We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. 피크 방출 및 크로스 토크 결정 (또한 그림 2 참조) <ol><li> , 발광 피크와 도너 사이의 크로스 토크 (쿠마린 유도체의 V450) 및 억 셉터 (형광) 염료의 양을 결정 405㎚, 여기에서 개별 형광 표지 된 세포 모두의 스펙트럼 스캔을 수행하기 위해. </li><li> 기증자 및 수용체 채널 (여기 455-465 nm의 525-535 ㎚)에 사용되는 각 염료의 피크 내에서 10 nm의 대역폭을 결정합니다. 파장 통해 규격화 강도를 플롯 및 수용체 채널 반대 (도 2)에 도너 염료의 크로스 토크 (cross-talk)의 평균 백분율을 계산한다. </li></ol> (Y) 2. 준비 세포 배양 감염 enterocolitica 균주 <ol><li> 다음 균주를 사용 WA-314 PMK-난자가와 (WA-314 17 PMK-즐와 PMK-OVA (17), 각각 플라스미드로 형질 전환) WA-314ΔYopE PMK-즐 (가 물에) 17 314ΔYopE는 플라스미드로 형질 전환 된 PMK-즐 </li><li> 감염 행진 Y. 전에 ​​적어도 이일 enterocolitica 균주 WA-314 PMK-OVA, WA-314 PMK-즐와 WA-314ΔE WA-314 PMK-즐 및 WA-314 PMK-난자에 대한 (카나마이신 필요한 항생제를 포함하는 LB 한천 플레이트에 주식을 알아내는로부터 PMK는-BLA , 카나마이신 및 WA-314ΔE PMK-즐위한 테트라 사이클린), 27 ℃에서 O / N 성장. 이후 일주까지 4 ℃에서 대한 번호판을 유지. </li><li> 감염 전 어느 날 각각의 균주 중 하나를 식민지로 필요한 항생제를 포함하는 LB-매체의 3 ㎖를 접종하고 180 rpm으로 진탕 기에서 27 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> 감염 일에 항생제없이 신선한 LB-배지 40 ㎖ 중에 O / N 배양 2 ㎖를 접종 및 유형 III 분비 시스템의 발현을 유도하기 위해 180 rpm의 진탕 기에서 37 ℃에서 90 분 동안 배양한다. </li><li> 적절한 튜브에 문화를 전송하고 C 얼음 또는 4 °에서 문화를 유지지금부터. 5,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 문화를 원심 분리기. </li><li> 얼음의 2-3 ml의 차가운 PBS의 세균 펠렛을 재현 탁. 분광 광도계를 사용하여 8 × 108 CFU / ml의 농도에 세균 현탁액을 희석. 개별적으로 대응하는 광학 밀도를 결정한다. 헬라 세포를 감염 때까지 얼음이 현탁액을 유지합니다. </li></ol> 3. 도금 HeLa 세포 <ol><li> 96 웰 플레이트의 웰에 10 % 열 비활성화 우태 혈청 (FCS)을 함유하고, 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양을 200㎕ DMEM에 하루 감염 종자 전에 1.5 × 104 세포 HeLa 세포. 각 변형 (세 가지 다른 배양 시간) 세 우물을 시드. </li></ol> 4. 헬라 세포의 감염 및 CCF4에 넣기 <ol><li> 배지에 세균 현탁액의 3.5 μl를 첨가하여 HeLa 세포를 감염 부드럽게 매체 회 피펫 팅하여 혼합한다. 박테리아가 침전 허용세포 당 약 100 박테리아의 MOI (감염의 부위)에 세포. 시간 코스 -90 분, -60 분, -30 분에서 감염을 시작하고 공통 종료점을 달성하기 위해 0 분까지 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 배양이 완료되면, 신중 HeLa 세포를 제거하지 않고 매체 대기음 CCF4 수출 감소 이펙터 2.5 밀리미터 베네 시드의 발현을 20 μg의 정지 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 PBS의 50 μL를 추가한다. </li><li> 이 시점에서 현미경 단계로 96 웰 플레이트를 전송하고 잘 각각 나중에 분석을 위해 적합한 장소를 정의합니다. 10 분 이내에이 단계를 완료 (취득 자세한 내용은 5.1 절 참조). </li><li> 당이 아니라, 20을 포함 CCF4 / AM 로딩 용액 (0.24 ㎕의 용액 1.2 μL 용액 B 70 μL, 18.56 μL 용액 C (용액 A, B 및 C는 CCF4 / AM 로딩 키트 내에 제공) 50 μL PBS를 (ADD 다중 페이지를 사용하여 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 2.5 MM의 프로 베네 시드)ipette 실온에서 5 분 동안 품어합니다. 지금 일에 중단없이부터. </li><li> 로딩 솔루션을 기음과 멀티 피펫을 사용하여 20 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 2.5 MM의 프로 베네 시드를 포함하는 PBS 100 μL를 추가합니다. 그리고 빠르게 현미경 단계로 96 웰 플레이트를 전송 및 로딩 솔루션의 열망에서 10 분 이내에 수집을 시작합니다. </li></ol> 5. 레이저 스캐닝 현미경 및 데이터 분석 <ol><li> 이미지 획득 <ol><li> 광독성, photobleaching에 크로스 여진을 전체 광자 수를 최대화하고 최소화하기위한 방법으로 촬상 조건을 설정한다. <ol><li> 현대 공 초점 레이저 주사 현미경에서 동시에 활성화 기증자 및 수용체 채널, 8 비트 깊이와 높은 감도 하나로 이루어질 수 탐지기를 선택, 2.5 에어리 단위 (즉, 넓은 광학 절편)에 검출기 핀홀을 열고, 20 배 높은 개구 침지 목표를 사용 ~ 750 나노 미터 픽셀 크기, 3 배의 프레임 평균과 excit405 nm의 레이저 다이오드의 10 % E. </li><li> 정확한 정량화는 동일한 값으로 두 채널의 검출기 이득 설정을 보장하고, 모든 픽셀의 포화를 방지하기 위해. 참고 : 여기에, 이익은 150 %로 설정했다. </li></ol></li><li> 1 mL의 시린지로, 예를 들어, 웰의 바닥에 침적 매개물을 확산하여 담궜을 보장하고, 기포의 포착을 방지. </li><li> 투과광을 활성화하고 모든 웰에보기의 대표 필드를 찾을 수 있습니다. 제대로 보정 자동 단계를 사용하여 소프트웨어의 위치를​​ 표시합니다. </li><li> 염색에 대한 판의 제거 후, ​​(4.3 절 참조) 판을 다시 삽입 초점 드리프트를 방지하기 위해 상단에 무게를 추가 할 수 있습니다. 레이저 스캐닝 모드와 저장 위치를​​ 검토하고 적절하게 초점과 수평 위치를 조정합니다. </li><li> 2 시간에 2 분에 시간을 시간 경과를 설정하고 획득을 시작합니다. </li></ol></li><li> 이미지 정량 (예를 들면 비트 평면 소프트웨어에 대해 설명한다) 같은 Imaris과 같습니다 <ol><li> 픽셀 매트릭스의 산술 계산을 수있는 소프트웨어로 데이터 세트를 가져옵니다. 드래그 기증자 및 소프트웨어 아이콘 수용체 채널 모두를 포함하는 소스 파일을 드롭하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 같은 오프셋을 사용하여 두 채널에서 배경을 뺍니다. 이렇게하려면 메뉴를 클릭 한 다음 이미지를 클릭&gt; 가공&gt; 기준 빼기. 각 채널을 선택하고 기본 값을 입력합니다. </li><li> 새로운 채널을 생성, 사전 결정된 보정 계수 F (1.1 참조) 셉터 채널 (CH2) 내로 도너 채널 (채널 1)의 블리드 - 스루를 정정 : 채널 2 &#39;= 채널 2 - 채널 1 * F 참고 : 기증자 채널에 수용체의 블리드를 통해 소음의 수준 이상 검출되지 않았습니다. <ol><li> 메뉴&gt; 영상 처리&gt; 채널를 arithmetics을 클릭하고 입력 복근 (CH2- (CH1 * 0.33)). 그 후 메뉴&gt; 편집&gt; 채널 삭제를 클릭하여 채널 2를 삭제합니다. 있는지 확인블리드를 통해 수정 수용체​​ 채널로 남아있는 새로운 채널 2. 선택 : 메뉴&gt; 편집&gt; 이미지 속성으로 이동하여 원래 색상에 회색의 채널 색상을 변경합니다. 채널 4&gt; 매핑 된 색상&gt; 기본 색상을 선택하고 녹색, 예를 들면로 변경. </li></ol></li><li> 상대 FRET 계수를 결정하기 위해 다음 조작으로 새 채널을 만듭니다 CH3 = 채널 2 &#39;/ (채널 1 + 채널 2&#39;) <ol><li> 메뉴&gt; 영상 처리&gt; 채널를 arithmetics로 이동 ./ (CH1 + CH2)을 CH2를 입력 </li></ol></li><li> 8 비트 이미지 FRET 채널의 적절한 시각화, 네 번째 채널을 생성 : 4 장 = 255 * CH3 <ol><li> 메뉴&gt; 영상 처리&gt; 채널를 arithmetics로 이동 255 *의 CH3를 입력합니다. 메뉴&gt; 편집&gt; 이미지 속성으로 이동하여 채널의 색상을 변경합니다. 채널 4&gt; 매핑 된 색상&gt; 색상 표 파일&gt; 제트을 선택합니다. </li></ol></li><li> 채널 CH3 및 메탄 그쪽에 3 × 3 중간 필터를 적용T는 이미지의 노이즈를 줄일 수 있습니다. 이렇게하려면 메뉴&gt; 이미지 처리&gt; 스무딩&gt; 중간 필터를 클릭합니다. 두 채널을 선택하고 필터 크기 &quot;3x3x1&quot;을 적용한다. </li><li> 세포 신호 정량, 제대로 오프셋 설정하여 4 장에서 세포를 감지하고 너무 작은 구조를 제외 크기 구조를 필터링 할 수 있습니다. <ol><li> 선택보기를 능가하고 아이콘 &quot;새로운 표면 추가&quot;를 클릭합니다. 표면 창 검출 알고리즘 파라미터를 정의한다. 빠른 처리를 들어, 두 개의 체크 박스 &quot;세그먼트 관심의 영역&quot;과 &quot;마지막으로 프로세스 전체 이미지&quot;를 활성화합니다. 그 치수를 편집하여 관심 영역을 정의합니다. </li><li> 소스 채널로 채널 4를 선택하고 임계 화&gt; 배경 빼기 (로컬 대비)에 의해 임계 값을 설정하고 10 μm의 직경을 설정합니다. 최대 intensi 수동으로 0으로 최소 강도 임계 값과 최대 임계 값을 설정타이. 면적으로 구조를 필터와 예를 들어, 187 μm²에 최소 값을 설정합니다. 표면 감지를 마칩니다. </li></ol></li><li> 기증자 형광 강도 (채널 1) 및 상대 FRET 계수 (CH3) 셀룰러 기업에서의 표준 편차에 대한 평균 값을 추출합니다. 이렇게하려면 표면 특성으로 이동합니다. 표면 스타일 / 품질&gt; 표면을 선택하여 구조의 모양을 변경합니다. 필터 탭을 클릭하여 모든 구조를 선택합니다. 선택&gt; 통일을 처리하기 위해 이동하여 검출 된 구조를 통일한다. 통계 탭을 클릭하여 MS Excel로 표면 통계를 내보내기&gt; 내보내기 모든 통계는 파일입니다. </li><li> 시간이 지남에 따라이 값을 플롯. 전좌 이펙터의 양을 나타내는 적절한 매개 변수로 각 조건에 대한 기증자 채널 형광 증가의 최대 기울기의 10 분의 간격을 확인합니다. M = Δ 기증자 형광 강도 / Δ 시간 (분)으로 기울기를 계산합니다. </li></ol></lI&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 여기에 성공적으로 Y로 이펙터 전위의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제 기자 기반 분석을 적용 enterocolitica. 이 민감한 특정하고 비교적 간단한 기술의 많은 다른 변형이 문헌에 기재되어있다. 본 연구에서는 레이저 주사 현미경은 형광 신호의 가장 민감하고 정확한 검출을 수행 하였다. 특히 도너와 억 셉터 염료 및 개별적 조절 검출 대역폭 사이의 크로스 토크에 대한 ?...

타입 III 분비 시스템은 직접 진핵 표적 세포 내로 세균 부호화 이펙터 단백질을 제공하는 그람 음성 박테리아에 의해 이용되는 다른 장군 특수한 단백질 수출 기계이다. 분비 기계 자체가 고도로 보존되는 동안 효과기 단백질의 특별한 세트는 셀룰러 신호 경로를 조작하고 특정 박테리아 병원성 1 전략을 용이하게하기 위해 다양한 세균 종에 진화 해왔다. 르시 니아 경우, 일곱 이펙터 단백질, 소위 Yops (르시 니아 외 단백질)까지, 숙주 세포 접촉에 전좌 및 즉 식세포 및 사이토 카인 생산과 같은 면역 세포 반응을 파괴하기 위해 함께 작동되어, 세균의 세포 생존을 허용 2-4. 전위의 프로세스 밀접 다른 단계 5에서 제어된다. 그것은 T3SS의 기본 활성화가 목표 CE에의 접촉에 의해 유발되는 것을 설립LL 6. 그러나,이 개시의 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지된다. 예 르시 니아에서 전위의 소위 미세 조정의 두 번째 수준은 상향 또는 하향 조절 세포의 Rho GTP 결합 단백질 RAC1 또는에서 RhoA의 활성을 얻을 수있다. invasin 또는 세포 독성 괴사 인자 Y (CNF-Y)에 의해 예를 들면 RAC1의 활성화는 차이가 전좌 YopE의 기능을 (는 GTPase 단백질을 활성화) 동안 RAC1 활동을 하향 조절하고 그에 따라 음의 피드백 유형에 따라 전위를 감소, 증가 전위 7-9 리드 기구 10, 11의. 유효하고 정확한 방법 르시 니아 전좌가 숙주 세포의 상호 작용 동안에 어떻게 조절되는지를 조사하기위한 전제 조건이다. 다양한 시스템들은 특정한 장점과 단점이 각각, 이러한 목적을 위해 사용되어왔다. 일부 방법은 웨스턴 블롯 분석 한 다음 다른 세제에 의해 감염된 세포의 용해가 아닌 박테리아에 의존하고있다. 목이러한 방법의 전자 일반적인 단점은 사소한하지만 피할 수없는 박테리아 용해 잠재적 박테리아 관련 이펙터 단백질과 세포 용 해물을 오염이다. 그러나, 세포 외 이펙터 단백질과 진핵 세포의 선택적 용해에 대한 디기 토닌의 후속 사용을 분해하는 단백질 분해 효소의 K와 세포의 치료는이 문제 (12)을 최소화하기 위해 제안되었다. 중요한 것은, 이러한 분석은 결정적으로 대부분 상업적으로 사용할 수없는 높은 품질의 안티 이펙터 항체에 따라 달라집니다. 시도 형광 단백질의 구형 차 구조 및 분비 13 전에 펼치는 분비 장치의 무능력으로 인해 아마 성공하지 않았다 전좌를 모니터링 GFP 같은 효과기 단백질의 번역 융합체 및 형광 단백질을 사용한다. (14) 또는 플래시 cyclolysin 보르 데 텔라 백일해 독소 그러나 CYA 등 여러 가지 리포터 태그 (칼 모듈 린 - 의존적 아데 닐 레이트 사이 클라) 도메인태그가 성공적으로 전좌를 분석하는데 사용 하였다. 플래시 태그, 매우 짧은 tetracysteine​​ (4Cys) 모티브 태그, 분비 과정을 방해하지 않고 biarsenical 염료 플래시와 라벨을 허용하면서 전 분석에서 CYA의 효소 활성은 세포 융합 단백질의 신호를 증폭하는 데 사용 15. 여기인가 접근하여 CHARPENTIER 외. 처음보고되었고 전좌 이펙터 TEM-1 베타 - 락타 마제 융합체 (16) (도 1a)에 의해 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 염료 CCF4의 세포 변환에 기초한다. CCF4 / AM는 쿠마린 유도체 (도너) 및 형광 부분 (수용체)은 세 팔로 스포린 코어에 의해 연결되는 셀 투과 화합물이다. 진핵 세포로의 수동 입력에 따라, CCF4 / AM 에스테르 화합물은 비 형광 형광 충 CCF4 셀룰러 에스 테라 제에 의해 처리함으로써 갇혀세포 내에서. 530 nm에서 녹색 형광 신호를 방출 형광 잔기에 FRET에서 405 nm의 결과에서 쿠마린 잔기의 여기. 베타 - 락타 마제에 의해 FRET 스포린 코어의 분열 후 중단되고, 쿠마린 잔기의 여진은 at460 nm의 청색 형광 방출에 이르게. 이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 상기 방법은 시험관 내에서 전위의 분석을 가능하게하고 또한 생체 예에서, 기술은 생체 내에서 17-19 전좌 대상 백혈구 집단을 식별하는 마우스 감염 모델을 사용 하였다. 신호의 판독은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 이용하여 수행 될 수있다. 참고로,이 방법은 또한 감염 프로세스 (20, 21) 중 살아있는 세포 현미경으로 실시간 전좌를 모니터링 할 수있는 가능성을 제공한다. 여기 레이저 스캐닝 형광 현미경 readou 도포 했더니형광 신호 t 그것은 높은 감도와 정확성을 제공하기 때문에. 특히, 성능은 고감도의 검출기와 함께 나노 미터 정밀도로 발광 창 형광 검출을 최적화 및 크로스 토크를 최소화하는 것을 용이를 조정한다. 또한이 현미경 설치 전좌 실시간으로 모니터링하도록 구성 될 수 있고, 잠재적으로 세포 수준에서 호스트 병원체 상호 작용의 동시 분석을 허용한다. (Y)의 연구 전위 요금에 enterocolitica 야생형 균주와 hypertranslocator 표현형을 나타내는 10,11 YopE 결실 변이체는 예시 적으로 분석 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

병원성 르시 니아 종을 포함한 많은 그람 음성균이. 진핵 표적 세포에 효과기 단백질을 이동시키다하기에게 유형 III 분비 시스템을 사용한다. 숙주 세포 내부에 효과기 단백질은 박테리아의 수혜 세포 기능을 조작. 더 나은 전위를 측정하는 숙주 세포의 상호 작용, 민감하고 정확한 분석하는 동안 유형 III 분비의 조절을 이해하기 위해 필요합니다. 우리는 여기 르시 니아 enterocolitica 효과기 단백질 단편의 융합에 기초한 어 세이 (예 르시 니아 외 단백질; YopE)의 응용 기술한다. 전좌의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제와이 분석은 세포의 분열에 의존 투과 FRET 염료 전좌 베타 - 락타 마제 융합에 의해 (CCF4 / AM). 형광이 중단 및 쿠마린 부분의 여기 파란색 형광 방출로 연결되어있는 베타 - 락타 마제에 의해 CCF4의 세 팔로 스포린 코어의 절단 후, 쿠마린에서 FRET.이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 방법은 마우스 모델에서 생체 외 분석을위한 전위도 생체 예에서 허용한다. 형광 신호의 검출은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 다른 예 르시 니아 돌연변이가 HeLa 세포에 이펙터 융합체의 생체 전위에서, 여기에 설명 된 설정에서 레이저 스캐닝 현미경에 의해 모니터링된다. 실시간으로 베타 - 락타 마제 이펙터 융합하여 FRET 기자의 세포 내 변환을 기록하는 강력한 정량적 인 결과를 제공합니다. 우리는 여기서 Y로 증가 전위를 보여주는 대표적인 데이터를 표시 야생형 균주에 비해 enterocolitica YopE 변이체.

정량적 표적 세포 내로 이펙터 전위를 분석 한 방법의 성능을 입증하기 위해, 서로 다른 전위 속도론 두 르시 니아 균주가 연구되었다 : Y. 및 그 유도체 WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 숨겨 WA-314) (독성 플라스미드 pYVO8 (22)을 품고 혈청군 O8) enterocolitica 야생형 균주 WA-314. 이전 연구는 것을 보여 주었다 (Y) 기능 YopE 전시에게 상당히 높은 YOP 전위 율 (10)이 ?...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K 조회수.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 증가를 동반 한 만성자가 면역 건식 ​​쥐 모델

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.