우리의 프로토콜은 콜라겐이 풍부한 부위와 간 섹션의 콜라겐 부족 부위를 구분합니다. 따라서 섬유 형성 과정을 더 자세히 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 편광 현미경을 사용하여 간 섹션에서 콜라겐이 풍부한 영역을 찾는 데 있습니다.
우리의 프로토콜은 간 섬유증의 발달에 대한 훌륭한 통찰력을 제공 할 수 있으며 특정 최적화 후 폐와 같은 다른 연조직에도 채택 될 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 영하 80도에서 얼어 붙은 간 부분을 제거하고 실온에서 2 분 동안 해동하십시오. PBS에서 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드로 절편을 섭씨 4도에서 10분 동안 고정한 후 PBS로 5회 세척합니다.
마지막 세척 후 조직을 사용하여 간 부분 주변의 과도한 PBS를 닦고 소수성 마커 펜으로 간 부분 주위에 약 2 x 4cm의 경계를 표시하십시오. 샘플을 PBS로 덮은 다음 샘플을 AFM 스테이지에 로드하고 AFM 헤드로 덮습니다. 원자력 현미경 또는 AFM 소프트웨어에서 설정 탭으로 이동하여 자동 저장에 체크 표시를 하여 모든 파일을 자동으로 저장합니다.
그런 다음 설정 탭으로 이동하여 설정 저장을 클릭하여 측정 파일을 저장할 파일 이름과 디렉토리를 지정합니다. 레이저를 켜고 접근 키를 클릭하여 AFM 캔틸레버로 조직 표면에 접근하십시오. 접근이 완료된 후, 후퇴 키를 한 번 클릭하여 캔틸레버 팁을 집어넣으면 캔틸레버가 피에조 범위의 상단 끝으로 후퇴됩니다.
필요한 경우 AFM 헤드의 손잡이를 사용하여 감지기를 다시 정렬합니다. 레이저를 끕니다. 이제 팁이 목표의 초점에 있습니다.
다음으로, 액세서리 탭을 클릭하고 직접 오버레이 광학 교정을 선택하여 현미경의 광학 필드를 AFM 측정 맵으로 오버레이합니다. 다음 창에서 다음을 클릭하여 특정 영역을 스캔하는 캔틸레버의 일련의 이미지를 촬영합니다. 다음을 다시 클릭하여 다음 창으로 이동합니다.
첫 번째 이미지에서 캔틸레버 끝의 중심을 수동으로 클릭하여 소프트웨어에서 팁 위치를 나타냅니다. 팁 위치를 나타내는 원은 정확도를 높이기 위해 반경을 표시하여 크기를 조작 할 수 있습니다. 보정을 클릭하면 모든 이미지에서 캔틸레버 팁 위치가 자동으로 감지됩니다.
이미지를 통해 팁 감지의 정확성을 확인하십시오. 다음을 클릭하고 마침을 클릭하여 광학 오버레이를 완료합니다. 그런 다음 스테이지를 이동하여 편광 이미지를 사용하여 데이터 뷰어 탭에 표시되는 녹색 상자 안에 콜라겐이 풍부한 영역을 배치합니다.
그리드 탭 아래에 영역을 정의하여 콜라겐이 풍부한 영역을 선택한 다음 지정된 녹색 상자 안의 마우스 왼쪽 단추를 길게 눌러 데이터 뷰어 탭에서 사각형을 만듭니다. 새 스캔 영역 확인을 클릭하여 선택한 영역을 측정 영역으로 설정합니다. 피드백 루프의 매개 변수를 설정합니다.
I 게인을 50헤르츠로 설정하고 P 게인을 0.001로 설정합니다. 그런 다음 설정점을 1나노 뉴턴으로 설정합니다. 연구 된 재료의 기계적 특성과 캔틸레버의 강성에 따라 상대 설정점 값을 선택하십시오.
힘 곡선을 적절하게 맞추기 위해 기준선을 지정합니다. 그런 다음 샘플의 표면 지형에 따라 Z 축에서 캔틸레버 이동 길이를 선택하십시오. Z 이동을 일정한 지속 시간으로 설정합니다.
연장 시간을 1초로 설정하고 확장 및 철회 지연을 0으로 설정합니다. 샘플 속도를 5, 000 헤르츠로 설정하십시오. Z 폐쇄 루프 앞에 체크 표시를 하여 측정 중에 샘플과 캔틸레버 팁 사이의 거리를 자동으로 조정합니다.
그런 다음 결합 버튼을 선택 해제하여 전동 스테이지 컨트롤을 해제합니다. 레이저를 켜고 캔틸레버로 샘플에 접근하십시오. 스캔 시작을 클릭하여 힘 거리 곡선을 수집합니다.
오픈 소스 소프트웨어 AtomicJ를 사용하여 수집된 데이터를 분석합니다. 힘 곡선을 프로그램에 로드하려면 프로세스 힘 곡선 및 맵 아이콘을 클릭합니다. 그런 다음 처리 도우미에서 추가 버튼을 클릭하여 분석할 맵을 추가합니다.
지도가로드 된 후 다음을 클릭하십시오. 다음 창에서 처리 설정을 지정합니다. 피팅 곡선 파라미터 세트를 사용하여 샘플과 캔틸레버 사이의 접촉점을 자동으로 추정하려면 접촉점의 자동 추정을 사용하십시오.
캔틸레버와 샘플 사이의 접촉점을 고전적인 초점 그리드 방법으로 결정하십시오. 추정 방법을 모델 독립적 방법으로 선택하여 데이터 분석 최적화 중에 경험적으로 결정해야 하는 측정된 힘 곡선의 품질을 기반으로 접촉점을 가장 잘 결정할 수 있습니다. 모델 피팅을 위해 클래식 모델을 클래식 L 2로 사용하여 힘 압입 곡선을 피팅합니다.
모델의 피팅을 인출 곡선에 설정합니다. 포아송 비율을 간과 같은 연조직에 권장되는 대로 0.45로 설정합니다. 기준선 차수 3과 접촉 차수 1을 사용하여 곡선의 피팅을 설정합니다.
모델에서 곡선의 편차 척도를 기반으로 다항식 피팅 정도를 변경합니다. 인출 곡선을 피팅하는 데 사용되는 모형을 Sneddon 모형으로 선택합니다. 구형 팁의 반경을 2.9 마이크로 미터로 채 웁니다.
읽기를 활성화하여 데이터 파일에서 스프링 상수와 invOLS를 로드한 다음 마침을 클릭합니다. 데이터 분석 후 힘 곡선을 통과합니다. 캔틸레버가 간 섹션의 표면에 잘못 접근 한 힘 곡선을 제외하십시오.
이 곡선은 노이즈가 높고 비정상적인 모양을 가지고 있습니다. 그런 다음 데이터를 복사하거나 내보낼 수 있습니다. 이 연구에서, 대조군 마우스와 사염화탄소 주입에 의해 유도 된 경증 및 진행성 섬유증을 가진 마우스로부터 얻은 경미하게 고정 된 간 절편을 AFM으로 조사했다.
사염화탄소 마우스의 콜라겐 섬유가 일반적으로 형성되는 영역에 해당하는 중앙 정맥에 가까운 영역을 대조군 간에서 분석했습니다. 영률의 분포는 대조군 간 및 단일 간 섹션 내의 콜라겐이 풍부한 영역의 여러 영역에서 재현 가능했습니다. 사염화탄소 처리된 마우스에서, 콜라겐 침착물의 중심 주변 영역에 해당하는 강성 맵은 대조군 마우스의 동등한 영역에 비해 영률의 유의하게 더 높은 값을 나타내었다.
또한, 더 긴 치료로 영률의 값이 크게 증가했다. 간 절편의 장기간 보관이 콜라겐 섬유의 기계적 특성에 미치는 영향도 평가되었습니다. AFM 측정은 2 주 이내에 얻은 것과 비교하여 3 개월 동안 보관 된 절편에 대한 콜라겐이 풍부한 영역에서 영률의 값이 유의하게 낮았다.
간 절편의 고정 시간은 간 절편의 기계적 특성을 크게 결정합니다. 프로토콜에 명시된 시간 간격을 엄격히 준수하는 것이 좋습니다. 프로토콜에서 특정 최적화 후, 주어진 방법은 편광 현미경으로 검출 할 수있는 상당한 콜라겐 침착을 나타내는 모든 연조직에 사용될 수 있습니다.
주어진 기술은 연구자에게 건강과 질병에 걸친 간 메커니즘을 연구하는 통일되고 편리한 프로토콜을 제공합니다.
