저자는 건강의 국가 학회는 지난 자금에 대 한 감사 위한 그리고 감사 마이클 R. 그린 oligonucleotides 합성.

참고: 그림 1 phosphorothioate mutagenesis에 대 한 개요를 제공 하 고 프로세스의 주요 단계를 요약.
1. 돌연변이 체의 도서관의 세대-야생 타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑
<ol><li>T7 뇌관 종합 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') 화학 합성 DNA 합성기에 의해.</li>
	<li>화학 합성 단백질 바인딩 사이트에 해당 하는 DNA 합성기에 의해도 핑된 oligonucleotide (보완 가닥) 음성 합성. 야생 타입 뉴클레오티드 (참조 대 한 자세한 내용은이 비율에 대표적인 결과)로 10 %T 90 %A 야생-타입 뉴클레오티드의 비율로 핑 X (아래)의 각 사이트에 대 한 화학 합성 하는 동안 phosphoramidites의 적절 한 혼합을 사용 합니다. 참고: 여기,도 핑된 oligonucleotide의 순서는 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTG참조CTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. 밑줄이 그어진된 순서는 SXL 단백질 바인딩 사이트, 플러스 로드 컨트롤 되 고 뿐만 아니라, RNA에 모든 변경 영향을 확인 하는 유용한 컨트롤을 제공 하는 바인딩 사이트 밖에 서 추가 뉴클레오티드의 역방향 보완 비교 그리고 뉴클레오티드 바인딩 사이트 내에서 정상화. SXL 바인딩 사이트 시퀀스에에서 존재 하는 변압기 중 mRNA14,15,,1617, UUUUUGUUGUUUUUUUU 제안 된 방법론을 고안 하 사용 되었다. 기울임꼴로 시퀀스 T7 뇌관 순서에 무료 이며 생체 외에서 전사의 T7 발기인.</li>
</ol>2입니다. RNA의 합성
<ol><li>
앞에서 설명한18으로 20 µ L 녹음 방송 반응에서 RNA를 음성 합성.
	<ol>
<li>믹스 T7 전사 버퍼와 1 µ M T7 oligonucleotide, 1 µ M 실수로 oligonucleotide, 10 m m dithiothreitol (DTT) 2mm GTP, 1 mM 각 ATP, CTP, UTP (guanosine, 아데노신, cytidine, 및 uridine 3 인산 염), 그리고 2 U / µ L T7 RNA 중 합 효소.</li>
		<li>추가, 두 개의 별도 microcentrifuge 튜브 0.167 m m α-thio ATP 또는 0.05 m m α-thio UTP RNAs에 phosphorothioates (회로도 그림2에서 참조)을 통합 하. 참고: 다른 프로토콜에 대 한도 핑된 oligonucleotide 뉴클레오티드 대체 남은 두 테스트를 포함 하는 적절 한 녹음 방송 반응에 0.2 m m α-thio CTP 또는 0.2 m m α-thio GTP를 추가 합니다.</li>
		<li>2 h 37 ° c.에 대 한 RNA 합성 반응 혼합물을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 샘플을 2.5 µ L 열 정한 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 2.5 µ L 10xphosphatase 버퍼를 추가 합니다. 5' 인산 염 제거를 37 ° C에서 10-30 분이 25 µ L 반응을 품 어.</li>
	<li>2-5 분 동안 80 ° C에 난방에 의해 알칼리 성 인산 가수분해 효소 효소 비활성화.</li>
	<li>Dephosphorylated RNA의 5' 끝 radiolabel (5 pmole) 1 µ L T4 polynucleotide 키 니 아 제 1 µ L γ-32P ATP 10 µ L 반응 볼륨에서을 사용 하 여. 37 ° c.에 30-60 분에 대 한 반응 혼합을 품 어</li>
	<li>20-30 분 동안 65 ° C에서 난방에 의해 T4 polynucleotide 키 니 아 제 효소 비활성화.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 polyacrylamide 젤을 변성 시키기 10%에 의해 RNA를 정화. Autoradiography 하 여 젤에 RNA를 찾습니다. 소비 세 포함 된 방사선된 RNA 젤 슬라이스, 피 펫 팁, 벽에 눌러 microcentrifuge 튜브에 크 러시와 가수분해 K (PK) 버퍼 (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 m m EDTA, 150 mM NaCl, 1% 나트륨 라우릴 황산 염)에 담근 다. 하룻밤에 2 h에서 실내 온도에 튜브를 회전 합니다.</li>
	<li>원심 젤 슬러리, 젤 삭제 및 버퍼 솔루션을 수집 합니다.</li>
	<li>페 놀-클로 프롬의 같은 볼륨으로 두 번 그리고 한 번 클로 프롬 솔루션을 추출 하 고 수성 단계를 수집 합니다.</li>
	<li>아세트산 나트륨, pH 5.2, 캐리어 3 M의 수성 단계 0.1 볼륨에 추가 tRNA 또는 glycogen, 그리고 에탄올의 2.5 볼륨. 1 h-80 ° C에서 샘플을 유지.</li>
	<li>16,873 x g에서 고속 microcentrifuge에서 5-10 분 샘플 원심 RNA 펠 렛을 방해 하지 않고 버퍼/에탄올 솔루션을 신중 하 게 제거 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 신중 하 게 2-5 분 제거 에탄올에 대 한 원심. 건조 한 공기에 있는 펠 릿.</li>
	<li>20-50 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 펠 릿 resuspend-물 처리. -20 ° C에서 사용까지 저장 합니다. 참고: 방사선된 RNA 방사능 으로부터 보호 하기 위해 적절 한 예방 조치 및 플 렉 시 유리 방패를 사용 하 여 모든 단계를 수행 합니다. 현재, 스핀 열 RNA의 젤 정화 대 안으로 비법 인된 방사능, 더 일반적으로 사용 되 고 더 편리 하 게 제거 하는.</li>
</ol>3. 단백질 바인딩 반응 및 바인딩된 RNA의 분리
<ol><li>에 있는 재조합 형 단백질을 표현 하 고 대장균에서 정화.</li>
	<li>분 광 광도 법에 의해 또는 알려진된 단백질 기준, 둔감 한 혈 청 알 부 민 (BSA) 옆 SDS polyacrylamide 젤에서 분리 하 여 재조합 단백질 농도 견적 한다. 얼룩이 Coomassie 화려한 블루 R-250와 젤 여 관심과 표준 BSA의 단백질을 시각화. 알려진된 양의 BSA 희석 동일한 젤에 비해 단백질 quantitate 참고: 저장에서-80 ° C까지 사용 하 고 20 m m 4-(2-Hydroxyethyl) 희석 piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES), pH 8.0, 1 m m dithiothreitol (DTT), 재조합 단백질 0.2 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 0.05 %NP-40, 20% 글리세롤. 사용 0.5-1.0 m m 프로 테아 제 억제 물 phenylmethane sulfonyl 불 (PMSF)는 선택 사항입니다.</li>
	<li>10 mM Tris HCl, pH 7.5에에서 RNA 바인딩 반응 (20-100 µ L) 수행, 0.09 µ g / µ L 소 혈 청 알 부 민, 1 mM EDTA, 0.15 µ g / µ L acetylated 1mm DTT, 50mm KCl, 0.5 단위 / µ L RNase 억제제, tRNA, 5'-끝 방사선 RNA, 그리고 적절 한 농도 (a의 6 µ L 농도는 RNA의 50%는 단백질을 바인딩합니다) 단백질의. 참고:이 바인딩 버퍼 3 RNA-바인딩 단백질에 대 한 작동 (SXL, U2AF65, 및 PTB), 그러나 관심사의 단백질에 대 한 표준화 해야 합니다. 약 50%를 얻을 하는 데 필요한 특정된 단백질 준비에 대 한 다양 한 희석을 사용 하 여 실험적으로, 단백질 농도 추정 RNA 바인딩. 이 조건 또는 Kd RNA 바인딩 곡선의 가장 민감한 부분을 나타냅니다.</li>
	<li>단백질 바인딩 반응 (또는 얼음) 25 ° C에서 20-30 분 동안 품 어.</li>
	<li>
두 가지 방법 중 하나를 사용 하 여 언바운드 분수에서 단백질 바인딩 RNA 분수를 구분:
	<ol>
<li>Nitrocellulose 필터 바인딩<ol>
<li>실 온에서 진공 매니폴드에 연결 nitrocellulose 필터에 바인딩 반응 (20-100 µ L)를 적용 합니다. 참고:만 RNA-단백질 복잡 한 필터에 유지 하 고 필터를 통해 RNA 흐름을 언바운드. 필터 바인딩 접근 바운드 RNA의 높은 복구 수 이며 빠르고 간단 하 게, 젤 기동성 교대 분석 실험에 비해. DEAE 막 nitrocellulose 필터 아래에 배치 하 여 언바운드 RNA 분수 수집 또는 바운드 분수와 함께 비교에 대 한 RNA를 무료 수 이기도 합니다.</li>
			<li>Nitrocellulose 필터를 포함 하는 유지의 부분 microcentrifuge 튜브에 맞게 더 작은 조각으로 방사성 RNA 필터 조각 몰입할 충분 한 PK 버퍼 (300-500 µ L 포함 10-20 µ g PK)에 담가 잘라내어 필터에서 RNA elute 2-3 h 또는 하룻밤.</li>
			<li>페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 추가 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조 하 고 resuspend DEPC 처리 한 물에 RNA. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>젤 기동성 교대<ol>
<li>준비 하 고 5% 기본 polyacrylamide 젤 유해 (후 60: 1 Acrylamide:bis-아크릴) 0.5에서 필터 바인딩 방법 하는 대신 바인딩 반응 시작 하기 전에 x TBE (표준 트리 스-Borate-EDTA 버퍼).</li>
			<li>미리 콜드 룸 (4 ° C)에서 250 V 15 분 젤을 실행 합니다.</li>
			<li>위의 사전 실행된 젤의 별도 우물으로 각 바인딩 반응 (위)를 로드 합니다. 참고: 단백질 저장 버퍼 샘플 로드 웰 스에 대 한 충분 한 글리세롤을 제공 한다.</li>
			<li>단백질 바인딩 RNA 젤 전기 이동 법 특정 단백질 및 RNA 크기에 따라 1 ~ 2 h에 대 한 250 V에서 차가운 방에 구분 합니다.</li>
			<li>Autoradiography 하 여 젤에 RNA-단백질 복합체의 위치를 찾습니다. RNA-단백질 복합물을 포함 하는 젤 슬라이스 삭제하시오 젤 조각 분쇄 하 고 PK 버퍼에 몸을 담글 하 여 젤 조각에서 RNA을 elute.</li>
			<li>페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조, 공기 더하고 DEPC 처리 한 물에 RNA를 resuspend. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 돌연변이 뉴클레오티드 위치 검출을 위한 요오드 죽 습 Phosphorothioate 제품의 분석
<ol><li>20 µ L DEPC 처리 물 포함 최대 10 µ g 캐리어에에서 1mm 요오드를 추가 RNAs (바운드 및 총 RNAs) phosphorothioate 관의 사이트에서 다니엘에 tRNA. 5 분 동안 실 온에서 품 어. 참고: 요오드 분열 약간 다른 조건에 세부 사항 더-7% (v/v) iodoethanol, 3 분 동안 95 ° C에서 난방-Gish & 엑스 타인과 198819에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>위에서 설명한 대로 추가 나트륨 아세테이트/에탄올, 쪼개진된 RNA 침전. 젤을 변성 시키기 위한 로드 염료에 resuspend. 열 및 RNA 조각에 15-20% 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>노출 x-선 필름 polyacrylamide 젤.</li>
	<li>총 풀 autoradiography를 사용 하 여 대 바인딩된 분수 밴드를 감지 합니다. 참고: 배기 후드에 요오드와 모든 단계를 수행 합니다. 여기에 표시 된 RNA 분리,이 젤의 하단에 추가 인치 긴 스페이서를 삽입 하 여 젤 접시의 하단에 두 스페이서의 두께 두 배로 얻을 수 있다 쐐기 모양의 젤 채택 된다. 이 모양은 짧은 RNA 파편 사이 더 균일 한 또는 더 가깝게 간격을 허용 한다. 또는, 검색 및 방사능의 정량에 대 한 x 선 필름 보다는 phosphorimager는 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins.">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520 (2007).</li><li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo.">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li><li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology.">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li><li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila.">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li><li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells:+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination.">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li><li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B.">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary.">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis.">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal.">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li><li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection.">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li><li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA.">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li><li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry.">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

Mutagenesis은 긴 단백질 바인딩 사이트 특성에 사용 되었습니다. 첫째, 돌연변이의 시리즈 구성 하 고 바인딩 바인딩 선호도에 미치는 영향을 분석 하는 분석에서 개별적으로 테스트 될 수 있습니다. 기준이 mutagenesis 접근 여러 시퀀스를 분석 하는 방법을 제공 하는 동안 여러 단계 돌연변이 구성 하 고 바인딩 각 돌연변이 대 한 반응의 일련과 같은 표준 접근에, 힘들고 시간이 걸리는 이며 하지 않을...

유전자 규칙 생물학에 있는 중요 한 역할을 한다. 유전자의 전사 사전 mRNA 접합, 3' 끝, RNA 수출, 번역, mRNA 지 방화, 붕괴, 포스트 번역 상 수정/안정성, 등 모두 DNA과 RNA 의무적인 단백질 유전자에 핵심 역할 수준에서 통제 될 수 있다 규칙입니다. 수많은 규제 단백질 식별 분자 유전 분석, 하는 동안 그들의 작은 하위 집합만 그들의 세포질 기능 또는 바인딩 사이트 비보완전히 특징 되어 있다. 계통 발생 시퀀스 분석과 mutagenesis DNA 또는 RNA 단백질 상호 작용의 특성을 상호 보완적인 접근을 제공 합니다.
RNA-바인딩 단백질은 성적인 감 별 법을 포함 하 여 개발 프로세스에서 중요 한. 섹스-치명적인 (SXL) 초파리 단백질 또는 마스터 섹스-스위치 단백질은 결 석 남성, 여성에서 현재에. Uridine-풍부한 시퀀스 또는 pyrimidine 책자 다운스트림 사전 mRNA 목표 (변압기, 치명적이 지 섹스, 남성 전용 lethal2) 체세포1,2에서에서 특정 스플라이스 사이트에 인접 한 인식 ,,34. 또한, 그것은 기초의 증강 (e(r)) 사본5,6uridine 풍부한 polyadenylation 증강 시퀀스에 바인딩하여 스위칭 polyadenylation 사이트 조절. SXL 가능성이 조절 되도록 남아 있는 여성 생식에 추가 대상 확인1,7,,89,,1011, 12 , 13.
일반적으로, 바인딩 사이트의 특성을 포함 한다 mutagenesis를, 예를 들어 삭제 또는 단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드의 대체. 야생-타입 RNA 순서를 기준으로 각 돌연변이 바인딩 사이트 다음 바인딩 선호도 결정 하기 위해 일련의 단백질 농도 사용 하 여 분석 (Kd 또는 평형 분리 상수); 관심사의 단백질에 대 한 Kd 50 %RNA 바인딩을 얻을 하는 데 필요한 단백질 농도 이다. 자세한 mutagenesis의이 노동 집약적인 과정 포함 세대 및 수많은 돌연변이의 분석-3 야생 타입 뉴클레오티드 바인딩 사이트에 있는 각 위치에 대 한. 따라서, RNA에 단백질 의무 사이트의 빠르고, 쉽고, 저렴 한 포화 mutagenesis에 대 한 다른 접근 방법에 대 한 필요가 있다.
여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo; a-thio triphosphate</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-017</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo; a-thio triphosphate</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-016</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Millipore&amp;nbsp;25&amp;nbsp;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Millipore</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Schleicher &amp;amp; Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>Dephosphorlyation Kit</td><td>NEB</td><td>M0508</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td></td><td>RNase inhibitor</td></tr><tr><td>Glass Plates</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr><tr><td>Gel Electrophoresis equipment</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr><tr><td>X-ray films</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gel solutions</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

유전자 규칙 개발에 중요 한 역할을 한다. 수많은 DNA과 RNA 의무적인 단백질 높은 특이성 유전자 발현 제어를 가진 그들의 대상 시퀀스를 바인딩합니다. 이러한 규제 단백질 유전자 발현 DNA (전사)의 수준에서 또는 RNA (이전 mRNA 접합, polyadenylation, mRNA 전송, 부패, 및 번역)의 수준에서 제어합니다. 식별 규제 시퀀스의 유전자가 켜거나 전환 뿐만 아니라 또한 어떤 다운스트림 유전자 규정 하는 특정 단백질에 의해 통제 된다 이해 하는 데 도움이 됩니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

도 핑을 사용 하 여 포화 mutagenesis의 원리:
야생-타입 및 다른 뉴클레오티드의 적절 한 어 금 니 비율을 분석 하는 것입니다 한 위치 하는 경우에 모든 4 개의 뉴클레오티드의 동등한 혼합물을 사용 합니다. 그러나, 그러므로 동시에 여러 위치를 분석 비율의 비-야생 타입 야생-타입 뉴클레오티드를 조정 해야 합니다, 즉, 감?...

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A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

6.5K 조회수.  University of Colorado at Boulder. 특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

연구

유전학

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

생화학

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

생물학

Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells

The role of RNA structure in virtually any biological process has become increasingly evident, especially in the past decade. However, classical approaches to solving RNA structure, such as RNA crystallography or cryo-EM, have failed to keep up with the rapidly evolving field and the need for high-throughput solutions. Mutational profiling with sequencing using dimethyl sulfate (DMS) MaPseq is a sequencing-based approach to infer the RNA structure from a base&#39;s reactivity with DMS. DMS methylates the N1 nitrogen in adenosines and the N3 in cytosines at their Watson-Crick face when the base is unpaired. Reverse-transcribing the modified RNA with the thermostable group II intron reverse transcriptase (TGIRT-III) leads to the methylated bases being incorporated as mutations into the cDNA. When sequencing the resulting cDNA and mapping it back to a reference transcript, the relative mutation rates for each base are indicative of the base&#39;s &#34;status&#34; as paired or unpaired. Even though DMS reactivities have a high signal-to-noise ratio both in vitro and in cells, this method is sensitive to bias in the handling procedures. To reduce this bias, this paper provides a protocol for RNA treatment with DMS in cells and with in vitro transcribed RNA.

Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells

The protocol provides instruction for modifying RNA with dimethyl sulfate for mutational profiling experiments. It includes in vitro and in vivo probing with two alternative library preparation methods.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

The role of RNA structure in virtually any biological process has become increasingly evident, especially in the past decade. However, classical ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...