이 방법은 살충제 발견 및 벡터 제어 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 모기 유충 이나 성인의 인구에 어떻게 독성은 공식화 되지 않은 화학? 화학은 애벌레 또는 성인으로 개발에 대 한 잠재력을 가지고 있습니까?
그리고 가장 효과적인 배송 경로는 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 미공식화 된 화학의 독성을 평가하는 데 사용할 수 있다는 것입니다 벡터 모기의 여러 종에 대한 화학의 독성, 그것은 높은 처리량 용량의 화합물의 수백을 evalute 최대 확장 할 수있다. 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 과학 기술자 인 Jasleen Kaur가 될 것입니다.
시작하려면 24웰 조직 배양 판의 우물에 라벨을 붙입니다. 분석 균형을 사용하여 테스트 화합물을 계량합니다. 이어서, 1.5mL 튜브에서 멸균 이중 증류수로 화합물을 해체하여 80mM 스톡 용액을 생성한다.
다음으로, 이중 증류수를 사용하여 재고 용액을 연속적으로 희석하여 원하는 농도의 작업 재고 솔루션을 준비합니다. 애벌레는 우물에 첨가해야 하며, 과도한 물을 제거하는 동안, 그리고 애벌레의 물리적 손상을 피하기 위해 시험 화학을 첨가해야 합니다. 상해는 사망률을 증가시킬 수 있고, 따라서 거짓 양성 결과를 생성하거나 분석결과를 무효화할 수 있습니다.
넓은 보어 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 5개의 세 번째 인스타 애벌레를 플레이트의 각 우물로 옮기습니다. 그런 다음 1mL 파이펫을 사용하여 물을 부드럽게 제거하고 원하는 양의 이중 증류수로 대체하십시오. 유충이 담정하지 않도록 신속하게 물 작업을 제거 할 때 애벌레를 만지지 않도록주의하고, 부드럽게 플라스틱의 반대편에 파이프를 하여 테스트 화학을 추가잘.
각 웰에 적절한 양의 테스트 솔루션을 추가하고 플레이트를 부드럽게 회전하여 균일한 혼합을 보장합니다. 12시간 광/암사이클을 섭씨 25도에서 75~85%의 상대 습도로 유지하여 성장챔버에 접시를 놓습니다. 애벌레의 움직임을 확인하려면 접시를 부드럽게 누릅니다.
움직임이 관찰되지 않으면 애벌레를 멸균 이쑤시개로 부드럽게 만지십시오. 응답이 발견되지 않으면 애벌레를 죽은 것으로 점수매기고 점수 시트를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 시점지점에서 각 우물의 죽은 유충 수를 기록합니다. 20 리터 플라스틱 케이지에서 3 ~ 5 일 된 성인 여성 모기를 문화.
테스트 화합물의 이름과 농도로 9 온스 종이 컵을 라벨. 다음으로, 20mL 유리 바이알에서 아세톤에서 테스트 화합물의 10mg/mL 스톡 용액을 준비한다. 그런 다음, 재고 용액을 연속적으로 희석하여 원하는 작업 농도를 얻습니다.
1mL 유리 주사기를 아세톤으로 청소합니다. 그런 다음 적절한 농도로 테스트 용액으로 채웁니다. 0.25uL의 부피를 제공하기 위해 조정된 마이크로 어플리케이터에서 주사기를 보호합니다.
다음으로, 흡인기를 사용하여 케이지에서 3일에서 5일 된 성인 암컷 모기 10마리를 제거합니다. 섭씨 4도에서 5분간 마취합니다. 그런 다음 모기를 페트리 접시로 옮습니다.
접시를 얼음 위에 10분간 놓습니다. 사망률에 기여할 수 있는 성인 모기를 손상시키지 않기 위해 냉장고에서 5분 이상 마취되지 않도록 하거나 10분 이상 얼음에 고정되어 모기의 처리를 최소화하십시오. 차가운 접시와 이동 가능한 단계가있는 미세 조작기에 액세스 할 수있는 경우 모기의 처리를 더욱 최소화 할 수 있습니다.
미세 한 핀셋을 사용하여 접시에서 각 모기를 제거하십시오. 주사기 마이크로 어플리케이터는 등쪽 흉부에 용액의 0.25uL을 적용하여 다음 해부 현미경으로 모기를 얼음에 표지된 종이 컵으로 옮습니다. 컵을 10 x 10cm 메쉬 사각형과 고무 밴드로 밀봉한 다음, 성장 챔버로 옮기고, 이전에 설명한 대로 죽은 모기의 수를 기록한다.
약 150 4~5일 된 성인 여성 모기를 흡인기로 수집하고 별도의 케이지로 옮기다. 수유 분석 전에 설탕의 근원을 1~ 24시간 제거하십시오. 수중에서 테스트 화합물의 80mM 스톡 솔루션을 준비합니다.
그런 다음, 직렬적으로 물로 희석하여 원하는 농도의 작업 재고 솔루션을 얻습니다. 원하는 시험 농도를 얻으려면 1.5mL 튜브에 제세증 토끼 혈액의 960uL에 각 희석40uL을 추가하고 파이펫팅하여 혼합합니다. 멤버 필터를 수유 장치에 놓고 고무 링으로 밀봉합니다.
다음으로, 파이펫을 사용하여 공급 장치의 뒷면에 위치한 전달 포트를 통해 테스트 용액으로 혈액 의 1mL을 전송합니다. 공급 장치를 가열 장치에 부착합니다. 그런 다음, 갓 준비 된 10 % 유산 용액으로 멤브레인 표면을 부드럽게 면봉하십시오.
수유 장치를 케이지에 놓습니다. 케이지를 어두운 천으로 덮고 모기가 1 시간 동안 먹일 수 있도록하십시오. 모기가 먹이를 주면 케이지를 섭씨 4도의 냉장고에 넣고 모기를 마취시키는 데 5분간 놓습니다.
그런 다음 케이지에 있는 총 모기 수를 계산하고 기록합니다. 복부를 검사하여, 완전히 부분적으로 공급 된 여성 모기의 총 수를 계산하고 기록합니다. 최소 50개의 혈액 공급 모기는 복용량 당 얻어야 합니다.
먹이지 않은 모기를 제거하십시오. 다음으로, 케이지를 성장 챔버로 옮기고 점수 시트를 사용하여 적절한 시점에서 죽은 모기의 수를 기록합니다. 세 번의 혈액 후 수유날에는 72시간 동안 새장에 달걀컵을 놓습니다.
해부 현미경을 사용하여 치료당 생산되는 계란의 총 수를 계산합니다. 애벌레 접촉 분석은 시간이 지남에 따라 애벌레 사망률에 아미 트립틸린, 도파민 수용체 길항제의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 데이터는 LC 50 값이 실험의 시간 과정 동안 감소한다는 것을 밝혔습니다.
성인 여성 모기의 사망률에 아미트립틸린의 효과는 비엔트린과 비교되었고, 두 가지 부정적인 대조군이었다. 아세톤 처리 및 치료되지 않은 네거티브 컨트롤에 비해, 아미트립틸린과 비펜트린 은 각 실험 시점에서 상당한 사망률을 유도. 정량적 수유 분석체는 성인 여성 모기의 fecundity 및 % 사망률에 아미트립틸린의 세 가지 다른 복용량의 효과를 평가하기 위해 수행되었다.
데이터는 혈액 을 공급하는 통제에 비해 가장 높은 복용량에 아미트립틸린 공급 모기의 fecundity에 통계적으로 유의한 차이를 공개하지 않았다. 일단 마스터되면, 우리가 여기에 설명 한 애술 중 하나가 제대로 수행되면 한 개인이 약 2 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 유기체를 부드럽게 처리하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 국소 응용 프로그램 중과 애벌레 또는 성인 분석서를 채점하는 동안 일관성이 있어야합니다.
이 절차에 따라, 흡수를 통해 독성을 평가하는 바이오 분석술, 모기 타르시, CDC 병 분석, WHO 튜브 분석 등의 다른 방법은 공식화되지 않은 화학의 효능, 또는 공식화 된 제품의 효능에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수있다, 또는 공식화 된 제품, 접촉 살충제 또는 공간 스프레이로 개발을위한 잠재력.
