이 작품은 건강 보조금 DK083327 및 DK093491의 국립 연구소 (SZH까지)에 의해 지원되었다.

1. 칼슘 이미징을위한 췌장 포상 세포를 준비 <ol><li> 20 MM의 HEPES 95 mM의 NaCl을 4.7 mM의 KCl을, 0.6 mM의 MgCl 2, 1.3 MM의 염화칼슘, 10 mM의 포도당, 2 MM의 글루타민, 1 × 최소 이글의 중간 비 필수 아미노산을 포함하는 HEPES 배양 버퍼를 준비합니다. NaOH를 pH를 7.4로 최종 솔루션을 조정합니다. </li><li> HEPES 배양 버퍼 (위에서 설명)의 25 ML에 BSA (1 % W / V 최종)를 추가하여 BSA 배양 버퍼를 준비합니다. </li><li> 1.1 MG / ML (/ 200 단위 ML) 타입 4 콜라게나 제 1 MG / ML 대두 트립신 억제제 6 BSA 배양 버퍼 (위에서 설명)의 ML을 추가하여 교원질 소화 버퍼를 준비합니다. </li><li> 두 부분 HNO 3과 2 시간 동안 한 부분 염산에 침지하여 산 세척 22x22 mm의 coverslips를. 그런 다음 70 % 에탄올에 DI 물과 저장소를 사용 가만히 따르다. </li><li> CO 2 질식하여 한 마우스를 안락사. 동양 앙와위에서 동물, 그리고 CLE으로 복부 표면을 준비70 % 에탄올로 aning. 복강을 노출하는 개복술을 수행합니다. 췌장을 해부하고 즉시 교원질 소화 버퍼 6 ML을 포함하는 작은 무게 보트 헹구십시오. </li><li> 지방이나 눈에 보이는 혈관의 큰 조각을 멀리 해부, 다음 콜라 소화 버퍼의 5 ML을 제거하고 15 ML 원뿔 관에 다시 추가합니다. </li><li> 미세 해부 가위를 사용하면 콜라게나 소화 버퍼 1 ML을 포함하는 작은 무게 보트 췌장을 말하다. 용액이 균일하게 분산 나타날 때까지 말하다. </li><li> 125 ML 삼각 플라스틱 플라스크에 다진 제품을 전송하고 컨테이너에 콜라 소화 버퍼의 나머지 5 ML을 추가합니다. 조직이 완전히 버퍼에 빠져들되어 있는지 확인합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 플라스크를 놓고 30 분 동안 90 rpm으로 흔들어. 다운 타임이 짧은 기간 동안, 칼슘 활성화 작용제 (예 : caerulein, carbachol)를 준비하고 22x22 mm 산 세척 커버를 씻어DI 물에 미끄러 져. 건조하고 실험실 필름으로 늘어선 평평한 표면 위에 놓습니다. </li><li> 30 분 다이제스트가 완료되면, 15 ML 원뿔 튜브로 현탁액을 전송하고 세포가 정착 할 수 있습니다. 조심스럽게 콜라게나 소화 버퍼를 피펫 BSA 부화 버퍼 6 ML로 교체합니다. 적극적으로 작은 클러스터로 세포를 분산하기 위해 10 초 동안 손으로 튜브를 흔들. 즉시 동요에, 불안 매체에서 어떤 큰 부동 파편을 제거합니다. </li><li> 나머지 세포가 정착하고 신선한 BSA의 배양 버퍼 미디어를 교환 할 수 있습니다. </li><li> 서스펜션은 육안으로 만 정교하게 볼 수 있습니다 만 작은 클러스터로 구성 될 때까지 두 번 1.11 단계를 반복합니다. 세포는 그림 1A (맨 윗줄)에 묘사 된 사람들과 비슷합니다. </li><li> BSA 배양 버퍼를 제거하고 HEPES 부화 버퍼로 교체합니다. </li><li> 10 % DMSO에 750 μM, 플루오 오전 4시의 100X 재고를 준비합니다. </li><li> 세포 현탁액과 BSA없는 HEPES 배양 버퍼를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 세포를로드합니다. 이 작업을 수행하려면 세포 현탁액의 주식 솔루션의 적절한 볼륨 (1:100 희석)를 추가합니다. 각 22x22 mm의 coverslip에 위에이 정지 다음 접시에 500 μL. </li><li> 상온에서 어둠 속에서 coverslips를 보관합니다. 첫 번째 칼슘 2 + 측정을 넣은 후 30 분 소요. 염료가 자동으로 염료로드 후 30 분 발생해야 관류를 시작할 때 중간에서 제거됩니다. </li></ol> 2. 췌장 포상 세포에서 칼슘을 측정 <ol><li> DI 워터와 각 관류 셋업을 씻어 버퍼 또는 작용제의 적절한 금액으로 채 웁니다. 적절한 흐름을 확실히하기 위하여 버퍼 또는 작용제와 주요 각 주사기. 링에 주사기를 고정하면 현미경 스테이지 위의 약 1 ~ 2 발을 서있다. </li><li> 조심스럽게 가장자리 한 coverslip을 포함하는 세포 현탁액에서 파악하는 미세 집게를 사용합니다. 덮개를 기울45 ° 슬립, 그리고 여분의 버퍼가 도망 할 수 있습니다. coverslip을 상단에 세포와 고무 개스킷의 상단에 커버 슬립을 배치하고 챔버 (그림 2A와 2B)를 조립합니다. </li><li> 단계로 재관류 챔버를 확보하고 챔버 (그림 2C)의 제 1 입구에 버퍼를 포함 튜브를 삽입합니다. 에 버퍼를 포함하는 주사기를 돌려 버퍼가 커버 슬립의 전체 표면을 통해 붓는다 할 수 있습니다. 버퍼 챔버의 반대편에 도달하면, 진공 흡입으로 진공 라인을 삽입합니다. 챔버에 따라 적절한 위치에 다른 튜브 (포함 작용제, 억제제 등)를 삽입합니다. </li><li> 488 nm의 (그림 1A, 아래)의 파장 플루오 오전 4시 염료를 자극하는 하나 200X 나 400X, 1.4 조리개 수치 목표와 아르곤 레이저를 이용하여 세포를 시각화. 레이저의 전원 설정을 조정해야하도록 광전 튜브 (PMT) 방출되는 빛에 의해 포화되어 있지 않습니다. 또한, PMT의 전압은 최대의 광 검출을 위해 최적화해야합니다. </li><li> &gt; 515 nm의 긴 패스 방출 신호는 2-5의 프레임 속도로 수집 된 초 빠른 글로벌 칼슘 파도 (그림 3, 4) 시각화를위한 느린 진동 패턴과 0.2 ~ 0.3 초 / 프레임을 시각화 / 프레임. </li><li> 영상이 완료된 후, 주사기를 닫고 모든 튜브를 제거합니다. 챔버 단계를 반복 2.2-2.4를 분해한다. </li><li> 이미지 J에 시간이 지남에 형광 강도의 수치 (건강의 국립 연구소에 의해 프리웨어로 제공하고에서 찾을 수있는 소프트웨어 패키지와 데이터 수집 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/를</a> ). </li><li> 실시간 세포 영상을 볼 수 있고 관심 영역 (ROI에, 즉 핵, 기저, 정점 등)를 식별 </li><li> 이러한 ROI를 및 R에 대한 형광 강도를 확보형광 강도 / 기준선 형광 강도 (즉, F/F0)로 epresent. </li><li> F / F 0 대를 플로팅하여 표목을 생성 시간입니다. 트레이싱에 더하여, 대표 이미지는 일반적으로 제공하고 사색을 사용하여 표시됩니다. </li></ol> 3. 세포 상해 분석 실험을위한 췌장 포상 세포의 준비 <ol><li> 따뜻한 DMEM F-12 미디어 (페놀 레드없이) 37 ° C. </li><li> DMEM F-12 미디어 BSA (0.1 % W / V 최종) 및 염산 (50 μM 최종)를 추가합니다. </li><li> 원뿔 튜브로 나누어지는 DMEM 50 ML을. </li><li> 보충 DMEM F-12 매체 10 ML에 콜라게나 유형 IV의 0.5 MG / ML (12 U / ㎖)을 첨가하여 콜라 버퍼를 준비합니다. </li><li> CO 2 질식하여 한 마우스를 안락사. 동양 앙와위에서 동물, 70 % 에탄올로 세척하여 복부 표면을 준비합니다. 복강을 노출하는 개복술을 수행합니다. 췌장을 해부하고 즉시 작은 무게 보트 C로 씻어콜라게나 버퍼의 6 mL를 ontaining. </li><li> 3-5 분 동안이나 용액이 균일하게 분산 나타날 때까지 미세 해부 가위를 사용하여 조직을 말하다. </li><li> 5 분 동안 90 rpm으로 흔들어 37 ° C의 물을 욕조에 추가 콜라 버퍼, 그 장소 5 ㎖와 125 ML 삼각 플라스크에 다진 조직을 전송합니다. </li><li> 뿌리에서 제거, 세포가 간단히 해결 할 수 있도록하고, 신선한 콜라 버퍼의 5 ML과의 교류. 다음 90 rpm으로 흔들어 37 ° C의 물을 욕조에 추가 35 분 동안 품어. </li><li> 서스펜션은 명백한 세포 대단히 짧은 시간에 균일 나타날 때까지 적극적으로 전송 피펫을 사용하여 다이제스트를 resuspend을. 그런 다음 부드럽게 삼각 플라스크에 사전에 젖은 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 피펫. </li><li> 적극적으로 남아있는 세포를 강제하기 위해 메쉬를 통해 신선한 DMEM F-12 미디어 (콜라 포함)의 추가 3 mL를 피펫. </li><li> 또 다른 6-10 DMEM F-12 미디어 mL를 추가2 ~ 3 분 동안 정착 세포를 노래 졌을. 두 번이 단계를 반복하여 최종 세척 후 상층 액을 제거하십시오. </li><li> 48 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물에 신선한 DMEM F-12 미디어 세포를 resuspend을하고, 세포 현탁액의 플레이트 500 μl를 추가합니다. 세포는 그림 1B에 묘사 된 사람들과 비슷합니다. </li><li> 플레이트 작용제를 추가하기 전에 5 분 동안 90 rpm에서 37 ° C의 물을 욕조에 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 2-4 시간 동안 작용제의 변화와 세포를 자극한다. </li><li> 세포가 정착주의 깊게 미디어 나누어지는 (일반적으로 100 μL)와 액체 질소에 플래시 동결을 피펫 할 수 있도록 각도에서 접시를 기울이십시오. </li><li> 플래시가 남아있는 세포 현탁액을 동결. 플래시 동결 LDH 측정을 위해 필수적인 없습니다. 그들은 같은 날 assayed 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에 저장 될 경우 다른 샘플은 얼음에 보관하실 수 있습니다로. </li></ol> 4. 젖산 탈수소 효소의 누설을 측정 <ol><l난&gt; 측정 젖산 탈수소 효소 (LDH) 누설 주로 프로 메가 CytoTox 96 비 방사성 세포 독성 분석 키트 (특정 시약 및 재료의 표 참조)에 제공 시약 및 지침을 사용하여. </li><li> 재구성 LDH 기판 (키트에 제공되는) 분석 버퍼의 12 ML로 (또한 제공). </li><li> 상온에서 물을 욕조에서 냉동 세포 현탁액 및 미디어 샘플을 해동. </li><li> 96 - 웰 플레이트에 각 미디어 샘플의 접시에 50 μL. </li><li> 최종 농도가 1X되도록 세포 현탁액을, 10X 용해 버퍼의 필요한 볼륨을 추가합니다. 60 분 37 ° C에서 소용돌이 짧게 품어. </li><li> 펠렛 세포 파편 4 분 250 XG에 용해 샘플을 원심 분리기. </li><li> 세포 용 해물을 위해, 96 웰 플레이트에 1:10 희석 플레이트 50 μL. </li><li> 각각의 well에 재구성 기판의 50 μl를 추가하고, 30 분 동안 상온에서 어둠 속에서 접시를 품어. </li><li> 하여 반응을 정지각각의 well에 스톱 솔루션 (키트에 포함)의 50 μl를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 490 nm에서 흡광도를 측정한다. </li><li> % LDH 유출을 계산하려면 다음 공식을 사용합니다. 아래의 광학 밀도는 잘 만있는 PBS, 기판에서 빈 OD 읽기를 빼서 수정 및 솔루션을 중지 할 수 있습니다. </li></ol> 미디어 =있는 LDH (미디어 OD492) × (미디어 희석 계수) × (미디어 권)는 미디어 샘플을 희석하는 것이 필요하기 때문에 *, 희석 요인을 가장 자주 equal1. 총 LDH = ((해물 OD 490) × (lysate의 희석 계수) × (세포 현탁액의 권)) + ((미디어 OD 490) × (희석 계수) × (샘플링 분주 미디어 권)) <img alt="식 1" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1.jpg" /> 5. 아데노 바이러스로 췌장 포상 세포를 감염 <ol><li> 준비췌장 포상 세포는 3 장에서 설명했다. </li><li> 단계 3.12에 따라 세포 현탁액에 아데노 바이러스 10 7 전염성 단위 (IFUs) 추가 37 30 분 품어 ° C.를 </li><li> 6 - 잘 접시에 세포 현탁액의 균등 판 2 ㎖. </li><li> 대부분의 표현 구조의 경우, 세포가 적절하게 18 시간 내에 감염되어야하고, 단지 6 시간 내에 몇 루시퍼 구조를 위해. </li></ol>

<ol>
	<li>Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+agonist-evoked+cytoplasmic+Ca2++signals+in+exocrine+acinar+cells+analysed+by+digital+image+microscopy.">Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy.</a> Embo J. 11, 1623-1629 (1992).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolar+and+submicromolar+Ca2++spikes+regulating+distinct+cellular+functions+in+pancreatic+acinar+cells.">Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells.</a> Embo J. 16, 242-251 (1997).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor+mediates+early+zymogen+activation+in+pancreatitis.">The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).</li><li>Raraty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+enzyme+activation+and+vacuole+formation+in+the+apical+granular+region+of+pancreatic+acinar+cells.">Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+mitigates+caerulein-induced+pancreatitis+in+vivo+in+mice.">Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).</li><li>Shah, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+Activation+during+in+vivo+Pancreatitis+is+Dependent+upon+Calcineurin+Activation.">Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).</li><li>Muili, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+and+genetic+inhibition+of+calcineurin+protects+against+carbachol-induced+pathologic+zymogen+activation+and+acinar+cell+injury.">Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+carbachol-induced+protease+activation+and+accelerates+Ca2++waves+in+isolated+rat+pancreatic+acini.">Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini.</a> J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).</li><li>Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Ca2++wave+propagation+in+pancreatic+acinar+cells.">Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).</li><li>Reed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+extracellular+pH+induces+damage+in+the+pancreatic+acinar+cell+by+enhancing+calcium+signaling.">Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling.</a> J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Van Acker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+progression+locus-2+is+a+critical+regulator+of+pancreatic+and+lung+inflammation+during+acute+pancreatitis.">Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis.</a> J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+multiple+forms+of+Ca(2+)+spikes+by+inositol+trisphosphate+in+pancreatic+acinar+cells.">Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells.</a> J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).</li><li>Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+require+sequential+activation+of+inositol+trisphosphate+receptors+and+ryanodine+receptors+in+pancreatic+acini.">Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+calcium+entry+through+calcium+channels+in+olfactory+receptor+neurones+using+a+laser+scanning+microscope+and+the+calcium+indicator+dyes+Fluo-3+and+Fura-Red.">Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red.</a> Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).</li><li>Saluja, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretagogue-induced+digestive+enzyme+activation+and+cell+injury+in+rat+pancreatic+acini.">Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+contribute+to+bile+acid-induced+pathological+calcium+signaling+and+pancreatitis+in+mice.">Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+activates+pancreatic+calcineurin-NFAT+signaling+in+vitro+and+in+vivo.">Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포 분리 방법과 이후의 분석은 외분비 췌장의 생리적 및 병리 적 특징을 연구하는 강력한 도구를 나타냅니다 여기 아닙니다. 분산 췌장 포상 세포를 분리하는 방법은 1972 년 11 암스테르담 제이미 슨에 의해 설명되었다. 여기에 제시된 방법은 반 애커와 동료 (12)에 의해 설명 최근 분리 방법에서 적응되었다. 이러한 기술은 높은 재현성 쉽게 배울 수 있지만, 정확하게 수행해야합...

세포질 칼슘의 동적 변화는 생리적, 병리 모두 포상 세포 이벤트가 필요합니다. 칼슘이 발산 효과는 1 신호 칼슘의 독특한 공간과 시간적 패턴의 결과로 생각된다. 예를 들어, 포상 세포에서 효소 액의 분비는 분비 곳이 소요 혀끝 극의 제한된 지역에서 칼슘 스파이크로 연결됩니다. 대조적으로, 강한 비 진동 칼슘 신호에 의해 다음 글로벌 칼슘 파 급성 췌장염 3,4로 이어질 초기 병리학 적 사건과 연관됩니다. 이러한 내부 포상 단백 분해 효소 활성 감소, 효소 분비 및 포상 세포 손상이 (가) 있습니다. 우리 연구실은 생체 내 5-7 체외에서 두 질병으로 이어질 이러한 초기 병적 인 이벤트를 공부 고립 췌장암 acini를 사용합니다. 여기에 설명 된 방법은 CY 측정의 목적을 위해 기본 포상 세포의 분리 기술tosolic 칼슘 수준과 세포 손상. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mice</td>
 <td>NCI</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>AB00892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3624-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3040-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M-8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C79</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextrose</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>1916-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G-8540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11140-050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>EM</td>
 <td>SX0593</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T-9003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbon Dioxide</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td> 124-38-9 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>125 ml Erlenmeyer plastic flask</td>
 <td>Crystalgen </td>
 <td>26-0005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection kit</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14161-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td>LabChem</td>
 <td>LC222102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000, P100, P10 pipettes</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>FA10005P</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weighing boat</td>
 <td>Heathrow Scientific</td>
 <td>HS1420A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1020-2500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352095</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.65 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20170-293</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>22 x 22 mm glass coverslips</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>032811-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A483-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A142-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized water</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 x 18 mm coverslips</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>021510-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laboratory film</td>
 <td>Parafilm</td>
 <td>PM-996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luer lock</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>932777</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 ml syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>DG567805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 &frac34; gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>9328270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE50 tubing</td>
 <td>Clay Adam</td>
 <td>PE50-427411</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flat head screwdriver </td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM F-12, no Phenol Red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21041-025 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30.5 gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 CC syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>309603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml Erlenmeyer flask</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FB50025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh filter </td>
 <td>Nitex</td>
 <td>03-150/38</td>
 <td>150 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3548</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well tissue culture plate </td>
 <td>Costar</td>
 <td>3795</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td>7727-37-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytotoxicity assay kit</td>
 <td>Promega</td>
 <td>G1782</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adeno-GFP</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Gift from J. Williams</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring stand with clamps</td>
 <td>United Scientific</td>
 <td>SET462</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perifusion chamber</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum line</td>
 <td>Manostat</td>
 <td>72-100-000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water bath with shaker</td>
 <td>Precision Scientific</td>
 <td>51220076</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>LSM 710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BioTek Synergy H1 plate reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td>11-120-534</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>Nuaire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture Incubator</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>3110</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of pancreatic acinar cells for the purpose of calcium imaging, cell injury measurements, and adenoviral infection

췌장 포상 세포 외분비 췌장의 주요 실질 세포이며, 췌장 덕트로 췌장 효소의 분비에 주요 역할을한다. 또한 췌장염의 시작을위한 사이트입니다. 여기에서 우리는 전체 췌장 조직과 세포 내 칼슘 신호의 포상 세포가 고립되는 방법을 설명하는이 측정됩니다. 또한, 우리는 체외에서 포상 세포 손상을 유발 조건에서, 아데노 바이러스 구조와 이들 세포를 형질, 이후 젖산 탈수소 효소, 세포 손상의 마커의 누설을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 포상 세포 생리학 및 병리학의 특성을 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

생리적 자극에 응답 포상 세포의 칼슘 측정의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 포상 세포는 칼슘에 의해로드 된 염료 플루오 4 아세틸 콜린 아날로그 carbachol (CCH, 1 μM)로 관류) 8. 세포는 혀끝의 지역에서 시작하고 기저 영역 3,9에 전파 칼슘 파의 형태로 반응했다. 그림 3b에서와 같이 대표 표목은 일반적으로 1 μM의 carbachol 관찰 전형적인 피크 고원 패턴을 보?...

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Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

우리는 생리 학적 및 병리학 관련 자극에 포상 세포 칼슘 신호와 세포의 손상을 검사의 목적을 위해 마우스에서 마우스의 췌장 포상 세포를 제조하는 재생 방법을 설명합니다. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

preparation-pancreatic-acinar-cells-for-purpose-calcium-imaging-cell

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K 조회수.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. 우리는 생리 학적 및 병리학 관련 자극에 포상 세포 칼슘 신호와 세포의 손상을 검사의 목적을 위해 마우스에서 마우스의 췌장 포상 세포를 제조하는 재생 방법을 설명합니다. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.

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Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

연구

생물학

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

반복된 측정에 대 한 수 있도록 전극 이식된 카 테 터와 깨어 있는 쥐에 Cystometric 및 외부 요도 괄약근 측정

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...