이 프로토콜은 암 관련 섬유아세포 또는 CAF를 활성화시키는 종양 미세환경의 중요성을 강조합니다. 표현형 특성을 연구하는 것은 시험관 내 모델이 우수 할 수 있습니다. CAF 생물학의 주요 제약은 원발성 종양 생검 샘플에서 CAF의 제한된 가용성에 있습니다.
따라서이 기술은 CAF 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 연구는 불량한 종양 예후를 초래하는 CAF 활성화와 관련된 비정상적인 교차 생산 및 미토콘드리아 기능 장애를 보여줍니다. 이 방법의 적용은 종양의 외상 상호 작용, 특히 CAF 활성화 및 미토콘드리아 건강을 평가하는 데 유용합니다.
새로운 약물 표적을 탐색하기 위해. 개인은 이 기술을 수행하기 전에 세포 절차에 대한 경험이 있어야 합니다. 이 기술의 시각적 시연을 통해 CAF 생물학을 연구하기 위해 종양 스페로이드 및 다운스트림 응용 분야에서 CAF 집단을 분리하는 중요한 단계를 이해할 수 있습니다.
리나 아로라 양, 모이나 칼리아 양, 수먀짓 로이 부인, 내 연구실의 조수가 실험을 수행합니다. 인간 폐 선암 A549 및 인간 폐 섬유아세포 MRC-5 부착 세포를 DMEM 및 인간 단핵구 THP-1 세포를 RPMI에서 성장시키기 위해 5%이산화탄소가 있는 가습 챔버에서 섭씨 37도의 T25 플라스크에서 완전한 성장 배지를 시작합니다.
3일 후, 80 내지 85%의 세포 컨플루언시에서, A549 및 MRC-5 세포를 1 밀리리터의 PBS로 1분 동안 세척한다. 다음으로, 섭씨 37도에서 5 분 동안 500 마이크로 리터의 0.25 % 트립신 EDTA 용액과 함께 배양하여 세포를 수확합니다. 그런 다음 즉시 4 밀리리터의 완전 성장 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하십시오.
세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브에 모으고 125 x g에서 5 분 동안 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 제거하고 세포를 5밀리리터의 완전 성장 배지에 재현탁시킨다. 다세포 종양 스페로이드를 확립하려면 1밀리리터 부피의 세포 카운터를 사용하여 A549, MRC-5 및 THP-1 세포 수를 계산합니다.
계수 후 세포 현탁액을 5:4:1의 비율로 준비하고 완전한 DMEM으로 부피를 1밀리리터로 구성합니다. 다음으로, 25 마이크로리터의 세포 현탁액 혼합물을 90 밀리미터 배양 접시의 덮개 위에 떨어뜨린다. 접시의 바닥을 10 밀리리터의 멸균 수로 채 웁니다.
물이 채워진 수화 챔버 위로 뚜껑을 조심스럽게 뒤집고 접시를 세포 배양 인큐베이터에 3 일 동안 두십시오. 넷째 날에는 현미경으로 스페로이드를 모니터링합니다. 이미지를 획득하려면 전원 스위치를 켜십시오.
90mm 배양 접시를 무대에 놓고 10 x 배율을 선택합니다. 렌즈를 조정하고 세포를 검사하여 세포 응집 및 증식을 분석합니다. 이미지를 캡처하기 위해 제공된 고정 및 저장 버튼을 누릅니다.
이미징 후 각 액적에서 20 마이크로 리터의 배지를 새 배지로 조심스럽게 흡인하여 성장 배지를 교체하십시오. 라이브 데드 이미징의 경우 스위치 1인 Ctr advanced를 켠 다음 CPU를 켜고 소프트웨어 시스템이 부팅될 때까지 기다립니다. 부팅되면 스페로이드가 들어 있는 90mm 접시를 도립 형광 현미경의 스테이지에 놓습니다.
그런 다음 소프트웨어에서 형광 옵션을 선택하고 칼세인 및 텍사스 레드 채널에 대해 FITC를 선택하여 10배 배율로 이미지를 관찰하고 캡처합니다. 그런 다음 옵션을 선택하고 이미지를 라이브로 봅니다. 적절한 최적화를 위해 형광 강도를 조정하고 안전 버튼을 클릭합니다.
1 밀리리터 피펫과 15 밀리리터 튜브를 사용하여 7 일과 10 일에 각각 200 개의 종양, 스페로이드를 수집합니다. 그런 다음 125 x g에서 5분 동안 원심분리하여 스페로이드를 펠릿화하고 상청액을 조심스럽게 흡인합니다. 스페로이드를 200 마이크로리터의 PBS로 세척하고, 다시 원심분리하고, 상층액을 버린다.
스페로이드 붕해를 위해 400마이크로리터의 0.25% 트립신 EDTA 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 스페로이드의 완전한 분해를 위해 격렬한 피펫팅을 수행합니다. 완전한 DMEM 성장 배지 1 밀리리터를 추가하여 트립신을 중화시킵니다.
그런 다음 스페로이드 현탁액을 원심분리하고 상청액을 버리고 펠릿을 완전한 DMEM 배지 1밀리리터에 재현탁합니다. 입증 된대로 총 셀 수를 계산합니다. 종양 스페로이드에서 암 관련 섬유아세포 또는 CAF를 분리하려면 80마이크로리터의 냉자기 활성화 세포 분류 또는 MACS 완충액에 1 x 10을 일곱 번째 세포에 재현탁합니다.
20 마이크로 리터의 항 섬유 아세포 마이크로 비드를 세포 현탁액에 넣고 튜브를 부드럽게 두드리고 실온에서 30 분 동안 배양하여 잘 혼합합니다. 배양 후, 1 밀리리터의 차가운 MACS 완충액으로 세포를 세척한다. 그런 다음 펠릿을 500 마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁시키기 전에 상청액을 원심분리하고 흡인합니다.
마그네틱 비드 기반 세포 분리의 경우 3밀리리터의 MACS 완충액으로 헹구어 MACS 컬럼을 준비합니다. 세포 현탁액을 컬럼 내로 놓고, 표지되지 않은 세포 집단을 함유하는 관통 유동을 수집한다. 다음으로, 분리기에서 제거하기 전에 3 밀리리터의 MACS 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하십시오.
그런 다음 컬럼을 수집 튜브에 놓습니다. 5밀리리터의 MACS 완충액을 추가하고 플런저를 컬럼 내로 단단히 밀어 넣어 항섬유아세포 마이크로비드 표지된 세포를 수집합니다. 다운스트림 적용을 진행하기 전에 표지된 세포를 원심분리합니다.
분리된 CAF의 수를 계수하고 유동 세포분석 분석을 위해 네 번째 세포에 대략 6 x 10을 사용합니다. PBS로 세포를 한 번 씻은 다음 원심 분리하고 상청액을 흡인하십시오. 다음으로, 100 마이크로리터의 세포 투과화 완충액을 첨가하고, 세포를 섭씨 4도에서 간헐적 와류와 함께 30분 동안 배양하여 단일 세포 현탁액을 유지한다.
다시, 세포를 투과화 완충액에 원심분리 및 재현탁시킨 후, 2 마이크로리터의 APC 접합된 항-인간 알파 SMA 항체를 첨가하고, 섭씨 4도에서 45분 동안 인큐베이션한다. 배양 후 1 밀리리터의 투과화 완충액과 원심 분리기를 추가하여 과도한 항체를 제거합니다. 유세포분석을 위해 펠릿을 400마이크로리터의 투과화 완충액에 재현탁시킨다.
전방 및 측면 산란을 기반으로 세포 집단을 구별한 후 ACTA2 양성 세포를 선택합니다. 일중항 모집단을 선택한 다음 단일 매개변수 히스토그램에서 단일 피크로 나타나는 ACTA2 양성 세포를 선택합니다. 다세포 종양 스페로이드의 발달과 살아있는 죽은 분석이 여기에 나와 있습니다.
7일째에 스페로이드는 직경이 약 260미크론인 작고 단단했습니다. 10일째에 스페로이드의 직경은 480미크론이었습니다. 세포 생존율 분석에서, 프로피듐 요오드화물 형광의 감소 및 7일째부터 10일째까지의 칼세인-AM 형광의 증가가 관찰되었다.
저산소 염색은 10일차 스페로이드의 중심에 저산소 코어를 드러냈다. 또한, 종양 스페로이드 형성 일수의 증가에 따른 E-cadherin 및 Mki-67 유전자 발현의 상향조절이 관찰되었다. 10일째 종양 스페로이드로부터 분리된 CAF는 대략 69%ACTA2 양성이었다.
CAF는 MRC-5 섬유아세포에 비해 ACTA2에서 3배 상향조절, 콜라겐 1형 알파2 사슬에서 10배 상향조절을 보였다. 10일째 종양 스페로이드에서 ROS 수준의 유의한 증가가 7일째에 비해 관찰되었으며, 이는 CAF 활성화에 대한 ROS 생성의 가능한 관여를 시사합니다. 7일째 및 10일째 종양 스페로이드에서 분리된 CAF의 세포 ROS 수준에서 상당한 증가가 관찰되었습니다.
또한, 미토콘드리아 막 전위의 변화는 JC-1 염색에 의해 관찰되었다. GLUT1 및 MCT4 유전자 발현의 유도가 정상 섬유아세포와 비교하여 CAF에서 관찰되었다. 젖산 탈수소 효소, 시토크롬 C 산화 효소 및 숙시 네이트 탈수소 효소 활성의 현저한 유도가 정상 섬유 아세포와 비교하여 CAF에서 관찰되었다.
3D 다세포 종양 스페로이드의 성공적인 개발을 위해서는 A549, MRC-5 및 THP-1 세포의 5:4:1 비율을 사용해야 합니다. 섬유아세포 집단은 종양 스페로이드의 강성에 매우 중요합니다. 양이온 용액 및 특성화와 유사하게, 이 종양 스페로이드를 사용하여 종양 진행의 공범자인 종양 관련 대식세포 세포 집단을 얻을 수도 있습니다.
이 스페로이드 분석은 섬유아세포를 교차한 암세포가 CAFs 활성화에 어떻게 관여하는지 이해하는 데 도움이 될 것이며, 또한 미토콘드리아 특이적 약물 후보를 확인하는 데 사용될 수 있습니다.
