이 방법은 신경 문장 세포의 기계적 신호 및 화학 신호와의 상호 작용에 대한 연구를 돕습니다. 그것은 또한 질병에 있는 신경 문장 발달의 분자 그리고 유전 기계장치에 원조할 수 있습니다. 유리 커버 전표를 옮기는 것이 가장 어렵기 때문에 깨지고 떨어뜨리는 것을 방지하기 위해 천천히 세심하게 옮기는 것이 가장 어렵습니다.
절차를 시연하는 것은 저와 제 실험실의 박사 후 연구원인 셰리 자오 박사가 될 것입니다. 먼저 원하는 수의 유리 커버 전표를 실험실 닦아 조각에 놓는 것으로 시작합니다. 그런 다음 각 커버 슬립을 알코올 버너의 불꽃을 앞뒤로 전달하여 소독합니다.
커버가 식으면 약 200 마이크로리터와 25mm 커버 슬립으로 12mm 커버 슬립을 덮고 800 마이크로리터의 수산화나트륨을 덮습니다. 5분 후, 수산화 나트륨을 흡인시키고 커버가 5분 동안 공기가 건조하여 균일한 필름을 형성하도록 합니다. 커버 슬립이 건조되면, 12mm 커버 슬립에 약 18 마이크로리터의 아미노프로필 트리톡시실란 또는 APTS를 추가하고 25mm 커버 슬립에 APTS 150 마이크로리터를 추가합니다.
잔류 APTS가 5분 동안 건조할 수 있도록 APTS에 액세스합니다. 나중에 커버를 세 번 헹구면 매번 5분 동안 멸균 된 탈온 물에 잠급됩니다. 씻은 커버 슬립을 신선한 페트리 요리로 옮기고 반응성이 있는 면을 향하게 합니다.
그리고 30 분 동안 충분한 0.5 %의 글루타랄데히드에 담그어 커버 슬립을 처리합니다. 글루타랄데히드를 한 번 헹구고, 3분 동안 산화된 물로 뚜껑을 헹구고, 공기가 반응성 쪽으로 덮개 미끄러짐을 건조시합니다. 실리콘 커버 슬립을 준비하려면, 파라 필름이 늘어선 페트리 접시에 아미노실란 코팅 커버 슬립과 동일한 수의 커버 슬립을 놓습니다.
그런 다음 12mm 커버 슬립에 40 마이크로리터와 25mm 커버 슬립을 디클로로메탄 실레인 또는 DCMS 150 마이크로리터로 5분간 처리합니다. 커버 슬립을 멸균 된 물로 1 분 동안 한 번 씻은 후 반응형 커버 슬립을 실험실 닦아에 향하게하십시오. 하이드로겔을 준비하기 위해, 파이펫은 말린 아미노실란 코팅 커버 슬립에 갓 준비된 아크릴아미드 젤 용액을 장착했습니다.
곡선 핀셋을 사용하여, 즉시 젤 용액위에 DCMS 처리 커버 슬립을 전달하여 젤 용액을 만지는 처리된 측으로 두 개의 커버 슬립 사이에 젤 용액을 변경합니다. 젤이 중합되면 DCMS 처리 커버 슬립을 곡선 핀셋으로 분리하여 아미노인 코팅 커버 슬립에 부착된 젤을 남깁니다. 다음으로, 소정의 4웰 또는 24웰 플레이트에 부착된 하이드로겔로 12mm 커버 슬립을 침수하여 멸균 PBS 또는 탈온화 된 물 500 마이크로 리터로 덮여 있으며 25 mm 커버 슬립은 멸균 PBS 또는 탈온 화 물 2 밀리리터로 덮인 6 웰 플레이트에 미끄러집니다.
과도한 아크릴아미드 용액을 제거한 후, 하이드로겔을 멸균 PBS 또는 탈온수에 30분 동안 보관하십시오. 나중에, 젤을 완전히 커버하기 위해 Sulfo-succinimydyl 또는 Sulfo-SUNPAH 용액을 추가하기 전에 우물 판에서 PBS 또는 탈이온된 물을 흡인한다. 그리고 15 와트, 365 나노 미터 자외선 아래 용액으로 젤을 10 분 동안 덮어 놓습니다.
플레이트를 기울여 용액당 가능한 한 많은 Sulfo-SANPAH를 수집합니다. 그리고 15 밀리몰러 HEPES로 젤을 2~ 3회 세척합니다. 밀리리터 콜라겐 1당 15밀리그램을 0.2%의 아세트산으로 희석하여 하이드로겔을 함유하고 있는 각 웰에 추가합니다.
그리고 밤새 젤을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 다음 날, 원고에 설명된 대로 세척을 수행한 후 PBS로 하이드로겔을 배양하기 전에 37°C와 이산화탄소 5%에 10%의 말 세럼과 5%의 FBS를 함유하고 있습니다. 2시간 동안 배양한 후, 멸균 걸러진 DMEM 500마이크로리터를 각각 10%의 FBS와 1%페니실린 연쇄상 구균에 넣고 젤을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에 보관합니다.
세포 배양이 준비되면, 바젤 배지에서 제곱된 제4 09-1 세포에 약 1.5배 10배. 핀셋을 사용하여 덮개 전표를 새 플레이트로 운반하여 플레이트에 직접 자라는 세포의 거짓 신호를 최소화합니다. 이어서, 실온에서 0.1%트리톤 X-100의 500 마이크로리터로 세포를 치료하기 전에 10분 동안 4%파라포름알데히드의 500마이크로리터를 사용하여 세포를 수정한다.
15 분 후, 10 %의 당나귀 세럼의 250 마이크로 리터와 세포를 걸어. 10%의 당나귀 세럼의 250 마이크로리터에서 1~400의 희석시, 10분 동안 DAPI를 사용하여 인큐베이션을 통해 F-actin세포를 염색합니다. PBS로 셀을 2분간 세척한 후 각 웰에 3~4방울의 장착 매체를 추가합니다.
형광 현미경에서, 개인 및 병합 채널을 생산하는 하이드로겔 샘플 당 적어도 세 개의 임의 프레임의 이미지를 캡처합니다. 원자력 현미경 또는 AFM을 통한 하이드로겔의 강성 평가에서, AFM 프로브에서 필요한 힘이 적기 때문에 힘 곡선의 경사가 부드러운 하이드로겔에 대해 순화했다. 그러나, 뻣뻣한 하이드로겔에, 생성 된 경사는 훨씬 가파른했다.
그런 다음 AFM 측정을 사용하여 킬로파스칼의 Young의 탄성 계측기에서 하이드로겔의 평균 강성을 계산했습니다. P19 및 09-1 세포의 성장 특성은 1킬로파스칼 및 40킬로파스칼 하이드로겔의 제어 및 변형된 젤 시스템에서 관찰되었다. 원래 젤 시스템에서 자란 09-1 세포는 죽은 세포의 높은 수를 초래했다.
대조적으로 변형된 겔 시스템에서 자란 09-1 세포는 최소한의 둥근 세포로 표시된 작은 세포 갑판을 가진 하이드로겔 기판에 건강한 세포 성장과 충분한 부착을 나타냈다. 두 하이드로겔 시스템에 도금된 P19 세포는 둥근 부동 셀의 과잉 및 세포 기판 부착물의 부족을 표시했다. 변형된 하이드로겔 시스템과 신경 문장 세포 또는 NcC의 호환성은 AP-2에 대한 면역 형광 염색에 의해 평가되었다.
수정된 하이드로겔 계열에 도금된 09-1 세포에서 AP-2 발현의 현저한 증가가 관찰되었다. 또한, 09-1 세포는 다양한 양의 응력 섬유를 통해 저강성 또는 높은 강성 하이드로겔에 기초하여 상이한 형태를 나타냈다. 40킬로파스칼 하이드로겔에서 자란 09-1 세포의 안티빈큘린 발현은 부드러운 기판에서 자란 세포가 뻣뻣한 기판보다 최소한의 초점 추가 복합체를 형성한다는 것을 반영하는 1킬로파스칼 하이드로겔에서 자란 세포보다 높았다.
아크릴아미드가 세포에 독성이기 때문에 하이드로겔의 중합화에 적합한 대기 시간이 매우 중요하다. 더 나은 결과를 보장하기 위해 PBS 또는 탈이온 된 물에 하이드로 겔을 30 분 이상 잠급하십시오.
