodies+in+bacterial+systems.">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li><li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+expression+of+antibodies.">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li><li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies.">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li><li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypicans:+proteoglycans+with+a+surprise.">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li><li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic,+preneoplastic,+and+neoplastic+tissues:+a+tissue+microarray+analysis+of+4,387+tissue+samples.">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li><li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis.">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders.">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li><li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma:+biological+significance+and+temporospatial+distribution.">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li><li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+(FcgammaRIII)+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice.">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li><li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans.">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CD16a,+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells,+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells.">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes.">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma.">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li></ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 연구에서는 bsAbs의 새로운 형식을 구성 하는 전략 소개 GPC3 긍정적인 종양 세포를 대상으로 하는 NK 세포를 모집 할 수 있는 GPC3-S-팹. S-팹 자연 팹 기반 안티 CD16 VHH11,12를 추가 하 여 형식. BsAbs 포함 된 Fc 지역에 비해, GPC3-S-팹 쉽게 생산 수 있습니다 큰 규모에 박테리아의 periplasm에서.
프로토콜에 설명 된 식과 정화 전략을 사용 하 ...

단일 클론 항 체는 이제 암 치료1광범위 하 게 사용 된다. 항 체의 유연성으로 인해 다양 한 항 체 기반 형식을 적극적으로 탐험 있다. 단일 클론 항 체와 비교, bsAbs 두 개의 다른 항 원 바인딩 모듈, 2 개의 다른 목표 동시에 고 효율적으로 방 아 쇠를 목표 하 고 종양 세포2를 죽 일 면역 효과 기 세포의 채용을 인식 하는.
현재 재조합 bsAb 형식을 일반적으로 두 개의 클래스에 할당할 수 있습니다: bsAbs 포함 하는 Fc와 Fc 지역 없이 bsAbs. 대부분 포유류 세포에서 생성 되는 Fc 포함 된 형식에 비해, bsAbs Fc 지구는 작은 크기의 장점을 하지 않고 더 쉽게 미생물 식 시스템에서 생산 되 고 보다 효율적으로 종양 조직에 침투 수 있습니다 3.
bsAbs Fc 지역 없이 일반적으로 개별 바인딩 moieties 단일 체인 변수 조각 (scFvs) 또는 팹3등을 연결 하 여 형성 된다. 안정적인 도메인 없이 bsAbs 자주 scFv 조각에 따라 열 안정성, 낮은 용 해도, 또는 집계4,5에 대 한 증가 잠재력 손상 있다. 반면, bsAbs 팹 기반 네이티브 팹 moiety4,6CH1 및 CL의 heterodimerization 때문에 안정 되어 있다.
무거운-체인 전용 항 체 (VHHs, 단일 도메인 항 체로 라고도 함)에서 변수 도메인은 자연 무거운 체인 항 체7의 활성 항 원 바인딩 조각. VHHs에 있는 높은 선호도의 특성, 기존의 IgGs8, 낮은 immunogenicity 및 높은 수익률의 특이성 세균성 식9. Fv 조각에 비해, VHHs 높은 열 안정성10있다. 팹 moieties와 비교해, VHHs는 CH1 및 CL의 부족으로 인해 작은 크기. 따라서, S-팹, 단일 도메인 항 체, VHH와 팹을 연결 하 여 얻은 bsAb 형식 설계 하 고 그것의 항 종양 효과11,12에 대 한 공부.
이 연구에서는 hGC3313 안티 CD16a VHH14 의 팹을 연결 하 여 GPC3-S-팹 건설은 설명 했다. GPC3-S-팹 periplasmic 식 대장균 (대장균)에 효율적으로 제작 될 수 있습니다. GPC3-S-팹의 기능 연구 GPC3-S-팹은 간 암 치료를 위한 유망한 전략 제안. 따라서, 쉽게 생산 및 정화, 그리고 안정 되어 있는 bsAbs는 이전 연구에 대 한 해당 참조를 대체 기술을 통해 GPC3-S-팹의 장점이 있습니다.
포유류 식 시스템 및 간결한 식 시스템 BsAbs의 다양 한 포맷을 표현 하기 위해 사용 되었습니다. 포유류 식 시스템, 대장균과 달리-기반된 단백질 식 시스템은 높은 수율, 낮은 비용과 노동 절약, 유전자 조작, 높은 변환 효율15의 용이성을 포함 하 여 많은 혜택. 대장균에서 bsAbs 식에 대 한 두 가지 기본 전략: 세포질과 세포질 사이 세포 막 외부15periplasm에 식 식. 세포질의 감소 환경에 비해는 periplasm 더 산화 환경, 올바른 접는 촉진 및 단백질16의 공동 식 이다. 올바른 접는 bsAbs의 용 해도, 안정성과 기능 생성에 주요 역할을 하고있다. 따라서, 신호 순서 pelB 대장균17는 periplasm에 분 비를 직접 S 팹의 N-말단에 추가 되었습니다. 되도록 정확한 접는, 용 해도, 열 안정성 및 구조적 안정성, 복잡성 및 항 체의 크기 감소는 자주 고용16. 한 팹과 세균성 시스템 가능성이 간단한 구조와 작은 크기 때문에 아주 잘 표현 한 VHH S 팹 형식에 의하여 이루어져 있다.
GPC3은 GPC3-S-팹 bispecific 항 체 형식으로 선정 되었다. Glypican-3 (GPC3) glycosylphosphatidylinositol (GPI)18을 통해 세포 표면에 고정 되는 헤 파 린 황산 염 (HS) proteoglycan 가족의 구성원입니다. GPC3 70%의 간세포 암 (HCC) 경우, 간 암19,20,,2122의 대부분에 대 한 어떤 계정에 overexpressed입니다. GPC3는 정상 조직에 거의 표현 된다, 때문에 GPC3 HCC에 대 한 잠재적인 대상으로 제안 하고있다. 여러 마우스 mAbs GPC3에 대 한 제작 되었습니다. 그러나,만 GC33 전시 제한 안티 종양 활동 22, 그리고 환자에서 임상 효능을 전시 하는 데 실패. 이 연구에서는 GPC3-S-팹 모집 GPC3 종양 세포14를 죽 일 NK 세포 수를 표시 했다.
NK 세포를 모집, 안티 CD16 VHH 사용 되었다. CD16a 낮은 친 화력 IgG 수용 체, T 세포의 일부 하위, monocytes, 대 식 세포, 자연 킬러 (NK) 세포에 주로 표현 이다. 그것은 항 체 의존 세포 세포 독성 (ADCC) NK 세포23에 의해 포함 된다. 인간 NK 세포 CD56 두 종류로 분류 될 수 있다-CD16 +, CD56 + CD16-. 달리 CD56 + CD16− NK 세포, CD56-CD16 + NK 세포 수 perforin와 granzyme B 놓고 따라서 강한 세포 독성24제시. Kupffer 세포 (관세), CD16a, 표현 간에서 상주 대 식 세포는. Kupffer 세포 간 암25의 억제에 중요 한 역할을 한다. 따라서, bsAbs CD16a를 대상으로 T 세포 간 암에 대 한 매력 보다는 더 유망한 전략을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td><td>Mini-PROTEAN&amp;reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot apparatus</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Imaging system</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Liquid chromatogram</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Beckman coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision plate reader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-human(H&amp;amp;L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 affinity resin</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK cell enrichment kit</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Standard marker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Gel filtration</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td><td>VWR chemicals</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm plastic dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 well cell culture cluster</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

이 프로토콜 건설과 bispecific 항 체 (bsAb), GPC3-S-팹의 기능 연구에 설명합니다. bsAbs는 그들의 두 개의 서로 다른 무기를 통해 두 개의 다른 epitopes를 인식할 수 있습니다. bsAbs는 직접 종양 세포를 죽 일 면역 세포를 보충 하는 그들의 기능에 대 한 적극적으로 연구 되었습니다. 현재, bsAbs의 대부분은 재조합 단백질, Fc 포함 된 bsAbs 또는 Fc 지역 없이 작은 bsAb 파생 상품의 형태로 생산 됩니다. 이 연구에서는 GPC3-S-팹, 항 체 단편 (팹) 기반된 bispecific 항 체, 안티-GPC3 항 체 GC33 안티 CD16 단일 도메인 항 체의 Fab을 연결 하 여 설계 되었다. GPC3-S-팹 대장균 에 표현 고 두 선호도 chromatographies에 의해 순화 될 수 있습니다. 순화 GPC3-S-팹 구체적으로 바인딩할 하 고 세포를 죽 일 GPC3 긍정적인 간 암 자연 킬러 세포를 모집 하 여 간 암 치료에 GPC3-S-팹의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 수 있습니다.

GPC3-S-팹 정화
GPC3-S-팹은 정화 대장균 에서 2 단계 선호도 정화에 의해 먼저 Ni-주권-agarose, IgG CH1 친 화력 정화 다음으로. 2 단계 선호도 정화 후 GPC3-S-팹 1:1 (그림 2A)에 가까운 두 개의 체인으로 동질성을 정화 했다. VH-CH1-CD16 VHH와 VL-CL polypeptides의 존재 그들의 뚜렷한 C 터미널 태그에 의해...

Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

여기, 우리 제시에 bispecific 항 체 GPC3-S-팹 생산 프로토콜 대장균. 순화 GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 간 암 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 있다.

GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K 조회수.  Sun Yat-Sen University. 여기, 우리 제시에 bispecific 항 체 GPC3-S-팹 생산 프로토콜 대장균. 순화 GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 간 암 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 있다.

비디오: A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

연구

암 연구학

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>Maleimide-thiol Chemistry 및 Sortase A-Mediated Ligation을 통한 부위 특이적 세포독성 단백질 접합체 준비

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Maleimide-thiol Chemistry 및 Sortase A-Mediated Ligation을 통한 부위 특이적 세포독성 단백질 접합체 준비

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

생화학

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

생체공학

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as valency, spatial arrangement, interdomain distance, and Fc mutations affect the anti-tumor efficacy of these therapies, commonly by influencing the homing of T cells to tumors, which remains a major challenge. Here, we describe a method to transduce activated human T cells with luciferase, allowing in vivo tracking of T cells during T-BsAb therapy studies. The ability of T-BsAbs to redirect T cells to tumors can be quantitatively evaluated at multiple time points during treatment, allowing researchers to correlate the anti-tumor efficacy of T-BsAbs and other interventions with the persistence of T cells in tumors. This method alleviates the need to sacrifice animals during treatment to histologically assess T cell infiltration and can be repeated at multiple time points to determine the kinetics of T cell trafficking during and after treatment.

Here, we describe a method for transducing human T cells with luciferase to facilitate in vivo tracking of bispecific antibody-induced T cell trafficking to tumors in studies to evaluate the anti-tumor efficacy and mechanism of T cell-engaging bispecific antibodies.

루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of action of the antibodies is antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), where the antibody binds to the cancer cells and engages the cellular component of the immune system, e.g., natural killer (NK) cells, to kill the tumor cells. The effectiveness of these therapies could be improved by identifying adjuvant compounds that increase the sensitivity of the cancer cells or the potency of the immune cells. In addition, undiscovered drug interactions in cancer patients co-medicated for previous conditions or cancer-associated symptoms may determine the success of the antibody therapy; therefore, such unwanted drug interactions need to be eliminated. With these goals in mind, we created a cancer ADCC model and describe here a simple protocol to find ADCC-modulating drugs. Since 3D models such as cancer cell spheroids are superior to 2D cultures in predicting in vivo responses of tumors to anticancer therapies, spheroid co-cultures of EGFP-expressing HER2+ JIMT-1 breast cancer cells and the NK92.CD16 cell lines were set up and induced with Trastuzumab, a monoclonal antibody clinically approved against HER2-positive breast cancer. JIMT-1 spheroids were allowed to form in cell-repellent U-bottom 96-well plates. On day 3, NK cells and Trastuzumab were added. The spheroids were then stained with Annexin V-Alexa 647 to measure apoptotic cell death, which was quantitated in the peripheral zone of the spheroids with an automated microscope. The applicability of our assay to identify ADCC-modulating molecules is demonstrated by showing that Sunitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor approved by the FDA against metastatic cancer, almost completely abolishes ADCC. The generation of the spheroids and image acquisition and analysis pipelines are compatible with high-throughput screening for ADCC-modulating compounds in cancer cell spheroids.

Here, we present a method to identify compounds that modulate the ADCC mechanism, an important cancer cell-killing mechanism of antitumor antibodies. The cytotoxic effect of NK cells is measured in breast cancer cell spheroids in the presence of Trastuzumab. Image analysis identifies live and dead killer and target cells in spheroids.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

면역학 및 감염병학

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능 성 컨쥬게이트에 의한 표적 항체 차단

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

치료 항체의 존재에 FcγRIIIa 참여에 의해 구동 인간 자연 킬러 세포 이벤트의 평가

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

Maleimide-thiol Chemistry 및 Sortase A-Mediated Ligation을 통한 부위 특이적 세포독성 단백질 접합체 준비

Maleimide-thiol Chemistry 및 Sortase A-Mediated Ligation을 통한 부위 특이적 세포독성 단백질 접합체 준비

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능 성 컨쥬게이트에 의한 표적 항체 차단

치료 항체의 존재에 FcγRIIIa 참여에 의해 구동 인간 자연 킬러 세포 이벤트의 평가