이 작품은 R & D 계획의 광 동성 (중국 홍보) (2016A050503028)에 의해 재정적으로 지원 되었다.

모든 인간의 혈액 수집 절차는 Sun 야만 센 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. GPC3-S-팹 디자인 전략
<ol><li>안티-GPC3 (humanized GC3313)는 안티 CD16 VHH14 (그림 1)의 공장을 연결 하 여 GPC3-S-팹을 디자인 합니다.</li>
	<li>합성 하 고 이전에 보고 된12VH-CH1-CD16-VHH 및 VL-CL pET26b 및 pET21a 벡터에 복제.</li>
</ol>2. 변환 및 문화
<ol><li>추가 100 VH-CH1-CD16 (그림 1A) 및 100를 포함 하는 pET26b의 ng의 유능한 BL21 100 µ L에 VL-CL (그림 1A)를 포함 하는 pET21a의 ng (DE3) 세포. 잘 혼합 하 고 30 분 품 45-90 s, 전송, 42 ° C 물 목욕에 대 한 얼음에 품 어 3-5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>BL21 포함 된 튜브에 lysogeny 국물 (파운드) 매체의 500 µ L를 추가 (DE3) 세포와 다음 37 ° C, 45-60 분에 대 한 150 rpm에서 확산 100 µ L BL21의 품 어 파운드-한 천 (DE3) 셀 플레이트 포함 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 그리고 다음 37 ° C 12-16 h에서 품 어.<ol>
<li>Lysogeny 국물 (파운드) 매체를 준비: 1 %wt / 집 tryptone, 0.5 %wt / 권 효 모 추출 물, 1 %wt / 권 NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하룻밤 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 슈퍼 국물 (SB) 매체의 5 mL로 단일 식민지에서 세포를 접종. 다음, 대 의 50 µ g/mL와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 4 h 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 100 mL으로 문화의 1 mL를 접종. 다음, 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 1 리터에 10 mL 문화의 전송.<ol>
<li>슈퍼 국물 매체 준비: 3.2 %wt / 집 tryptone, 2 %wt / 권 효 모 추출 물, 0.5 %wt / 권 NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 에 도달 하면 0.6-0.8, 0.2 m m의 최종 농도에 이소프로필-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)를 추가 합니다. 16 ° C, periplasmic 식 36-48 h에 대 한 180 rpm에서 문화.</li>
</ol>3. GPC3-S-팹 Periplasmic 정화
<ol><li>Periplasmic 분수 준비<ol>
<li>4000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 매체, 삭제 셀 무게.</li>
		<li>Resuspend 셀 셀의 그램 당 차가운 자당 해결책 (pH 7.5 Tris HCl의 20 m m, 25% (wt/vol) 자당 및 EDTA의 1 m m)의 4 mL에 철저 하 게 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>원심 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정된 각으로 터)에서 4 ° C 20 분 제거 상쾌한 (자당 분수)와 저장 얼음에.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 5mm MgCl2 의 그리고 1 밀리미터 PMSF (4 mL 당 그램 셀)의 혼합에 산 탄을 resuspend. 그램, 당 lysozyme 주식 (15 mg/mL)의 40 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>20 분 전송 상쾌한 (periplasmic 분수) 4 ° C에서 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정 각으로 터), centrifuge 고 얼음에 저장 합니다.</li>
		<li>자당 분수와 periplasmic 분수, 결합 하 고 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에 30000 x g, 4 ° C에서 30 분 제거는 상쾌한 고 저장 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni NTA 친 화력 정화<ol>
<li>균질 정지 달성, 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 Ni NTA agarose의 1 mL을 제거 하 고 10 열 볼륨 (CV) 평형 버퍼 추가를 철저 하 게 혼합 하 여 Ni NTA agarose의 1 mL를 resuspend (25mm Tris HCl, pH 7.5;의 NaCl의 1 M) equilibrate에.</li>
		<li>5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다. 그런 다음, 자당 분수와 periplasmic 분수를 포함 하는 50 mL 튜브에 Ni NTA agarose를 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.</li>
		<li>400 x g에서 혼합물을 원심, 4 ° C 5 분에 대 한 신중 하 게 상쾌한 언바운드 분수 다른 신선한 얼음 튜브를 제거. 중력 열에 Ni NTA agarose를 전송 합니다.</li>
		<li>10 추가 버퍼 세척의 이력서 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 1 M NaCl의; 20 m m, 30mm 또는 이미의 40 m m) 열을 수집 세척 분수 elute. 참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>3 추가 차입의 이력서 열 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 300 mM NaCl의, 100mm, 200mm, 300mm 또는 이미의 400 m m)를 버퍼링 하 고 차입 분수 1, 2, 3, 및 4는 elute 수집. 참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>투 석 PBS (137 mM NaCl, 2.7 m m의 KCl, 10mm 나2HPO4, KH2포4, pH 7.4의 2 mM)의 2 L에 eluted 분수 12 %GPC3-S-팹의 존재를 확인 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 SDS 페이지 다음에 의해 Coomassie 파란 얼룩입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG CH1 친 화력 정화<ol>
<li>IgG CH1 선호도 수 지의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 PBS 가진 구슬을 먼저 씻어. 그런 다음 단계 3.2.6 후 GPC3-S-팹을 포함 된 dialyzed 솔루션을 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.</li>
		<li>5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기, 4 ° c. 조심 스럽게 상쾌한 다른 신선한 얼음 튜브를 제거 하 고 중력의 열 수 지를 전송.</li>
		<li>10 추가 세척의 이력서는 열 (PBS)를 버퍼링 하 고 세척 분수 차입을 수집.</li>
		<li>트리 스 pH 9.0 (각 eluted 분수의 mL 당 0.1 mL)의 1m를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 3 이력서 차입 버퍼 (글리신-HCl, pH 2.7의 0.1 m M)와 함께 elute 및 수집 eluted 분수; 3 회 반복 한다.</li>
		<li>투 석 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 PBS의 2 L에 eluted 분수를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>Ultramicrospectrophotometer에 의해 단백질 농도 결정 (어 금 니 소 광 계수: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS 페이지와 서 부 럽 분석
<ol><li>SDS 로딩 버퍼 x 5 샘플의 10 µ L를 고려 하 고 잘 섞으십시오. 5 분 동안 100 ° C에서 단백질 혼합물을 끓인 다.<ol>
<li>SDS 로딩 버퍼 x 5를 준비: Tris HCl, pH 6.8, 10 %wt / 집 SDS의 250 m m, 0.5 %wt / 집 bromophenol 블루, 50 %vol / vol 글리세롤, 5 %vol / vol 베타-mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>앞에서 설명한26,,2728는 SDS 페이지 젤 로드 젤 (5%)와 분리 젤 (12%)를 준비 합니다.</li>
	<li>삶은 단백질 혼합물의 단백질 마커, 10 µ L을 로드 하 고 실행 SDS 페이지.</li>
	<li>젤 Coomassie 화려한 블루 솔루션, 20 분 동안 흔들어 하 여 얼룩 하 고 destaining을 수행 합니다.</li>
	<li>PVDF 막에 전송 후 서 부 럽 TBST (20 mM Tris HCl의 NaCl, 0.1 %vol / vol 트윈 20의 150 m m)와 막 차단 + 5 %wt / vol 흔들어 동안 실 온에서 1 h 동안 우유를 탈지 합니다.</li>
	<li>1 차 항 체를 막 품 어 (반대로 그의 또는 반대로 플래그) 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에 희석.</li>
	<li>TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.</li>
	<li>이차 항 체 (HRP 연결 방지 마우스 Fc 항 체) 희석 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에에서 막 품 어.</li>
	<li>TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.</li>
	<li>영화 당 HPR 기판의 1 mL을 추가 하 고 개발 이미지.</li>
</ol>5. 젤 여과 분석
<ol><li>다음 열을 사용 하 여: 열 양의 24 mL; 재래식 버퍼 PBS pH 7.4;의 온화한; 룸에서 0.5 mL/min의 유량 200 µ L의 샘플 볼륨입니다.</li>
	<li>다음 단백질의 양과 농도 사용 하 여: 1.2 mg/mL GPC3-S-팹의 500 µ L. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.</li>
	<li>단백질 마커 볼륨 및 농도 대 한 하나의 튜브 (2 mg/mL, 12.4 kDa)는 시 토 크롬 C의 100 µ L, 탈수 (3 mg/mL, 29 kDa)의 140 µ L, 알 부 민 (10mg/mL, 66 kDa)의 140 µ L 및 알콜 효소 (5 mg/mL, 150 kDa)의 200 µ L 걸릴. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.</li>
	<li>각 실행 하기 전에 적어도 2 씻고 증류수 0.5 mL/min 흐름 속도로 이력서.</li>
	<li>적어도 2 열 equilibrate 평형 버퍼 (PBS, pH 7.4) 0.5 mL/min 유량의 이력서.</li>
	<li>자동으로 샘플을 로드 0.5 mL/min에서 샘플을 주입.</li>
	<li>0.5 mL/min에서 재래식 버퍼 elute 고 280 그리고 215 nm에서 검출.</li>
</ol>6. 교류 Cytometry 분석
<ol><li>문화는 HepG2 (긍정적인 GPC3) Hep3B (긍정적인 GPC3), Huh7 (GPC3 양수), 및 MHCC-97 H (GPC3 제외) 셀 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리 DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 µ g/mL), 및 37 ° C에서 스 (50 µ g/mL) 5% CO2.</li>
	<li>문화 조 (GPC3 제외) 세포와 조/GPC3 세포는 전체 길이 인간의 GPC3 cDNA (GPC3 긍정적인) 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2RPMI 1640 매체에에서 은닉.</li>
	<li>NK92/CD16 전체 길이 인간의 CD16 cDNA (CD16 긍정적인) 은닉 RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2를 포함 하는 25 c m2 플라스 크에 문화.</li>
	<li>셀 70-90% 합칠 때, 매체를 삭제 하 고 2 mL의 PBS로 세포를 씻어. 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 2-3 분 (또는 때까지 세포 표면에서 분리를 시작) 37 ° C에서 품 어. 중화 하는 트립 신 고 다시 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 중단 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 Trypan 블루 세포 생존 능력을 감지.</li>
	<li>각 셀 라인 3 x 106 셀을 수집 합니다. 1 mL의 PBS + 0.2 %BSA 다시 셀을 일시 중지를 추가 합니다. 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분 두 번 반복에 대 한.</li>
	<li>0.3 mL PBS + 0.2 %BSA 다시 셀, 일시 중지를 추가 하 고 각 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브를 100 µ L (약 1 백만)를 전송. 참고: 여기에서 모든 단계는 튜브를 얼음에 차가운 유지 한다 있는지 확인 하십시오. 항 체를 세포 표면 항 원에 바인딩할 때 복잡 한 내 면화 하기 시작 합니다. 유지 함으로써 그것은 감기, 과정은 크게 둔화.</li>
	<li>모든 튜브에 1 차 항 체 (GPC3-S-팹 또는 인간 IgG1, 최종 농도 5 µ g/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.</li>
	<li>다시 PBS + 0.2 %BSA 100 µ L에서 중단 하 고 이차 항 체 (반대로 인간 IgG(H+L)-488, 최종 농도 10 µ g/mL)의 0.5 µ L을 추가 1 헤 주 ice에 품 어:이 단계에서 하십시오 빛에서 세포를 유지.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.</li>
	<li>29표준 프로토콜 따라 교류 cytometer 세포 분석. 여기 488 nm 레이저로 세포를 획득 합니다.</li>
</ol>7. 세포 독성 분석 실험
<ol><li>종양 세포를 준비 합니다.<ol>
<li>문화 HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC-97 H, 그리고 조 세포 라인 단계 6.1-6.5에에서 설명 된 대로.</li>
		<li>0.5 × 105/mL, 셀을 희석 하 고 100 µ L 셀 (5000 잘 당) 96 잘 접시에 접시. 연결할 셀 수 있도록 6-8 h 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 준비 합니다.<ol>
<li>50 mL 원뿔 튜브에 PBS의 동등한 양 가진 신선한 준비 된 혈액을 희석. 예를 들어 혈액의 PBS의 10 mL와 10 mL 희석.</li>
		<li>신선한 50 mL 원뿔 관으로 림프 구 분리 매체의 15 mL를 가져가 라. 천천히 희석된 혈액 튜브 측면을 따라 림프 구 분리 매체에 전송 합니다. 참고: 수직 튜브를 유지. 림프 구 분리 매체의 표면을 휴식 하지 않습니다.</li>
		<li>브레이크에서 실 온에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심.</li>
		<li>천천히 위 플라즈마 레이어를 제거 하 고 플라즈마-림프 구 분리 매체 인터페이스에서 PBMCs를 포함 하는 백색 혈액 레이어.</li>
		<li>PBS + 2% 더블 볼륨 PBMCs 희석 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심.</li>
		<li>씻어 PBS + 2%로 두 번 셀 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기 단계 6.5에서에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK 세포를 준비 합니다.<ol>
<li>5 x 107 셀/mL PBS + 2 %FBS, 및 장소에서의 농도 PBMCs 정지 준비 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 그들.</li>
		<li>셀의 50 µ L/mL에서 농축 칵테일 인간 NK 세포를 추가 합니다. 잘, 그리고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>Resuspend 그들은 균일 하 게 pipetting으로 일시 중단 되도록 NK 세포 농축 키트, 잘 믹스에서 자석 입자 고 아래 5 번 보다 더 적극적으로. 세포 현 탁 액에 100 µ L/mL에서 resuspended 자석 입자를 전송. 잘, 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>PBS + 2% 추가 하 여 최대 2.5 mL의 총 볼륨 세포 현 탁 액을가지고 FBS. 부드럽게 위아래로 2-3 번 pipetting으로 튜브에 세포를 혼합. 자석으로 (모자) 없이 튜브를 놓습니다. 마그네틱 구슬 실 온에서 2.5 분에 대 한 진정 하자.</li>
		<li>자석을 제거 합니다. 한 연속 움직임에 새로운 튜브에 풍부한 세포 현 탁 액을 붓는 튜브 반전.</li>
		<li>6.5 단계에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 독성 반응을 설정 합니다.<ol>
<li>5 × 105 셀/ml 해당 문화 매체를 사용 하 여 NK 세포를 희석. 96 잘 접시에 도금 하는 종양 세포를 NK 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>30 µ g/mL, 3 희석, 9 포인트 (3 복제)의 최종 농도에 높은 복용량과 함께 다른 농도에서 GPC3-S-팹 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 72 h에 품 어.</li>
		<li>외피의 72 h 후 매체, 제거 그리고 DMEM 매체 포함 하는 CCK8 시 약 96 잘 접시에 잘 각 하의 10 µ L의 100 µ L를 추가 하 고 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>450에 접시를 읽고 1, 2, 3, 및 4 h CCK8 시 약을 추가한 후에 nm.</li>
		<li>데이터를 분석 합니다. 생존 율을 계산 하는 (OD450 GPC3-S-팹 + 이펙터 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 -OD450 매체) × 100%, (OD450 GPC3-S-팹 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 - OD450 매체) × 100%. 효과 기 세포는 NK 세포 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+single-domain+antibodies+in+bacterial+systems.">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li><li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+expression+of+antibodies.">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li><li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies.">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li><li>Filmus, J., Selleck, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma:+biological+significance+and+temporospatial+distribution.">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li><li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+(FcgammaRIII)+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice.">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li><li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans.">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CD16a,+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells,+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells.">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes.">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma.">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li></ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 연구에서는 bsAbs의 새로운 형식을 구성 하는 전략 소개 GPC3 긍정적인 종양 세포를 대상으로 하는 NK 세포를 모집 할 수 있는 GPC3-S-팹. S-팹 자연 팹 기반 안티 CD16 VHH11,12를 추가 하 여 형식. BsAbs 포함 된 Fc 지역에 비해, GPC3-S-팹 쉽게 생산 수 있습니다 큰 규모에 박테리아의 periplasm에서.
프로토콜에 설명 된 식과 정화 전략을 사용 하 ...

단일 클론 항 체는 이제 암 치료1광범위 하 게 사용 된다. 항 체의 유연성으로 인해 다양 한 항 체 기반 형식을 적극적으로 탐험 있다. 단일 클론 항 체와 비교, bsAbs 두 개의 다른 항 원 바인딩 모듈, 2 개의 다른 목표 동시에 고 효율적으로 방 아 쇠를 목표 하 고 종양 세포2를 죽 일 면역 효과 기 세포의 채용을 인식 하는.
현재 재조합 bsAb 형식을 일반적으로 두 개의 클래스에 할당할 수 있습니다: bsAbs 포함 하는 Fc와 Fc 지역 없이 bsAbs. 대부분 포유류 세포에서 생성 되는 Fc 포함 된 형식에 비해, bsAbs Fc 지구는 작은 크기의 장점을 하지 않고 더 쉽게 미생물 식 시스템에서 생산 되 고 보다 효율적으로 종양 조직에 침투 수 있습니다 3.
bsAbs Fc 지역 없이 일반적으로 개별 바인딩 moieties 단일 체인 변수 조각 (scFvs) 또는 팹3등을 연결 하 여 형성 된다. 안정적인 도메인 없이 bsAbs 자주 scFv 조각에 따라 열 안정성, 낮은 용 해도, 또는 집계4,5에 대 한 증가 잠재력 손상 있다. 반면, bsAbs 팹 기반 네이티브 팹 moiety4,6CH1 및 CL의 heterodimerization 때문에 안정 되어 있다.
무거운-체인 전용 항 체 (VHHs, 단일 도메인 항 체로 라고도 함)에서 변수 도메인은 자연 무거운 체인 항 체7의 활성 항 원 바인딩 조각. VHHs에 있는 높은 선호도의 특성, 기존의 IgGs8, 낮은 immunogenicity 및 높은 수익률의 특이성 세균성 식9. Fv 조각에 비해, VHHs 높은 열 안정성10있다. 팹 moieties와 비교해, VHHs는 CH1 및 CL의 부족으로 인해 작은 크기. 따라서, S-팹, 단일 도메인 항 체, VHH와 팹을 연결 하 여 얻은 bsAb 형식 설계 하 고 그것의 항 종양 효과11,12에 대 한 공부.
이 연구에서는 hGC3313 안티 CD16a VHH14 의 팹을 연결 하 여 GPC3-S-팹 건설은 설명 했다. GPC3-S-팹 periplasmic 식 대장균 (대장균)에 효율적으로 제작 될 수 있습니다. GPC3-S-팹의 기능 연구 GPC3-S-팹은 간 암 치료를 위한 유망한 전략 제안. 따라서, 쉽게 생산 및 정화, 그리고 안정 되어 있는 bsAbs는 이전 연구에 대 한 해당 참조를 대체 기술을 통해 GPC3-S-팹의 장점이 있습니다.
포유류 식 시스템 및 간결한 식 시스템 BsAbs의 다양 한 포맷을 표현 하기 위해 사용 되었습니다. 포유류 식 시스템, 대장균과 달리-기반된 단백질 식 시스템은 높은 수율, 낮은 비용과 노동 절약, 유전자 조작, 높은 변환 효율15의 용이성을 포함 하 여 많은 혜택. 대장균에서 bsAbs 식에 대 한 두 가지 기본 전략: 세포질과 세포질 사이 세포 막 외부15periplasm에 식 식. 세포질의 감소 환경에 비해는 periplasm 더 산화 환경, 올바른 접는 촉진 및 단백질16의 공동 식 이다. 올바른 접는 bsAbs의 용 해도, 안정성과 기능 생성에 주요 역할을 하고있다. 따라서, 신호 순서 pelB 대장균17는 periplasm에 분 비를 직접 S 팹의 N-말단에 추가 되었습니다. 되도록 정확한 접는, 용 해도, 열 안정성 및 구조적 안정성, 복잡성 및 항 체의 크기 감소는 자주 고용16. 한 팹과 세균성 시스템 가능성이 간단한 구조와 작은 크기 때문에 아주 잘 표현 한 VHH S 팹 형식에 의하여 이루어져 있다.
GPC3은 GPC3-S-팹 bispecific 항 체 형식으로 선정 되었다. Glypican-3 (GPC3) glycosylphosphatidylinositol (GPI)18을 통해 세포 표면에 고정 되는 헤 파 린 황산 염 (HS) proteoglycan 가족의 구성원입니다. GPC3 70%의 간세포 암 (HCC) 경우, 간 암19,20,,2122의 대부분에 대 한 어떤 계정에 overexpressed입니다. GPC3는 정상 조직에 거의 표현 된다, 때문에 GPC3 HCC에 대 한 잠재적인 대상으로 제안 하고있다. 여러 마우스 mAbs GPC3에 대 한 제작 되었습니다. 그러나,만 GC33 전시 제한 안티 종양 활동 22, 그리고 환자에서 임상 효능을 전시 하는 데 실패. 이 연구에서는 GPC3-S-팹 모집 GPC3 종양 세포14를 죽 일 NK 세포 수를 표시 했다.
NK 세포를 모집, 안티 CD16 VHH 사용 되었다. CD16a 낮은 친 화력 IgG 수용 체, T 세포의 일부 하위, monocytes, 대 식 세포, 자연 킬러 (NK) 세포에 주로 표현 이다. 그것은 항 체 의존 세포 세포 독성 (ADCC) NK 세포23에 의해 포함 된다. 인간 NK 세포 CD56 두 종류로 분류 될 수 있다-CD16 +, CD56 + CD16-. 달리 CD56 + CD16− NK 세포, CD56-CD16 + NK 세포 수 perforin와 granzyme B 놓고 따라서 강한 세포 독성24제시. Kupffer 세포 (관세), CD16a, 표현 간에서 상주 대 식 세포는. Kupffer 세포 간 암25의 억제에 중요 한 역할을 한다. 따라서, bsAbs CD16a를 대상으로 T 세포 간 암에 대 한 매력 보다는 더 유망한 전략을 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Zhicheng</td>
			<td>ZWYR-D2402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Cence</td>
			<td>GL-10MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti j-26S XPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Mini-PROTEAN&#174; Tetra</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-blot apparatus</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>chemidoc tm XRS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid chromatogram</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA avant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5702R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti His-tag</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-6657-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag-tag</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human(H&#38;L)-488</td>
			<td>A11013</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA-Agarose</td>
			<td>Tribioscience</td>
			<td>TBS9202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-CH1 affinity resin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>194320005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8 kit</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15050-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard marker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MWGF200</td>
			<td>Gel filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>VWRC0487-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0655-100FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knanamycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0408-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0339-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6791-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>A110752-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>P112134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A505255-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a name="RANGE!A50">Coomassie Brilliant Blue R250</a></td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500922-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 20mm plastic dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610498-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GNHa 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCC-97H</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>SCSP-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu 72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL2408</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

이 프로토콜 건설과 bispecific 항 체 (bsAb), GPC3-S-팹의 기능 연구에 설명합니다. bsAbs는 그들의 두 개의 서로 다른 무기를 통해 두 개의 다른 epitopes를 인식할 수 있습니다. bsAbs는 직접 종양 세포를 죽 일 면역 세포를 보충 하는 그들의 기능에 대 한 적극적으로 연구 되었습니다. 현재, bsAbs의 대부분은 재조합 단백질, Fc 포함 된 bsAbs 또는 Fc 지역 없이 작은 bsAb 파생 상품의 형태로 생산 됩니다. 이 연구에서는 GPC3-S-팹, 항 체 단편 (팹) 기반된 bispecific 항 체, 안티-GPC3 항 체 GC33 안티 CD16 단일 도메인 항 체의 Fab을 연결 하 여 설계 되었다. GPC3-S-팹 대장균 에 표현 고 두 선호도 chromatographies에 의해 순화 될 수 있습니다. 순화 GPC3-S-팹 구체적으로 바인딩할 하 고 세포를 죽 일 GPC3 긍정적인 간 암 자연 킬러 세포를 모집 하 여 간 암 치료에 GPC3-S-팹의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 수 있습니다.

GPC3-S-팹 정화
GPC3-S-팹은 정화 대장균 에서 2 단계 선호도 정화에 의해 먼저 Ni-주권-agarose, IgG CH1 친 화력 정화 다음으로. 2 단계 선호도 정화 후 GPC3-S-팹 1:1 (그림 2A)에 가까운 두 개의 체인으로 동질성을 정화 했다. VH-CH1-CD16 VHH와 VL-CL polypeptides의 존재 그들의 뚜렷한 C 터미널 태그에 의해...

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A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

여기, 우리 제시에 bispecific 항 체 GPC3-S-팹 생산 프로토콜 대장균. 순화 GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 간 암 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 있다.

GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K 조회수.  Sun Yat-Sen University. 여기, 우리 제시에 bispecific 항 체 GPC3-S-팹 생산 프로토콜 대장균. 순화 GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 간 암 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 있다.

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Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

연구

암 연구학

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes more complex, the goal of targeting mitochondria using various compounds that inflict mitochondrial damage (so-called mitocans) is becoming quite popular. Unfortunately, many existing cytotoxicity assays, such as those based on tetrazolium salts or resazurin require functional mitochondrial enzymes for their performance. The damage inflicted by compounds that target mitochondria often compromises the accuracy of these assays. Here, we describe a modified protocol based on differential staining with two fluorescent dyes, one of which is cell-permeant (Hoechst 33342) and the other of which is not (propidium iodide). The difference in staining allows living and dead cells to be discriminated. The assay is amenable to automated microscopy and image analysis, which increases throughput and reduces bias. This also allows the assay to be used in high-throughput fashion using 96-well plates, making it a viable option for drug discovery efforts, particularly when the drugs in question have some level of mitotoxicity. Importantly, results obtained by Hoechst/PI staining assay show increased consistency, both with trypan blue exclusion results and between biological replicates when the assay is compared to other methods.

The protocol describes a rapid, high-throughput, reliable, inexpensive, and unbiased assay for efficiently determining cellular viability. This assay is particularly useful when cells&#39; mitochondria have been damaged, which interferes with other assays. The assay uses automated counting of cells stained with two nuclear dyes &#8211; Hoechst 33342 and propidium iodide.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

체외 및 비보에서 마우스 수지상 세포를 대상으로 하는 전체 길이 단백질을 가진 정제 된 DEC-205 지향 항체의 화학 적 융합

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

프로그래밍 가능한 자동 나노리터 인젝터 를 사용한 초파리 멜라노가스터 에서의 종양 동종이식

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), relying on collateral flow to the liver through the gastroduodenal artery (GDA). In the current manuscript, the technical conduct of robotic DP-CAR is outlined. The greater curve of the stomach is mobilized with care to avoid sacrificing the gastroepiploic vessels. The stomach and liver are retracted cephalad to facilitate dissection of the porta hepatis. The hepatic artery (HA) is dissected and encircled with a vessel loop. The gastroduodenal artery (GDA) is carefully preserved. The common HA is clamped and triphasic flow in the proper HA via the GDA is confirmed using intra-operative ultrasound. A retropancreatic tunnel is made over the superior mesenteric vein (SMV). The pancreas is divided with an endovascular stapler at the neck. The inferior mesenteric vein (IMV) and splenic vein are ligated. The HA is stapled proximal to the GDA. The entire specimen is retracted laterally with further dissection cephalad to expose the superior mesenteric artery (SMA). The SMA is then traced back to the aorta. The dissection continues cephalad along the aorta with the bipolar energy device used to divide the crural fibers and celiac nerve plexus. The specimen is mobilized from the patient's right to left until the origin of the celiac axis is identified and oriented towards the left. The trunk is circumferentially dissected and stapled. Additional dissection with hook cautery and the bipolar energy device fully mobilizes the pancreatic tail and spleen. The specimen is removed from the left lower quadrant extraction site and one drain is left in the resection bed. A final intra-operative ultrasound of the proper HA confirms pulsatile, triphasic flow in the artery and liver parenchyma. The stomach is inspected for evidence of ischemia. Robotic DP-CAR is safe, feasible and when used in conjunction with multi-modality therapy, offers potential for long-term survival in selected patients.

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

We present our operative approach to robot assisted distal pancreatectomy, splenectomy, and celiac axis resection (DP-CAR), demonstrating that the procedure is safe and feasible with proper planning, patient selection, and surgeon experience.

췌장암을 위한 체강 축 절제술 (DP-CAR)를 가진 로봇 지원 황실 판생성절제술: 외과 계획 및 기술

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...