이 프로토콜은 종양 및 조직에서 항체 분포의 발현 및 정제 및 실시간 모니터링을 보여줍니다. 기술된 프로토콜을 가진 항체를 검열하는 것은 종양 현지화를 제한하는 항체를 선택하는 것을 도울 것입니다. 설명된 기술은 빠르고 비용 효율적입니다.
단일 광자 방출 컴퓨팅 단층 촬영 및 양전자 방출 단층 촬영과 같은 다른 기술은 매우 비싸며 방사성 및 기타 정교한 추적자가 필요합니다. 이 기술은 항체를 표적으로 하는 암에 국한되지 않습니다. 그것은 바디에 있는 항체 분포의 분석을 위해 폐 또는 심장 병과 같은 그밖 질병에 적용될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 제레미 게이츠먼, 내 대학에서 수의학 기술자가 될 것입니다. Delong에서 200 밀리리터의 미디어 에서 원시 CHO 세포, 에를렌마이어 당황 플라스크. CHO 자유형 미디어 5밀리리터와 가변 중클론 DNA 50마이크로그램, 15밀리리터 튜브에 가변 광 클론 DNA 75 마이크로그램을 결합합니다.
그런 다음 튜브를 소용돌이시다. 혼합물을 실온에서 5분간 그대로 둡니다. DNA 용액에 밀리리터 폴리에틸레니민 스톡당 750 마이크로리터를 추가하고 30초 동안 적극적으로 소용돌이를 가합니다.
혼합물을 실온에서 5분간 추가로 둡니다. 플라스크를 수동으로 흔들면서 전체 혼합물을 CHO 셀에 추가합니다. 즉시 130 RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
다음 날에는 100 X 항 응집제의 밀리리터 2개와 세포에 100 X 항균 항진성 용액의 2 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 섭씨 32~34도에서 배양하고 130RPM에서 흔들리면 됩니다. 10 일에서 11 일 동안 세포를 계속 배양하고 트립톤 N1 사료의 10 밀리리터와 5 일째에 100 X 글루타민 보충제 2 밀리리터를 추가하십시오.
세포 생존이 10일 또는 11일에 80%를 넘도록 3일째에 세포를 세어, 배양을 3000배, 섭씨 4도에서 40~60분 동안 원심분리하여 항체 정화배지를 수확한다. 그런 다음 0.22 마이크로미터 병 필터로 투명 미디어를 필터링합니다. 항체를 정화하기 위해, 결합 완충제의 두 컬럼 부피로 단백질 A 컬럼을 평형화한다.
분당 1밀리리터의 유량으로 여과된 미디어를 컬럼을 통과합니다. 그런 다음 바인딩 버퍼의 두 열 볼륨으로 열을 세척합니다. 용출 버퍼 5 밀리리터를 사용하여 항체를 500 마이크로리터 분획으로 엘로트합니다.
그리고 분획에 대한 중화 완충제의 10 마이크로리터를 추가하여 암시된 항체의 pH를 중화한다. IgG에 대한 기본 프로토콜을 사용하여 분광계로 정제된 항체의 농도를 측정합니다. 투석 0.5 밀리리터의 투석 카세트를 1리터의 컨쥬게이션 버퍼에 사용한다.
4시간 후 투석 카세트를 신선한 버퍼로 옮기고 하룻밤 동안 투석을 합니다. 인주 반응을 설정하려면, 500 마이크로리터의 총 부피에서 항체의 1 밀리그램 당 IRR 염료 800 CWU의 0.03 마이크로그램을 추가합니다. 20섭씨에서 2시간 동안 혼합물을 배양한 다음, PBS에 대한 광범위한 투석으로 표시된 컨쥬게이트를 정화합니다.
280 나노미터에서 염료 780 나노미터의 흡광도 및 단백질의 흡광도를 측정하여 라벨링 정도를 추정한다. 마우스 제노그래프를 개발하려면 동물의 피부를 부드럽게 들어 올리고 기본 근육 층과 분리합니다. 천천히 26 게이지 바늘로 피부 아래에 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 주입합니다.
바늘을 꺼내기 전에 몇 초 동안 기다렸다가 지하 매트릭스 매체가 피부 아래세포와 함께 반고체 젤과 같은 구조를 알려주므로 혼합물이 주입 부위에서 나오는 것을 방지할 수 있습니다. 생체 내 이미징에서 수행하려면 꼬리 정맥을 통해 염료 표지 항체를 주입하십시오. 마우스를 마취한 후, 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인하고 따뜻한 물을 적용하여 정맥을 팽창시다.
1cc 인슐린 주사기를 26 게이지 바늘로 사용하여 100 마이크로리터의 부피로 표지된 항체의 25 마이크로그램을 주입하십시오. 음성 대조군으로서, 암세포를 표적으로 하지 않는 비특이적 IgG 동위타입 항체를 라벨 및 주입한다. 항체 주사 후 생체 내 이미징 8, 24 및 48 시간 수행.
이미징 소프트웨어에서 초기화를 클릭합니다. 스테이지 온도가 섭씨 37도인지 확인합니다. 제어판에서 이미징 마법사를 통해 형광 이미징을 설정하고 773 나노미터로 발산을 설정하여 792 나노미터로 방출합니다.
마취된 마우스를 이미징 챔버로 옮기. 코 콘을 사용하여 이미징 필드에 배치합니다. 준비가 되면 이미지 수집을 위해 제어판을 획득한 다음 자동 노출을 클릭합니다.
생성된 이미지는 광학 형광 및 밀도가 수 또는 광자의 단위로 표시되는 사진 이미지에 형광의 오버레이입니다. 가변 중압 및 가변 광 도메인을 가진 양성 cDNA 클론은 콜로니 PCR로 확인되었다. SDS 페이지를 축소하고 줄이는 데 있어 정제된 팔레투주맙의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.
헤비 및 라이트 체인은 감소 후 50 킬로달톤 밴드와 25 킬로달톤 밴드를 생산했다. 세포 표면에서 원토 단백질에 대한 항체의 결합도 확인되었다. 형광표지 항체는 전체 R1 발현 종양으로 이식된 마우스로 꼬리 정맥주입하였다.
동물은 IVIS를 사용하여 여러 시간 지점에서 이미지를 살았습니다. 데이터는 종양으로 전체 R1 및 BaCa 항체의 선택적 농축을 confirs. 이 프로토콜을 시도할 때 CHO 세포의 유지 보수가 항체 수율에 중요하다는 점에 유의하십시오.
그리고 경쟁종양 국소화를 위해 유사한 정도의 형광염 염료 연상을 갖는 것이 중요하다. 이 절차에 이어, 조직 면역 조직 화학 및 조직 또는 종양 특이적 ELISA와 같은 다른 방법은 살아있는 마우스 이미징 데이터를 지원하기 위해 수행될 수 있다.
