단일 클론 항체는 단일 B 림프구 클론과 동일한 에피토프에 결합하는 단발성 항체로부터 생산되는 모노 특이적 항체로 알려져 있다. 최근에는 단일클론 항체 기반 ELISA가 식품 또는 천연 물의 질적 또는 정량적 분석을 위한 새로운 플랫폼이 되었습니다. 이 방법은 지루한 전처리 단계없이 정확하고 민감하며 효과적인 방법입니다.
따라서 생물학적 샘플과 미래의 임상 적용에 필수적입니다. TCM의 MABs의 준비는 TCM 공식의 복잡한 시스템 특성에 대한 연구에서 중요한 단계입니다. 인공항원 합성, 마우스 예방 접종 및 세포 융합을 포함한 작은 분자 화합물에 대한 mAB를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.
상기 햅텐은 인공 항원합성을 위해 담체 단백질과 연결된다. 인공 항원 및 완전한 보조제는 혼합 및 유화됩니다. 마우스는 피하 주입에 의해 면역되었다.
예방 접종 마우스의 비장을 꺼내 단일 셀 서스펜션을 합니다. 골수종 세포를 혼합합니다. 비장세포는 PEG 방법에 의한 HAT 에 민감한 마우스 골수종 세포주와 분리되고 융합된다.
ELISA에 의해 항체를 준비할 수 있는 세포줄을 선택합니다. 항원에 반응하는 단클론 항체를 분비하는 Hybridomas는 복제됩니다. 잡종 세포주 분주 보존을 확립한다.
주기적인 산화 절차는 나리진 BSA 공주물의 합성을 위해 사용되었다. 첫째, narigin은 새로 준비된 나트륨 pariodate 용액의 100 마이크로리터에서 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도에서 나리진 용액의 5밀리리터에 용해되었습니다. 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 저어.
둘째, 나리진 나트륨 주기반응 혼합물에 담체 단백질 2밀리리터를 첨가한다. pH 9 용액에 혼합물을 조정하고 6 ~ 8 시간 동안 계속 반응합니다. 셋째, 인공 항원은 CBS를 분리하기 위해 3 일 동안 PDS의 투석 방법으로 정제되었다.
Freund의 완전한 보조제와 불완전한 보조제는 마우스 예방 접종에 사용되었습니다. 예방 접종을 위해, 50 마이크로그램의 공주를 Freund의 완전한 보조제와 동일한 양으로 혼합하고 완전히 유화하십시오. 등쪽 피하 주사를 통해 각 BALB/c 마우스에 이 혼합물의 100 마이크로그램을 관리합니다.
2주 후 피하 주사를 통해 부스터 예방 접종을 제공하며, 동일한 양의 컨쥬게이트와 불완전한 보조가 섞입니다. 1차 예방접종을 위해, Freund의 완전한 보조제 및 면역원들은 피하 주사를 통해 사용되었습니다. 부스터 예방 접종의 경우, Freund의 불완전한 보조제와 면역원은 피하 주사를 통해 사용되었습니다.
보조제 없이 충격 예방 접종을 위해, 만 피하 주사 또는 관음 주사를 통해 사용 되었다. 사료 층 세포는 주로 복부 상피 세포 또는 대식세포에서 유래하였다. RPMI 1640 FBS 및 HAT은 HAT 화면 매체를 준비하는 데 사용되었습니다.
HAT 보충제는 10 밀리리터 RPMI 배지에 용해된 다음, 20%의 FBS를 함유한 500밀리리터 RPMI 1640에 첨가하였다. 그리고 ICR 마우스는 5 분 동안 75 %에틸 알코올에 의해 살균되었다. 혈전성 집게로 복부에서 털을 제거 한 후 75 %의 에탄올로 영역을 소독하십시오.
복강을 노출하기 위해 외부 피부를 잘라. 멸균 RPMI 1640 배지의 3 밀리리터를 복부에 주입한다. 그런 다음 복부를 마사지하여 추가 세포를 용액으로 분리합니다.
태아 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 흡입합니다. 1, 000g에서 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리한 후, 상신포를 폐기하고 태아 세포를 다시 일시 중단하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 이 절차 후 HAT 배지를 사용하여 세포를 용해하십시오.
세포 구성원으로부터 밀리리터 당 100, 000을 만들기 위해 세포를 계산합니다. 세포를 96개의 잘 세포 배양 판으로 옮기. 플레이트를 하룻밤 사이에 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
선택된 면역 마우스는 5분 동안 75%에틸 알코올로 살균하였다. 세척 버퍼로 흡인 RPMI 1640 배지. 비장을 노출 하는 가위를 사용 하 여 피부와 근육 조직을 제거 합니다.
핀셋에 의해 비장을 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 RPMI 1640에서 비장을 씻는다. 비장을 분리하고 조각으로 자른다.
천천히 비장을 두드렸다. 이어서 비장 세포 현탁액을 준비하기 위해 세포를 용해시키기 위해 RMPI 1640 배지로 처리하였다. 그 후, 세포는 800 메쉬 셀 스트레이너에 의해 여과되었다.
큰 조직을 제거하기 위해 조심스럽게 비장을 못을 박습니다. 큰 조직을 피하는 것은 세포의 융합에 영향을 미칩니다. RPMI 1640 배지를 가진 비장 세포 현탁액이었다.
그런 다음 세포 현탁액을 원심분리관에 첨가했다. 비장 세포를 원심분리로 1, 000g에서 10분간 수확하십시오. 그리고 상체를 폐기합니다.
비장 세포는 10억~100억 정도이어야 했다. 인큐베이터에서 재배 및 증폭 된 골수종 세포를 제거하고 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포 현탁액을 얻습니다. RPMI로 두 번 서스펜션을 했다.
비장 세포 현탁액과 골수종 세포를 혼합합니다. 세포를 계산하고 농도를 조정합니다. 골수종 세포에 비장 세포의 최종 배급은 1 개에서 5 1 - 10이어야한다.
세포 혼합물을 원심 분리한 다음 상체를 제거합니다. 50% 폴리에틸렌 글리콜 용액 1밀리리터를 세포에 넣고 1분 동안 37도에서 부드럽게 저어줍니다. 30초 동안 서 있는 RPMI 1640 배지 2밀리리터를 넣고 37도에서 2분간 인큐베이터를 추가하여 반응을 종료합니다.
2밀리리터 RPMI에 1분간 추가합니다. 그런 다음 10 밀리리터 RPMI 1640에 추가합니다. 원심 분리기 800g에서 10 분 동안.
상체를 폐기하고 HAT 용액을 추가하고 37도 5 %의 이산화탄소로 7 일 동안 세포를 계속 육성합니다. 7일 후, 96개의 웰 플레이트에서 세포 수퍼넌트는 세포 융합 후 흡량하여 코팅 항원으로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 1시간 동안 37도에서 재배된 이차 항체를 반시간 동안 첨가하고 재배했다.
기판 용액 100 마이크로리터를 추가한 후. 반응을 중지합니다. 마이크로 플레이트 판독기로 ELISA 플레이트에, 엔드포인트 방법은 450 나노미터에서 데이터를 읽는 데 사용되었다.
450 나노미터에서 흡광도를 측정하고 양성 혼성종을 검사합니다. 단클론 혼종을 준비하기 위해 제한 희석 방법을 사용합니다. 선택한 혼성종에서 HD 배지를 제거한 후 RPMI 1640에서 세포를 다시 일시 중단하고 계산합니다.
96웰 플레이트 및 배양에서 RPMI 1640에 의해 1세포, 2개의 세포 및 4개의 세포의 세포를 잘 희석시 희석한다. 양성종에서 24개의 웰 플레이트, 25 및 75 평방 센티미터 플라스크로 양성되는 세포가 재배를 위한 전달한다. 24시간 동안 마이너스 80도의 그라데이션 냉각 상자에 묘도마를 보관합니다.
그런 다음 장기 저장을 위해 액체 질소로 옮깁니다. 항세럼의 티터는 간접 ELISA에 의해 결정되었다. 마우스 1~4개는 나리진 BSA 공주물로 예방접종을 받았고, 예방접종 없이 대조군 마우스보다 현저히 높았다.
1 ~5, 000의 티터는 충분한 확산이다. 햅텐 공자의 분자량은 MALDI-TOF 분석에 의해 확인되었다. 그림 2에 도시된 바와 같이, BSA 표준 및 나리진의 분자량이 알려져 있기 때문에, 우리는 나리진의 분자가 BSA와 결합되었다는 것을 계산하고 결정할 수 있다.
오직 혼종만이 HAT 선택 미디어에서 생존하고 성장할 수 있습니다. 7일간의 성장 후, 세포 배양은 ELISA에 의해 시험될 수 있다. 양성 종은 다시 복제 및 확장되었다.
이러한 이미지는 안정적인 단일 클론 및 폴리클론 혼종 세포주를 위한 종래의 결과를 보여줍니다. 이 실험의 중요점은 햅텐에 특이적인 mAbs를 스크리닝하지만 담체 단백질은 검사하지 않는다. mAb의 특이성은 그 때 그밖 구조적으로 관련한 화합물의 존재에서 검토되었다.
교차 반응성은 항원에 대한 mAb 특이성을 평가하기 위해 계산되었다. 내레이션진과 라이너 범위의 보정 곡선을 획득하였다. 항원 특이적 단일클론 혼종은 장기간 저장을 위해 액체 질소로 확장및 냉동 보존되었다.
이 비디오를 본 후, 나는 당신이 작은 분자 화합물에 대한 단일 클론 항체를 생성하는 방법에 대한 좋은 이해가 있기를 바랍니다. 그래서 그게 전부입니다. 당신의 실험에 대한 당신의 보고와 행운을 주셔서 감사합니다.
