HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품에서 국립 연구소의 일반 의료 과학 R01 GM081686, R01 AR070245, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli와 Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구 (HAC에 교부 금에 의해 투자 되었다 로즈 언덕 및 Hal Gaba 상), 아와 HAC Jonsson 종합 암 센터에서 상을 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 백혈병 림프 종 사회 영향. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli & Edythe 넓은 센터의 재생 의학 및 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소, UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램의 회원입니다.

설명 하는 모든 실험 동물 관리 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 되었다.
1. 냉동된 마우스 스킨의 슬라이드 생성
<ol><li>기관 정책에 따라 마우스를 안락사 참고: 보호에 대 한 제도적 정책을 따릅니다. 동물 관련 된 모든 프로토콜 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다.</li>
	<li>동물 털 트리머 사용 마우스의 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 피부에 절 개를 확인 합니다. 집게를 사용 하 여 마우스에서 피부를 들어올립니다. 멀리 피부 섹션을 잘라가 위를 사용 하 여.</li>
	<li>cryomold 복합 시 약 동결을 채우십시오 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>바늘 코 집게를 사용 하 여 채워진된 cryomolds에 장소 피부 섹션입니다. 동양 피부 있도록 조직 조각 표 피에서 진 피, hypodermis와 근육 (그림 2)에 피부의 횡단면을 생성 합니다. 참고: 가능 하면 실험 탑재 하 고 동일한 슬라이드에 구분 하 고 함께 처리 수 있도록 동일한 cryomold에서 함께 마우스 제어. 거품을 만드는 것이 아니라는 것을 주의.</li>
	<li>드라이 아이스는 얼음 양동이에 블록의 평평한 표면에 cryomold를 배치 하 고 고정 하자. 스킨의 방향을 관찰을 계속 합니다. 필요한 경우 조정 합니다. 참고: 드라이 아이스를 처리할 때 극저온 장갑 착용.</li>
	<li>Cryomolds 스토리지-80 ° C 냉동 고로 전송 합니다. 샘플 효소 활동의 상당한 손실 없이 약 3 달 동안 냉장고에서 유지할 수 있습니다. 냉동된 섹션을을 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>-20 ° C, 7-10 µ m 두께 최고의 피부 형태학21에 대 한 섹션을 만들을 슬라이스 조직 한 cryostat 사용 하.</li>
</ol>2. 얼룩에 대 한 슬라이드 준비
<ol><li>시험 될 슬라이드 집합을 설정 합니다. 나드 보류 될 것입니다 어떤 컨트롤 슬라이드를 포함 하 고 다른 컨트롤에 슬라이드 기판, 젖이 나올, 보류 될 것 이다. 냉동된 조직 블록 이전 조사에서 긍정적인 제어 슬라이드를 포함 합니다.</li>
	<li>짧게 수정 피부 4% 포 르 말린 5 분에 대 한 섹션을 포함 하는 슬라이드 슬라이드, 또는 4% 포 르 말린의 pipetting 1 mL로 슬라이드 4% 포 르 말린을 포함 하는 컨테이너를 찍기 하 여 여러 슬라이드를 처리할 때. 참고: 고정 피부 않습니다 하지 껍질을 슬라이드에서 다음 절차와 보존 피부 형태학 동안 지킬 것 이다. 주의: 포 르 말린은 발암 물질과 유해; 장갑을 착용, 그것은 당신의 피부 및 화학 증기 두건에서이 단계를 수행 하지 마십시오.</li>
	<li>적어도 1 mL의 인산 염으로 세척 슬라이드 버퍼링 염 분, pH 7.4, 슬라이드 당 pipetting 또는 수영.</li>
</ol>3. 준비 솔루션 얼룩
<ol><li>젖 산 효소 활동 얼룩에 대 한 소용돌이 함께 시 약 (50 mM Tris pH 7.4, 750 µ M NADP, 80 µ M phenazine methosulfate (PMS), 600 µ M 블루 nitrotetrazolium 염화 물, 그리고 30mm 젖) 얼룩의 크기에 따라 적절 한 크기의 튜브에 필요한 솔루션입니다. 참고: 1 mL는 완전히 하나의 슬라이드를 커버 하기에 충분.</li>
	<li>있는 모든 시 약은 나드 제외 하 고 존재 하는 두 번째 솔루션을 준비 합니다. 모든 시 약은 젖 산을 제외 하 고 존재 하는 세 번째 솔루션을 준비 합니다.</li>
</ol>4. 슬라이드 솔루션 얼룩에 알을 품으십시오
<ol><li>부드럽게 피펫으로 얼룩 솔루션 또는 전체에서 섹션을 다루는 준비 슬라이드에 제어 솔루션 (1 mL입니다 한 슬라이드에 대 한 충분 한). 여러 슬라이드를 함께 처리 되는 경우 동시에 얼룩 솔루션으로 모든 슬라이드를 찍어 (컨테이너는 완전히 조직 단면도 커버에 충분 한 해결책 확인).</li>
	<li>어둠 속에서 37 ° C에서 습도 환경에서 슬라이드를 품 어. 슬라이드 위에 솔루션 얼룩 경우 증발을 방지 하기 위해 습도 환경에서 슬라이드를 놓습니다.</li>
</ol>5입니다. 모니터 슬라이드
<ol><li>모니터링 검사에 의해 파랑 클리어에서 얼룩 솔루션의 변환 합니다. 샘플 blueness의 원하는 수준에 도달, 얼룩 솔루션을 제거 하 여 반응을 중지 합니다. 참고: 피부를 위한 10 분은 충분 합니다. 에 오르간과 효소 활동에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>Pipetting으로 인산 염 버퍼 식 염 수와 슬라이드를 린스 (1 mL는 각 슬라이드에 대 한 충분 한) 또는 찍기. 참고: 서로 게 비교 될 것입니다 모든 샘플 유지 되어야 합니다 얼룩 솔루션에서 동일한 양의 시간에 대 한.</li>
</ol>6. counterstain 및 마운트
<ol><li>피펫으로 슬라이드 슬라이드 blueness의 적절 한 수준에 도달 하는 때에 counterstain. 참고: 빨간색 또는 녹색 핵을 설정 하는 Counterstains precipitant는 formazan에 의해 만들어진 블루와 좋은 대조를 제공 합니다.</li>
	<li>수성 또는 비-수성 매체22장착 탑재. 설치 매체의 1 ~ 3 방울 (40-50 µ L)은 커버 슬립의 크기에 따라 충분 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 슬라이드 및 계량
<ol><li>가벼운 현미경 슬라이드 이미지. 실험의 사진 및 제어 샘플 및 10 배, 20 X 40 X 확대에 부정적인 모든 컨트롤을 가져가 라.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어는 서로 다른 영역에서 푸른 얼룩의 강도 결정 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. 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A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

여기 설명 하는 방법은 젖 산 효소 또는 다른 세포 유형 조직 내에서 또는 시간이 지남에 따라 조직의 다른 부분에서에서 NADH 또는 NADPH를 생성 하는 다른 대사 효소의 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 젖 산 효소, 종양 줄기 세포의 생물학을 이해 하기 위한 중요 한 효소 이며 개별 셀에서 젖 산 효소 활동을 모니터 하는 능력이이 효소의 기능에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.
<...

있는 효소는 높은 또는 낮은 활동 조직 내의 위치를 이해 하는 것은 이해 개발 및 생리학에 대 한 필수적입니다. 사본 또는 단백질 레벨은 효소 활동에 대 한 대리 모 알선으로 자주 사용 된다. 이러한 연구는 유익 수 있습니다, 그들은 포스트 번역 상 수정, 단백질 복합물, 또는 효소의 subcellular 지 방화의 존재 하는 효소의 활동을 결정 하기 위한 중요 한 수 있는 정보를 제공 하지 않습니다. 효소 활동은 직접 측정 하는 경우 더 이상 높은 또는 낮은 활동은 조직 내에서 혼합물 또는 셀의 공간 분포 내에서 개별 셀에 대 한 정보를 포함 하는 무 균된 단백질 lysates에 자주 모니터링 합니다.
여기는 조직 샘플 내에서 효소 활동의 공간 배급을 매핑하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 방법론은 tetrazolium 염 dehydrogenases, reductases, 및 냉동된 조직1에서 oxidases의 활동을 지역화를 사용할 수 있습니다 설명 하는 이전 연구를 기반으로 합니다. 이러한 방법으로, 물 불용 성 formazan 형성 때 양성자 tetrazolium 소금2,3에 전송 됩니다. 포도 당-6-인산 효소는 NADPH와 양성자, 생성 하 고 tetrazolium 활동 감지 되었습니다. 포도 당-6-인산 효소는 유럽 넙치 hepatocytes4, 폐5 의 2 형 폐 포 세포와 신장5nephrons에서에서 모니터링 되었습니다. Tetrazolium 소금 또한 냉동된 조직6transketolase 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 비슷한 접근 방식은 최근 인접 한 슬라이드7에 동일한 조직에 여러 개의 dehydrogenases의 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었다.
여기 tetrazolium 염을 사용 하 여 (그림 1) 젖 산 효소 활동의 공간적 분포를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 젖 산 효소 분해 젖이 나올, 하 고 역 반응에 의해 생성 된 pyruvate를 변환할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 결과적으로 그것의 분 비로 젖이 나올 대 tricarboxylic 산 주기로 pyruvate의 입구를 결정 하는 중요 한 이다. 젖 산 수치 종종 다양 한 질병 이나 상해는 손상 된 세포와 효소가 릴리스 되었습니다 나타낼 수 있기 때문에 암8,,910를 포함 하 여 질병을 진단 하는 데 사용 됩니다.
4 젖 산 효소 유전자를 있다: LDHA, LDHB, LDHC, 및 LDHD11. LDHA와 LDHB는 초기 LDHA 유전자12의 중복에서 발현 생각 된다. LDH는 tetramer로 활성 이며 LDHA 및 LDHB homotetramers와 함께 heterotetramers를 형성할 수 있다. LDHA LDHB는 젖 산에 대 한 높은 선호도를 보고 pyruvate13우선적으로 젖 산을 변환 하는 동안 pyruvate에 대 한 높은 선호도가지고 보고 있다. LDHA 발기인 HIF1α, cMYC 및 FOXM1 녹음 방송 요인11에 대 한 바인딩 사이트를 포함 되어 있습니다. 또한, 같은 많은 다른 glycolytic 효소14,15, LDH 포스트 번역 상 수정에 의해 수정할 수 있습니다. 섬유 아 세포 성장 인자 수용 체 1 Y10 tetramer 형성을 촉진, 또는 NADH 기질 바인딩16촉진 Y83 LDHA phosphorylate 수 있습니다. LDHA acetylated17수도 있습니다. 이러한 이유로, LDH 활동의 완전 한 이해 LDH 단백질 수준, 하지만 효소의 활동 뿐만 아니라 모니터링 해야 합니다.
우리가 여기에 제시 하는 메서드와 다른 접근 젖 산 효소 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 무 균 단백질 lysate spectrophotometrically 젖 산 효소 활동을 모니터링할 수 있습니다. NADH 생성 젖 산 pyruvate 변환으로 측정 될 수 있다 340 흡 광도에 따라 nm, 동안 pyruvate는 젖 산18변환으로 NADH의 실종을 모니터링할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 또한 자기 공명 영상 (MRI)와 모니터링 되었습니다. 13 C-pyruvate를 관리할 수 있습니다 하 고 젖이 나올에 pyruvate의 변환의 비율으로 감시 될 수 있다 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate. 상승의 비율 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate 암 조직19에서 관찰 되었습니다. MRI-기반 접근 정상에 젖 산 효소 활동과 질병 조직에 정보를 제공할 수 있습니다, 하는 동안 방법론 특정 셀에 활동 수준을 결정 하는 데 필요한 해상도 있지 않습니다. 여기에 제공 된 방법론은 조직 영역에서 단일 셀에도 젖 산 효소 활동에 정보를 제공할 수 있습니다.
현장에서 활동 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 젖 산 효소의 활동은 마우스 피부20의 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 높은 발견. 우리 또한 사용 방법이 경작된 한 배아 줄기 세포에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 활동은 피더 계층 보다는 줄기 세포에서 발견. 마지막으로, 우리는 신선한 마우스 대동맥에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 부드러운 근육 세포에 얼룩이 관찰. 우리 여기 냉동된 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Surgical instruments</td><td></td><td></td><td>For collecting skin from euthanized mice</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>For freezing mouse skin</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>For mounting cryomolds</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polysine Adhesion Slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>Dilluted in water</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine methosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium blue chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Lithium L-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>37&amp;deg;C incubator (or tissue culture incubator)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braziliant! Counter stain</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Counter stain</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips for slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

공간과 시간에 효소 활동을 매핑 하는 것이 정상 조직과 질병에서 셀 동작의 분자 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다. 신진 대사 활동 분석 실험 현장에 는 조직 내에서 신진 대사 활동의 공간적 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기 조직 샘플에서 직접 효소 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젖 산 효소 포도 당 소비 호 기성 또는 혐 기성 해당 분해를 통해 에너지로 변환 하는 것입니다 여부의 중요 한 결정 이다. 젖 고 나드를 포함 하는 솔루션은 냉동된 조직 섹션에 제공 됩니다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) NADH를 검출 될 수 있다 양성자의 감소에 따라 제공 하는 동시에 변환 하는 동안 높은 젖 산 효소 활동에 포함 된 셀 pyruvate에 제공 된 젖 산을 변환 됩니다. nitrotetrazolium 블루 침전으로 시각화 formazan 블루. 우리는 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜을 적용, 우리는 젖 산 효소 활동은 높은 무부하 머리 여 포 줄기 세포는 피부 내에 발견. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 보다 배양된 미 발달 줄기 세포에서 높은 얼룩 공개 교양된 마우스 배아 줄기 세포를 적용 하는 프로토콜. 갓 절연된 마우스 대동맥의 분석 계시 수직 대동맥 평활 근 세포에 얼룩. 제공 하는 방법론 공간적으로 냉동 또는 신선한 조직에 양성자를 생성 하는 효소의 활동을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 이전 제자리에 활동 분석 실험 마우스 피부20에 대 한 결과 보고 있다. 그림 3에서 같이, 우리는 절차는 위에서 설명한 때 머리 여 포의 기지에서 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 젖 산 효소 활동의 높은 수준을 다음 관찰. 이러한 결과 형광 활성화 된 세포 피부의 머리 여 포 줄기 세포에 대 한 정렬 및 정렬된 셀에 활동 ?...

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

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JoVE Journal

Biochemistry

11.4K 조회수.  UCLA. 우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

비디오: Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

다중 Transdermal 전기 감지를위한 빈 Microneedle 기반 센서

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

연구

생체공학

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

생화학

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and progression. Complexity within the tumor microenvironment, including tumor secretome, low-grade inflammation, hypoxia, and redox imbalance, fosters heterotypic interaction and allows the transformation of inactive resident fibroblasts to become active CAFs. CAFs are metabolically distinguished from normal fibroblasts (NFs) as they are more glycolytically active, produce higher levels of reactive oxygen species (ROS), and overexpress lactate exporter MCT-4, leading to the opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP). Here a method has been described to analyze the mitochondrial health of activated CAFs isolated from the multicellular 3D tumor spheroids comprising of human lung adenocarcinoma cells (A549), human monocytes (THP-1), and human lung fibroblast cells (MRC5). Tumor spheroids were disintegrated at different time intervals and through magnetic-activated cell sorting, CAFs were isolated. The mitochondrial membrane potential of CAFs was assessed using JC-1 dye, ROS production by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining, and enzyme activity in the isolated CAFs. Analyzing the mitochondrial health of isolated CAFs provides a better understanding of the reverse Warburg effect and can also be applied to study the consequences of CAF mitochondrial changes, such as metabolic fluxes and the corresponding regulatory mechanisms on lung cancer heterogeneity. Thus, the present study advocates an understanding of tumor-stroma interactions on mitochondrial health. It would provide a platform to check mitochondrial-specific drug candidates for their efficacies against CAFs as potential therapeutics in the tumor microenvironment, thereby preventing CAF involvement in lung cancer progression.

Multicellular 3D tumor spheroids were prepared with lung adenocarcinoma cells, fibroblasts, and monocytes, followed by the isolation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) from these spheroids. Isolated CAFs were compared with normal fibroblasts to assess mitochondrial health by studying the mitochondrial transmembrane potential, reactive oxygen species, and enzymatic activities.

3D 다세포 폐 종양 스페로이드에서 분리된 암 관련 섬유아세포의 미토콘드리아 건강 평가

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

암 연구학

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

신진 대사 매핑: 양적 효소 Cytochemistry 및 Histochemistry Dehydrogenases 세포와 조직에서의 활동을 결정 하

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

면역학 및 감염병학

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

생물학

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay

Source: Neuhaus, V., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the lactate dehydrogenase, LDH assay to measure the cytotoxic effect of a test substance and its effect on the membrane integrity in human precision-cut lung slices. The assay provides a quantitative measure of cell death or damage in the sample.

Lactate Dehydrogenase Assay를 통한 폐 절편의 세포 독성 및 막 무결성 평가

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. General Preparation of Human PCLS ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Source: Luhr, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57971">The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성(Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells) 정량화

1. Cell Seeding and Treatment

	Culture adherent cells in 75 cm2&#160;tissue culture flasks in a humidified incubator with 5% CO2&#160;at 37 &#176;C, ...