이 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단일 세포 수준에서 종 간 세균 상호 작용의 시각화 및 추적을 허용합니다. 이 기술은 세포 추적, 유전자 발현 및 생존 성 염색을 포함하여 세균성 상호 작용을 연구하는 그것의 적용성입니다. 추가적으로, 조건은 다른 유기체를 공부하기 위하여 수정될 수 있습니다.
우선, 깨끗한 50 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에서 세균 성장 매체의 10 밀리리터에서 2% 낮은 녹는 아가로즈를 녹여 아가로즈 패드를 준비하십시오. 아가로즈가 용액이 될 때까지 짧은 간격으로 플라스크를 전자 레인지에 넣고 50도 의 수조에서 적어도 15 분 동안 식힙니다. 35mm 접시에 구멍을 잘라 실리콘을 정렬 한 다음 접시를 뒤집고 가볍게 주걱으로 잘라 실리콘을 눌러 접시에 고정하고 기포를 제거합니다.
아가로즈가 식으면 용융 아가로 915 마이크로리터가 금형에 들어가 패드를 건조하게 합니다. 현미경 환경 챔버를 실험 설정 하기 전에 적어도 2 시간 전에 실험 온도에 따뜻하게. 보풀이 없는 물티슈를 단단히 굴려 습도 물티슈를 준비합니다.
압연 닦은 닦은 닦기를 멸균 페트리 접시 안에 넣고 500 마이크로리터의 멸균물을 물티슈에 직접 넣습니다. 모든 재료를 상량화하기 위해 물티슈, 패드 및 멸균 35mm 접시를 실험 온도로 데우기 위해 데우습니다. 패드가 건조되면, 파이펫 의 마이크로 리터는 사전 따뜻하게 멸균 35 밀리미터 유리 커버 슬립 접시의 바닥에 걸쳐 균등하게 공동 배양의 마이크로 리터.
멸균 핀셋을 사용하여 아가로즈 몰드에서 잘라낸 실리콘을 제거하고 측면으로 기울인 후 아가로즈 패드 가장자리 아래에 약간 구부러진 주걱을 미끄러져 멸균 페트립레이트 뚜껑에 떨어뜨립니다. 패드 아래에 90도 각도주걱을 슬라이딩하고 접종 커버 슬립의 상단에 배치하여 아래로 세균 세포와 접시에 패드를 전송합니다. 주걱을 사용하여 패드가 덮개 슬립에 플러시되도록하고 기포를 부드럽게 내보냅니다.
촉촉한 닦아에서 여분의 수분을 제거하고 접시의 가장자리에 배치, 그것은 패드를 만지지 않도록. 샘플은 이제 이미징을 위한 준비가 되었습니다. 접종 패드 이전에는 모든 이미지 프레임을 정렬하기 위해 색상 조명을 수행하여 현미경을 설정합니다.
접종 된 요리가 준비되면 100X 목표로 요리를 보고 박테리아 결과에 집중하십시오. 이미징 소프트웨어에서 위상 옵션을 클릭하고 광원을 선택하고 광 퍼센트 척도에서 막대를 슬라이딩하여 방출되는 DIA LED 라이트의 백분율을 조정합니다. 또는 노출 시간을 수동으로 입력합니다.
위상 채널을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 현재 현미경 설정 할당 옵션을 선택하여 위상 채널의 설정을 저장합니다. 형광을 사용하는 경우, 관심의 형광 채널을 선택하고 방출 형광의 비율을 설정한 다음 이전에 설명된 대로 노출 시간을 조정합니다. 또는 드롭다운 메뉴의 다른 옵션 중 하나를 선택하여 입찰 깊이를 변경하여 동적 범위를 조정합니다.
형광 채널을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 현재 현미경 설정 할당 옵션을 선택하여 형광 채널의 설정을 저장합니다. XY 탭에서 포인트 이름 열의 상자를 클릭하여 선택한 XY 관심 위치를 저장합니다. 그런 다음 탭 하단의 PFS 상자를 클릭하여 완벽한 포커스 시스템을 켭니다.
셀에 초점을 맞추고 PFS 열의 화살표를 클릭하여 XY 위치의 포커스를 저장합니다. 다른 모든 XY 위치에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 이전에 설명한 대로 위상 탭 아래에 XY 위치에 대한 설정을 저장합니다.
시간 탭을 클릭하고 확인란을 선택하여 획득 간격, 빈도 및 이미징 기간을 선택합니다. 그런 다음 웨이브 길이 탭을 클릭하고 확인란을 선택하여 이미징 및 채널 간격 주파수에 사용할 채널을 선택합니다. 설정으로 낚시를 할 때 지금 실행을 클릭하여 시간 경과 이미징을 시작합니다.
S.aureus와 공동 배양시 뗏목에서 그룹화 된 단일 배양식의 P.aeruginosa 세포와 비교하여 P.aeruginosa는 S.aureus 식민지를 향한 단일 세포 운동성을 증가시켰습니다. P.aeruginosa 단일 세포는 포위하고 결국 S.aureus 식민지를 침공합니다. 실험 중 습도가 너무 많거나 너무 적고 잘못 말린 패드는 패드 이동 및 시야에서 세포를 드래그하여 표류하는 두 가지 일반적인 문제입니다.
사진 표백 및 사진 독성은 먼저 세포를 일으킬 수 있습니다, 자신의 형광을 느슨하게 다음 분할을 중지하고 결국 후속 프레임에서 죽을. 처음에 근접한 세포는 다른 종들이 반응할 수 있는 분비된 신호의 그라데이션을 확립하기에 충분한 시간이 없을 수 있습니다. 세균세포 생존성은 아가로즈 패드에 프로피듐 요오드를 첨가하여 시각화할 수 있다.
녹색 세포는 GFP를 능동적으로 표현하는 살아있는 세포를 나타내고, 적색 세포는 P.aeruginosa 세포 무첨가체로 취급된 후에 죽은 예오드요오드 스테인드 세포를 표시합니다. 개별 P.aeruginosa 세포의 움직임은 세포가 S.aureus 클러스터에 도달하는 프레임을 통해 뗏목을 떠나는 프레임에서 추적됩니다. P.aeruginosa 뗏목과 S.aureus 클러스터 사이의 거리는 유클리딘 거리를 제공하며, 총 트랙 길이는 누적 된 거리를 제공합니다.
각 셀의 지향성은 축적된 거리에 대한 유클리드 거리의 비율로 계산됩니다. 야생형 P.aeruginosa는 방향성 운동성에 필요한 아그 규제 분비 요인이 부족한 S.Aureus를 향한 것보다 훨씬 높은 지향성을 가진 야생 형 S.aureus쪽으로 이동합니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 각 조사관은 지리적 위치, 실험실 환경 및 특정 실험에 근거를 둔 라이브 이미징에서 아가로즈 패드를 건조하기위한 조건을 최적화해야한다는 것을 명심하는 것이 중요합니다.
이 기술은 이전에 대량 문화에 있는 그들의 행동의 우리의 조사 도중 가려진 슈도모나스와 황색포도상구균 aureus 사이 상호 작용을, 이 유기체가 감염 도중 상호 작용하는 방법에 저희에게 가까이 가져오는 것을 보여줍니다.
