이 방법은 미토콘드리아 건강, 에너지 효율 및 에너지 사용과 같은 에너지 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고립 된 미토콘드리아의 산소 소비가 직접 측정된다는 것입니다. 결과는 다른 세포 내 신진 대사 과정에 대해 수정 할 필요가 없습니다.
우리는 먼저 미토콘드리아 효율이 공급 효율성에 미치는 영향을 조사하고 싶었을 때 유제품 가축에서이 방법을 추구하기로 결정했습니다. 이 방법의 비디오 데모는 미토콘드리아 격리의 단계가 일관되고 정확해야 하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 간 샘플을 제거한 후 가능한 한 빨리 소에서 제거된 후 미토콘드리아 격리 매체에서 샘플을 세척하여 적혈구를 제거한다.
가위를 사용하여 조직을 미세하게 진정된 비커로 다진데, 이 비커에는 조직을 촉촉하게 유지하기에 충분한 격리 매체가 들어 있습니다. 미토콘드리아 격리 매체를 함유한 30밀리리터 유리 바이알로 다진 간을 옮기다. 0.16 밀리미터의 클리어런스를 가지고 있으며 얼음에서 배양된 테플론 유봉을 넣고 500 RPM에서 분당 4스트로크로 1분 동안 간 샘플을 균질화합니다.
그 후, 균주를 미토콘드리아 격리 매체가 들어있는 튜브로 옮기고 얼음으로 가득찬 비커에 넣습니다. 원심분리기는 G 500회, 섭씨 4도에서 10분간 동종합니다. 펠릿을 버리고 상체를 차가운 원심분리기 튜브로 옮춥니다.
미토콘드리아 펠릿을 얻기 위해 10, 000배, 섭씨 4도에서 10분간 생성된 상체원분리. 지방산이 없는 BSA를 사용하여 미토콘드리아 격리 매체의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세척하십시오. 그런 다음 원심 분리기는 8, 100 배 G, 섭씨 4도에서 10 분 동안.
상체를 버리고 격리 매체의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 산소 소비와 양성자 누출 운동 분석에 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 이것을 놓습니다. BSA를 사용하여 제조업체의 지침당 bicinchoninicacid 산 키트를 사용하여 펠릿 현탁액의 단백질 농도를 결정합니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 산소 소비 미디어를 만듭니다. 산소 소비 매체를 섭씨 30도에서 배양합니다. 다음으로, 제조업체의 지시에 따라 옥시그래프 시스템에 대한 호흡챔버, 펌프 및 산소 전극을 설정한다.
그런 다음 산소 소비 매체 의 1 밀리리터를 호흡 실에 놓습니다. 그런 다음 챔버에 미토콘드리아 단백질0.35 밀리그램을 추가합니다. 용액이 공기로 포화되고 섭씨 30도의 온도를 유지하기 위해 적극적으로 저어줍니다.
약 5분 동안 산소 소비를 기록합니다. 산소 소비가 감소하는 직선으로 일정하게 표시되면 이를 기준산소 소비로 기록하십시오. 복잡한 용액을 억제하기 위해 4 밀리 마일러 로테네 용액의 1.25 마이크로 리터를 추가 한 다음 1 개의 어금니 간편 한 용액의 5 마이크로 리터를 추가하여 호흡실에서 간결한 5 밀리머의 최종 농도에 도달하십시오.
이것은 상태 IV 산소 소비. 그 후, 100밀리머 ADP 용액의 마이크로리터 1개를 추가하여 호흡실에서 100마이크로몰러의 최종 농도에 도달한다. 산소 소비는 약 5 분 동안 감소하고 직선이 될 것입니다.
상태 III 호흡으로이 산소 소비를 기록합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 호흡 제어 비율을 계산합니다. 그런 다음 호흡 실에서 모든 솔루션을 흡인합니다.
이중 탈이온된 물로 챔버를 여러 번 헹구는 다. 먼저, 에탄올에서 나이지리아의 밀리리터당 80나노그램의 용액을 준비하여 1편 미만의 마이크로리터에 첨가된 에탄올의 양을 제한한다. 또한, 에탄올에서 밀리리터 올리고마이신 당 8 마이크로그램의 용액을 준비한다.
이중 산화물로 챔버를 철저히 헹구고 산소 소비 매체 1밀리리터를 호흡실에 넣고 자기 교반 바에 힘차게 저어줍니다. 호흡 챔버에 미토콘드리아 단백질0.35 밀리그램을 추가합니다. 메틸 트리페닐포스포늄에 민감한 전극을 챔버 셋업에 추가하여 다른 쪽 끝이 pH 미터에 제대로 연결되어 있는지 확인합니다.
복합 I.레코드 2 ~5 분 동안 호흡을 억제하기 위해 4 밀리 머 롤러 로테네 솔루션의 1.25 마이크로 리터를 추가합니다. 산소 소비 값을 일정하게 되면 기록합니다. 다음으로, ADP 활용도를 저해하기 위해 올리고마이신 용액의 0.56 마이크로리터를 추가합니다.
호흡을 약 2~5분 동안 기록합니다. 산소 소비 값을 일정하게 되면 기록합니다. 그런 다음 밀리리터 니제르리시틴 용액당 80 나노그램의 0.112 마이크로리터를 추가하여 미토콘드리아 내막을 가로지르는 pH 그라데이션을 폐지한다.
2~5분 동안 호흡을 기록하고 일정해질 때 산소 소비 값을 기록합니다. 표준 곡선을 준비하기 시작하기 위해 미토콘드리아 인큐베이션에 10 밀리머메틸 메틸 트리헤닐 포스포늄 용액 5개소소기를 첨가한다. 총 농도가 2.5일 때까지 이 추가를 4회 더 반복합니다.
마이크로몰러가 추가되었습니다. 그 후, 호흡을 시작하기 위해 챔버에 하나의 어금니 간결한 용액의 5 개의 마이크로 리터를 추가합니다. 안정적인 추적이 이루어질 때까지 호흡을 기록합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시스템을 적티레이에 말로나테를 추가합니다. 이 연구에서 RCR 및 양성자 누출 운동학은 젖소가 28 일 동안 구리, 아연 및 망간의 다른 수준으로 공급 된 후 70 일 후에 홀스타인 낙농 소의 우유에서 측정됩니다. 상태 IV 호흡은 망간의 낮은 수준을 주어진 소에서 가장 높은 것으로 볼 수 있습니다, 아직 제어 소에서 가장 낮은, 망간 양성자 누출 의존 호흡을 최소화에 중요한 역할을 나타냅니다.
간 간 누출 의존호흡의 분석은 이 호흡이 낮은 망간으로 취급된 소에서 가장 크고, 통제소에서 가장 낮다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 낮은 망간 그룹이 가장 큰 상태 IV 호흡을 가지고 있음을 확인하며 대조군은 가장 낮다. 높은 RFI 황소보다 낮은 RFI 황소에서 태어난 앵거스 조인에서 사료 효율이 높지만, 이것은 미토콘드리아 RCR 또는 양성자 누출 운동학에 반영되지 않았습니다.
이 절차를 수행하는 동안 미토콘드리아를 처리하는 동안 얼음에 모든 바이알과 비커를 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후이 기술은 간에서 공급 효율과 미토콘드리아 기능에 미토콘드리아 효율의 역할을 탐구하는 유제품 영양 분야의 연구자들을위한 길을 열었습니다. 로테네톤으로 일하는 것은 위험할 수 있으며, 장갑, 눈 보호 및 적절한 PPE 착용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.
