JHN는 스위스 국립 재단 (SNSF 310030_146290)에 의해 지원 됩니다.

마우스 사육 되었고 조건 하에서 특정 병원 체 무료 (SPF) 동물 시설에서 의학의 부, 바젤의 대학 (바젤, 스위스)의 유지. 모든 마우스 실험은 스위스 연방 및 Cantonal 규정 (동물 프로토콜 번호 2816 [구획의 바젤-스타트]) 수행 했다.
1입니다. LPS 솔루션의 준비
<ol><li>대장균 살 균 조건 하에서 0111:B4에서 순화 LPS의 주식 열고 5 mg/mL의 농도에 물에 그것을 다시 구성 합니다.</li>
	<li>0.2 µ g / µ L의 작업 집중에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 분 (PBS)와 LPS 재고 희석.</li>
</ol>2. 복 사출 마우스에 LPS의
<ol><li>0.5 mL 주사기에 층 류 기류에 30 G 바늘 솔루션 작업 LPS 발음</li>
	<li>여성 C57Bl/6 마우스의 나이 10 주 (6) 무게와 주입 됩니다 LPS의 양을 계산: 10 µ L (2 µ g) /g 몸 무게. 참고: 예를 들어 마우스 무게 20 g, 다음 20 g x 10 µ L = 200 µ L LPS를 주입 해야 솔루션을 작업.</li>
	<li>부드럽게 하지만 단단히 마우스를 처리 하 고 한 손으로에서 동물을 제 지. 동물 수 일반적으로 호흡을 하지만 하지 트위스트 감 중 설정 인지 확인 합니다.</li>
	<li>마우스 코를 주입에 대 한 복 부를 노출 바닥 쪽으로 약간 기울기. 왼쪽 또는 오른쪽 중간 선에서 낮은 복 부에 복 부와 주입 장소의 중간을 찾습니다. 컨트롤 마우스에 LPS 대신 i.p. PBS를 삽입할.</li>
	<li>자유 재량으로 적절 한 볼륨 (볼륨 단계 2.2에서에서 계산) 주입 작업 솔루션 LPS의. 바늘 입력 했습니다 복 막 구멍으로 그렇지 않으면 복 부 근육 층에 잘못 주사 발생할 수 있는지 확인 합니다. 아직도, 이동 하지 마십시오 너무 깊이 바늘과 그 지역에 있는 내부 장기 부상 방지에 복 막 구멍으로.</li>
	<li>감 금 소 당 최대 5 마우스 케이지를 신중 하 게 동물을 반환 합니다.</li>
</ol>3입니다. 모니터는 쥐
<ol><li>발생과 endotoxemia의 심각도 대 한 8 h에 대 한 주입 후 주입 및 모든 2 h의 시간에 동물을 모니터링 합니다. 따라서, 이전에 게시 원고 24에서 적응 된 점수 시트 (표 1)를 사용 하 여.</li>
	<li>
표 1에 나열 된 다음 매개 변수에 대 한 LPS 주입 된 쥐를 점수
	<ol>
<li>일반적으로 부드러운 모피의 모양을 확인 합니다. 모피 뻗 치고, 칼 날 달린 푹신한 모피 불편 하거나 통증을 나타내는 경우, 1, 2, 또는 3 그들을 점수.</li>
		<li>마우스의 활동에 대 한 확인 합니다. 참고: 마우스 일반적으로 이동 자유롭게 먹고, 마시고, 등반, 전체 케이지 하지만 억제 또는 제한 된 활동 통증의 징조 수 있습니다.</li>
		<li>의식의 수준에 대 한 확인 하십시오. 참고: 마우스는 매우 호기심, 그리고 그들은 일반적으로 주변 조사 케이지 주위에 이동. 부족 또는 감소 운동 통증과 불편을 건의 할 수 있다.</li>
		<li>눈을 확인 하십시오. 참고: 건강 한 쥐에 완전히 열린 눈으로 예상 된다 하지만, 분 비, 가능 하 게 부분적으로 또는 완전 하 게 닫힌된 눈 통증의 표시 될 수 있습니다.</li>
		<li>호흡 속도를 확인 합니다. 참고: 건강 마우스 일반적으로 정상적이 고 급속 한 호흡 속도, 감소 된 호흡 속도 불편의 표시 될 수).</li>
		<li>호흡 품질에 대 한 확인 하십시오. 참고: 함께 또는 없이 헐 떡이 고 심한 흔적이 호흡 고통의 표시 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 조직 샘플링 Ribonucleic 산 (RNA) 추출 및 균질 화
<ol><li>컬렉션/균질 튜브 준비: 추가 1 mL 단일 단계 RNA 격리 시 약 2 mL 튜브에 prefilled 1.4 m m 세라믹 분야와 함께.</li>
	<li>적절 한 시간에 ((0 h) 전에 2 h, 4 h와 LPS 주입 후 8 h) exsanguination 뒤 마 취 과다 복용 (isoflurane)와 마우스를 안락사와 해 부와 함께 진행.</li>
	<li>피부와 내부 장기와 복 부 구멍이 함께 노출 근육 레이어 컷.</li>
	<li>조심 스럽게 비장, 간, 그리고 결 장 해 부, 지방에서 장기를 청소 하 고 얼음에 PBS에서 그들을 유지.</li>
	<li>가 위 또는 메스를 사용 하 여 각 기관에서 작은 조각 (약 0.5 cm 긴) 그만. 참고: 그것은 항상 각 마우스 (간, 근 위 또는 원심 부분의 결 같은 엽)에 오르간의 대략 동일한 부분에서 조각을 하는 것이 중요.</li>
	<li>곧 건조 한 종이 티슈의 조각에 조직 및 RNA 격리 시에 완전히 몰입 확인 하 고 컬렉션/균질 튜브에.</li>
	<li>고속 벤치탑 균질 화기에 조직 균질 비장, 간, 그리고 콜론 균질의 1 개 주기에서 사용 속도 6.00 30 같은 부드러운 조직에 대 한 s.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 장소를 액체 질소에 튜브 동결 조직 lysate. RNA 분리까지 lysate-80 ° C에서 냉동 스냅을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 조직에서 RNA 추출
참고: RNA 격리 시 약, 클로 프롬, 및 알콜 유해 물질로 간주 됩니다. RNA 추출 화학 후드 수행 합니다. RNase 없는 환경을 유지 하기 위해 인증 RNase 무료 시 약 및 장비를 사용 합니다.
<ol><li>
상 분리
	<ol>
<li>냉동된 조직 lysate 얼음에 녹여</li>
		<li>1000 x g 남아 있을 수 있습니다 남아 있는 조직 입자를 펠 렛을 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심</li>
		<li>새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.</li>
		<li>200 µ L 얼음 클로 프롬 / 1 mL RNA 격리 시 약을 추가 하 고 10-15 s 손으로 적극적으로 악수.</li>
		<li>실 온에서 2-3 분 동안 품 어.</li>
		<li>12에서 원심 분리기, 4 ° c.에 15 분 동안 000 x g 참고: 샘플 이제 3 단계 포함 됩니다: 빨간색 페 놀-클로 프롬 위상과 interphase, 상단 무색 수성 단계 낮은. RNA는 위 수성 단계에 존재.</li>
		<li>위 수성 단계 (총 볼륨의 50%)와 전송 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 강 수
	<ol>
<li>1 mL RNA 격리 시 당 0.5 mL 얼음 처럼 차가운 소 프로 파 놀을 추가 하 고 반전 튜브 5-6 번으로 부드럽게 혼합.</li>
		<li>실 온에서 10-15 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 참고: RNA 펠 릿이이 단계에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 펠 릿의 세척
	<ol>
<li>완전히 제거는 펠 렛을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 포함 하는 상쾌한.</li>
		<li>1 mL RNA 격리 시 약 사용 초기 세포 당 1 mL 차가운 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>짧게 샘플 소용돌이입니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리기 7500 (12000) x g에서 샘플</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA를 용 해
	<ol>
<li>완전히는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한에 에탄올을 제거 합니다.</li>
		<li>3-5 분 실 온에서 RNA 펠 릿 건조 화학 후드 아래 열린된 관 두고 (-건조 하지 마십시오 경우 그것은 RNA를 분해 하기 어려운 것으로).</li>
		<li>신중 하 게 여기저기 pipetting으로 20-50 µ L nuclease 무료 물에 RNA 펠 릿을 디졸브.</li>
		<li>더는 RNA의 솔루션을 개선 하기 위해 10-15 분 55 ° C에서 샘플을 품 어. 참고:이 단계에서 RNA는 추가 분석까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 나머지 DNA의 소화
<ol><li>분 광 광도 계는 분 광 광도 계에는 약 수 (2 µ l)를 pipetting으로 RNA 농도 측정 하 고 권장된 농도를 조정 합니다.</li>
	<li>Max DNA 오염의 소화를 시작 합니다. 50 µ L nuclease 무료 물에는 10 µ g RNA</li>
	<li>DNase I 버퍼와 1 µ L rDNase 샘플 및 혼합 pipetting으로 부드럽게 나 고 아래로 x 10의 0.1 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>소용돌이 DNase 비활성화 시 약 0.1 볼륨 피펫으로와 잘 혼합 하는 샘플을 추가 하 고.</li>
	<li>가끔 손으로 혼합 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>1.5 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한 새 nuclease 무료 튜브에 RNA DNA 무료 포함 된 전송 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계에 의해 RNA 농도 품질을 측정 합니다.</li>
</ol>7. 반전 녹음 방송
<ol><li>반전 녹음 방송에 대 한 상용 Deoxyribonucleic acid cDNA 반전 녹음 방송 (RT) 키트를 사용 합니다. 참고: 여기, RNA의 2 µ g까지 되돌릴 수 있습니다 베낀.</li>
	<li>2 µ g RNA를 포함 하는 볼륨을 계산 합니다. 새로운 PCR 튜브에 2 µ g RNA 플라스틱</li>
	<li>10 µ L의 최종 볼륨을 PCR 튜브에 샘플 nuclease 무료 물을 추가 합니다.</li>
	<li>표 2 에 나열 된 다음과 같은 구성 요소를 혼합 하 여 마스터 믹스 2 x 준비
</li>
	<li>20 µ L의 총 볼륨 믹스 마스터 x 1를 10 µ l RNA 마스터 믹스 x 10 µ L 2를 추가 합니다.</li>
	<li>중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브 및 샘플 다운 스핀을 잠시 닫습니다.</li>
	<li>PCR Thermocycler에서 샘플을 놓고 표 3에 나열 된 설정을 설정 합니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해-20 ° C에서 생성 된 cDNA를 저장 합니다.</li>
</ol>8. 정량적 PCR (정량)
<ol><li>상용 키트 정량 Pcr 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>자체 디자인과 intron 스패닝 뇌관의 템플릿 cDNA의 다른 농도와 사용 하기 전에 테스트. 표준 곡선을 작성 하 여 뇌관의 효능을 분석 하 고 뇌관을 사용 하 여 높은 효능과 올바른 녹는 곡선. 참고:이 실험에 사용 된 뇌관의 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다.</li>
	<li>표 4에 설명 된 반응 설치 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 반응 384-잘 접시에서를 준비 합니다.</li>
	<li>모든 솔루션 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 반응 혼합물이 준비 될 때 젖 지 접시를 방지 하기 위해 얼음에 플레이트를 유지.</li>
	<li>Triplicates 모든 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>표 5에 나열 된 설정을 사용 하 여 thermocycler에 PCR 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>triplicates에서 모든 반응에 대 한 평균 Ct 값을 계산 합니다. Glycerinealdehyde-3-인산 염-효소 식 수준에 모든 대상 유전자를 정상화 (Gapdh) 2^(-ΔCt)를 계산 하 여 내부 관리 유전자. 참고: 모든 대상 유전자 평균 Ct와 > 35 검출 한계에서 것으로 간주 되었다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 미생물-파생 제품에 의해 침공 후 발생 하는 면역 프로세스를 모방 합니다. 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 마우스 선, 쥐의 위생 상태, LPS, endotoxemia, 발생과 실험 종료의 시간 포인트에 대 한 동물의 모니터링의 복용량의 선택. 가장 중요 한 것은, 마우스 스트레인의 유전 배경 고려 될 수 있다. 다른 마우스 긴장 다른 민감성 LPS에 있다. 예를 들어 C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 마우스 LPS에 강한 ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57610/injections-lipopolysaccharide-into-mice-to-mimic-entrance-microbial">Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach</a>
One of the authors&#39; names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic

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Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

인간의 소장 진화 하는 동안 호스트와 상호 유익한 관계를 개발 했다 누가 microbiota을 형성 하는 미생물의 큰 컨소시엄 식민지 이다. 이 관계에서 호스트가 합니다 보안 틈새를 microbiota는 microbiota 비타민, 영양소 소화 및 병원 체에서 보호는 microbiota 있는1호스트를 제공 하는 반면. 호스트와는 microbiota 사이이 유익한 관계를 방해 하는 경우 질병을 개발할 수 있습니다, 선 동적인 장 질병 (IBD). IBD은 두 가지 주요 형태, Crohn의 질병 (CD) 및 궤 양성 대 장 염 (UC)에서 발생 하는 유전과 환경 요인에 의해 발생 하는 장의 multifactorial 만성 염증 성 질병 이다. 두 IBD 형태 사이의 유사성에도 불구 하 고 그들은 위치와 염증 성 수정의 성격에서 특정 차이 특징 이다. CD 동안 UC 비 과거 이며, 콜론으로 소화 관의 어느 부분에 잠재적으로 확장할 수 있는 재발 과거 염증 성 질환 이다. 또한, 돌연변이 뉴클레오티드 바인딩 oligomerization 도메인에 포함 된 단백질 2 (NOD2), 패턴 인식 수용 체 (PRR) muramyl dipeptide (민주당), 가장 그람 양성 및-부정적인 박테리아의 세포 벽의 구성 요소를 인식 하는 CD2와 관련 된. 또한, 대장균 (대장균), Listeria 및 Streptococci 와 그들의 제품 모두 찾아냈다 세포 내 장벽을 위반3후 호스트를 입력 CD 환자에. 박테리아 또는 그들의 제품 CD의 개발 하는 동안 호스트를 입력, 면역 시스템 항균 항 체4순환의 생산에 지도 하는 응답을 개발 한다. 어쩌면, IBD의 병 인에서 microbiota의 역할에 대 한 가장 설득력 있는 증거는 마우스 모델에서 유래한 다. 동물 항생제로 처리 됩니다 또는 마우스 세균 무료 (GF) 조건에서 보관 하는 경우, 질병의 심각도 IL-10-/-생쥐에서 GF 시설5,6대 장 염을 개발 하지 않는 그와 같은 대부분의 대 장 염 모델에서 감소 된다. 또한, 대 장 염도 불균형 구성 특징 이다 고 dysbiosis7라고 하는 부유를 감소 microbiota의 구성을 방해. IBD의 결과 미생물 및 미생물에서 파생 된 제품의 입구는 호스트에 될 수 있는 증가 창 자 침투성을 될 수 있습니다.
동물, 응용 Dextran 황산 나트륨 (DSS)의 상피 장벽은8의 증가 한 침투성을 선도 하는 장 상피 위반을 유도 합니다. 포털 LPS 농도 DSS colitis9동물에서 상승 된. 흥미롭게도, 동물 부족 C 유형 lectin 수용 체 특정 세포내 접착 분자-3 nonintegrin를 잡는 체 관련 1 (로그인-R1)는 보호 DSS colitis 및 LPS 유발 endotoxemia10에서. 호스트에 추가 보급, 세균 이나 박테리아 파생 제품 혈관 장벽11, 크고 작은 창 자 위치는 복 막 구멍, mesenteric 임 파선 또는 간12를 통과 해야 합니다. 이 시스템의 복잡성을 줄이기 위해, 정의 된 박테리아에서 파생 된 화합물이 사용 되었다. LPS, 복 (i.p.) 또는 정 맥 (i.v.) 후 endotoxemia를 주입13 interleukins Il6 표현 및 Ilb cytokine Tnfa LPS에 대 한 응답에서을 공부 하 고 쥐에 주입 했다.
LPS는 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 지질 A의 구성 된 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소로 표현 (LPS의 구조에서 주요 PAMP), 코어 올리고 당 및 O를 사이드 체인14. 수용 체 통행세 같이 4 (TLR4) 수지상 세포, 대 식 세포, 상피 세포에 의해 표현 LPS15, 적절 한 바인딩을 위한 공동 수용 체 필요한 인식 합니다. 급성 위상 단백질 LPS-바인딩 단백질 (LBP) 전송 LPS 차별화 14의 클러스터 (CD14), glycosylphosphatidylinositol 고정 막 단백질 복잡 한 형태로 LPS 바인딩합니다. CD14 더 LPS 림프 구 항 원 96 또는 라고도 MD 2 셔틀 TLR4의 세포 외 도메인 관련 됩니다. MD-2 LPS의 바인딩 TLR4/MD-2의 세포내 어댑터 분자는 하류 신호 통로14, 골수성 차별화 기본 포함 활성화를 모집 하는 구조적 변화를 유도 이합체 화를 용이 하 게 응답 유전자 88 (MyD88)-종속 통로는 사격 포함 하는 도메인 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF)-종속 통로16. LPS TLR4에 의해의 인식 다음 NF κB 통로 활성화 하 고 TNFα, 일리노이-6와 일 1β17proinflammatory cytokines의 표정을 유도 한다.
특히, LPS는 동물, 동물, 주어진 LPS의 농도에 주입 하는 경우는 동물 및 다이어트의 유전 배경 간주 있다. 부패 시키는 충격, 저 혈압 및 다 수 기관 실패, 특징 이끌어 낸다 LPS의 높은 농도 그리고 마지막으로 죽음18. 마우스는 덜 민감한 LPS 인간에 비해 2-4 ng/kg 체중 (BW) 사이 LPS 농도 cytokine 폭풍19유도 수 있습니다. 마우스, 치 사 량 (LD50) 쥐 에서부터 사용 마우스 스트레인에 따라 10-25 mg/kg BW20 의 죽음을 유도 일반적으로 사용 되 마우스 긴장, C57Bl/6와 BALB/c에 대 한 치 사 량 50% (LD50)은 10 mg/kg BW. 반면, C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 긴장 하 Tlr421돌연변이 유도 LPS endotoxemia에서 보호 됩니다. 따라서, Tlr4 불충분 한 쥐 hyporesponsive LPS22에 주사 하는. PARP1/마우스23 같은 다른 유전자 변형된 마우스 라인은 LPS 유발 독성 쇼크에 저항 한다.
마우스 모델 설명 여기 모방 신체의 표면의 장벽 위반 후 LPS 보급의 결과를 체계적으로 관리 하는 LPS의 sublethal 복용량을 사용 합니다. C56Bl/6 생쥐에서 사망 하지만 프로 염증 성 cytokines의 유도 방출을 선택한 LPS 농도 (2 mg/kg BW) 유도 하지 않았다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="896">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td>
			<td style="width:303px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:119px;">K1081</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,</td>
			<td style="width:303px;">Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-Free DNase Set,</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnican 50 Single-use insulin syringe</td>
			<td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany</td>
			<td>9151125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Mikro 220R</td>
			<td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System</td>
			<td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRI Reagent</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td>
			<td>R2050-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of lipopolysaccharide into mice to mimic entrance of microbial-derived products after intestinal barrier breach

장 상피 방 벽에서 일반적으로 용납 되거나 무시 되는 microbiota 호스트를 구분 합니다. 이 방 벽의 위반 호스트, 호스트 순환 및 통제 염증으로 선 동적인 장 질병 (IBD), 환자에서 관찰 선도 하는 내부 장기로 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구에 발생 하는 증가 창 자 상피 침투성에 의해 특징.
호스트에 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 endotoxemia 모델 어떤 lipopolysaccharide (LPS), 그램 음성 박테리아의 외부 세포 벽의 구성 요소에서에서 채택 되어, 쥐로 주입 했다. 이 연구에서 LPS의 sublethal 복용량 intraperitoneally 주사 하 고 쥐 8 h 질병의 점수를 사용 하 여 연속적으로 감시 되었다. 또한, 염증 성 cytokines Il6, Il1b, 및 Tnfa 의 수준을 다른 시간 지점에서 정량 하 여 비장, 간 및 콜론에 분석 되었다 식 LPS 주입 게시. 이 모델은 미생물 또는 신체 표면의 장벽 위반으로 인 한 세균성 파생 제품의 침공 후 면역 반응의 조사를 포함 하는 연구에 대 한 유용할 수 있었다.

장 장벽 위반 후 발생 하는 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구 후 호스트에 대 한 결과 모방, LPS는 C57Bl/6 마우스 sublethal 복용량 (2 µ g/g 몸 무게)에 주입 했다. 모든 단일 마우스 모니터링 되었고, 쥐의 모양, 동물, 눈의 상태와 호흡 속도 및 품질 (표 1)의 활동을 포함 하는 점수 시트에 나열 된 매개 변수를 endotoxemia의 발생에 대 한 득점 . 동물은 LPS의 주입 후 6...

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Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

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19.3K 조회수.  University of Basel. 여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

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A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models of ALI are key in enhancing our understanding of disease pathogenesis. Lipopolysaccharide (LPS) derived from gram positive bacteria induces neutrophilic inflammation in the airways and lung parenchyma of mice. Efficient pulmonary delivery of compounds such as LPS is, however, difficult to achieve. In the approach described here, pulmonary delivery in mice is achieved by challenge to aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS. Dissolved LPS was aerosolized by a nebulizer connected to compressed air. Mice were exposed to a continuous flow of LPS aerosol in a Plexiglas box for 10 min, followed by 2 min conditioning after the aerosol was discontinued. Tracheal intubation and subsequent bronchoalveolar lavage, followed by formalin perfusion was next performed, which allows for characterization of the sterile pulmonary inflammation. Aerosolized LPS generates a pulmonary inflammation characterized by alveolar neutrophilia, detected in bronchoalveolar lavage and by histological assessment. This technique can be set up at a small cost with few appliances, and requires minimal training and expertise. The exposure system can thus be routinely performed at any laboratory, with the potential to enhance our understanding of lung pathology.

We describe a method for inducing neutrophilic pulmonary inflammation by challenge to aerosolized lipopolysaccharide by nebulization, to model acute lung injury. In addition, basic surgical techniques for lung isolation, tracheal intubation and bronchoalveolar lavage are also described.

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

(: C I) 바이러스 성 모방 폴리와 중간 임신 단계에서 마우스의 모성 면역 활성화 유도

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

구두 항생제 치료 후 Murine 장 Microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has hindered the development of a preventative drug. Primarily, finding a suitable animal model is challenging in understanding the mechanism of Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis pathology. Here, we adopted an effective method where TNBS chemical exposure to mice rectums produces substantially deep ulceration and chronic inflammation, and the mice then chronically develop intestinal fibrosis. Also, we describe a technique where a rapamycin injection shows inhibitory effects on TNBS-mediated fibrosis in the mouse model. To assess the underlying mechanism of fibrosis, we methodically discuss a procedure for purifying Cx3Cr1+ cells from the lamina propria of TNBS-treated and control mice. This detailed protocol will be helpful to researchers who are investigating the mechanism of fibrosis and pave the path to find a better therapeutic invention for Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis.

In this study, we describe a detailed procedure of TNBS-mediated intestinal fibrosis, which exhibits comparable pathophysiology to Crohn&#39;s fibrosis. We also discuss this approach in light of rapamycin facilitated inhibitory effects on intestinal fibrosis.

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates the isolated patient&#8217;s blood mononuclear cells (e.g., lymphocytes and monocytes) through an apheresis machine, co-cultures the patient&#8217;s blood mononuclear cells with adherent cord blood-derived stem cells (CB-SC) in the SCE device, and then returns these &#8220;educated&#8221; immune cells to the patient&#8217;s blood. Exosomes are nano-sized extracellular vesicles between 30&#8210;150 nm existing in all biofluid and cell culture media. To further explore molecular mechanisms underlying SCE therapy and determine the actions of exosomes released from CB-SC, we investigate which cells phagocytize these exosomes during the treatment with CB-SC. By co-culturing Dio-labeled CB-SC-derived exosomes with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), we found that CB-SC-derived exosomes were predominantly taken up by human CD14-positive monocytes, leading to the differentiation of monocytes into type 2 macrophages (M2), with spindle-like morphology and expression of M2-associated surface molecular markers. Here, we present a protocol for the isolation and characterization of CB-SC-derived exosomes and the protocol for the co-culture of CB-SC-derived exosomes with human monocytes and the monitoring of M2 differentiation.

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

Exosome application is an emerging tool for drug development and regenerative medicine. We establish an exosome isolation protocol with high purity to isolate exosomes from novel identified stem cells called CB-SC for mechanistic studies. We also coculture CB-SC-derived exosomes with human monocytes, leading to their differentiation into phenotypically distinct macrophages.

인간 코드 혈액 줄기 세포 (CB-SC)-유래 엑소좀으로 치료 후 페노전성 뚜렷한 대식세포로 단핵구를 분화

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...