Name: novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

우리는 빠른 프로토콜을 설정하고 필요한 플라스미드를 제공하는 그들의 도움이되는 조언을 교수 제프 Gerst와 보리스 Slobodin 감사합니다. 우리는 또한 LC-MS / MS 분석과 그녀의 도움을 Smoler 단백질 체학 센터에서이 프로토콜 박사 타마 지브을 설정하는 그녀의 도움 박사 Avigail ATIR - 란데 감사합니다. 우리는 YEF3 항체에 대해 교수 TG Kinzy (럿 거스)을 감사드립니다. 이 작품은 Binational 과학 재단에서 보조금 2,011,013에 의해 지원되었다.

참고 : 12 MS2 결합 부위로 이루어진 시퀀스를 삽입 (MS2 루프; MS2L)를 원하는 게놈 로커스로, 일반적으로 오픈 리딩 프레임 (ORF) 및 3 &#39;UTR 사이. 이 통합을위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서 (22)가 제공된다. PCR, 북부 분석 또는 RT-PCR 20,23하여 적절한 삽입 및 발현을 확인합니다. 통합이 3&#39;UTR의 합성에 개입하지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 유도 성 프로모터 (메티오닌 고갈)의 식에 따라 SBP 융합 플라스미드 발현 MS2-CP는 셀 (24)에 도입한다. 도입 MS12 루프 제외한 동일한 균주, 비특이적 신호의 검출을위한 대조군으로 사용한다. 1. 빠른 정화 <ol><li> 효모 세포를 500 ㎖ (관심의 유전자의 발현 수준에 따라 효모 세포 250-1,000 용액 사용) mRNA의 20-MS2 태그를 발현 성장적절한 성장 배지 (예, 합성 덱스 트 로즈 (SD) 선택 배지)에 30 O C에서 1.0 - MS2-CP-GFP-SBP 융합 단백질 24 600 0.8 중독한다. </li><li> 원심 분리기 세포 RT에서 4 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다. </li><li> 메티오닌없이 SD의 동일한 볼륨 (단계 1.1)에서 (단계 1.2)에 resuspend 이전과 같이 1 배 인산 완충 식염수 세포 (PBS), 원심 분리기를 세척하고, 45 부화 - MS2의 발현을 유도하기 위해 60 분 (30)에서 O를 C -CP-GFP-SBP 융합 단백질. 참고 : 긴 유도 시간이 GFP의 응집의 원인이 될 수 있습니다. </li><li> 세포의 옆으로 10 mL로 설정하고 간단한 &quot;뜨거운 페놀&quot;방법 (25)를 사용하여이 샘플에서 RNA를 추출합니다. 주의 : 페놀은 매우 독성 및 안전 지침에 따라 처리해야합니다. 참고 :이 RNA는 고립 된 RNA (그림 1A)의 품질에 대한 좋은 참조입니다. </li><li> 500㎖의 셀들에 대한 최종 C 1.35 ml의 37 % 포름 알데히드를 추가0.1 % oncentration RNA는 단백질 복합체를 가교. 10 분 동안 30 ℃로 배양을 계속합니다. 주의 : 포름 알데히드가 높은 독성과 안전 지침에 따라 처리해야합니다. </li><li> 0.125 M의 최종 농도 2.5 M 글리신의 26.5 ML을 추가하고 가교를 중지 3 분 동안 품어. 이 단계에서 RNA 저하를 최소화하기 위해 얼음에 다 넣어. </li><li> 4 O C에서 4 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포와 45 ml의 차가운 1X PBS로 세척. </li><li> 초기 세포 배양 물 100 ㎖ 당 1 ㎖의 신속한 용해 완충액에 재현 탁 된 세포. </li><li> 나사 덮인의 microfuge 튜브에 500 μL의 분취 량으로 분할하고 각 나누어지는 (대략 전체 0.2 ㎖의 PCR 튜브)에 ~ 냉장 유리 구슬 400 mg을 추가합니다. </li><li> 비드에 세포를 Lyse 3 분간 패는. 즉시 얼음에 해물을 넣어. 주 : 세포 용해 방출을 RNA 분해의 주요 원인이되는 세포를 RNases. 급속 용해 완충액의 RNase INHI의 높은 농도를 포함같은 비특이적의 RNase 억제제 헤파린 특정 억제제로서 bitors. 신속하게 작업 차가운 모든 것을 유지하는 것은 추천합니다. </li><li> 새로운 튜브에 해물을 전송합니다. 피어스 핫 바늘 (0.8 mm × 40 mm)을 가진 각 미세 원심 분리 튜브의 바닥에있는 작은 구멍은 15ml의 튜브 위에 미세 원심 분리 튜브를 배치했다. 의 microfuge 튜브 및 15 ml의 튜브 사이의 어댑터로 5 ML의 주사기의 머리를 사용합니다. O 4 ℃에서 1 분 동안 3,000 XG에 튜브 조립체를 원심 </li><li> 세포 파편을 취소 4 ℃로 10 분 동안 10,000 XG에서 새로운 1.5 ML 튜브와 원심 분리기에 흐름을 통해 15 ML 튜브에서 전송합니다. </li><li> 풀 한 15 ML 튜브에 모두 1.5 ml의 튜브에서 상층 액 및 1/50 곁에 각각 RNA 및 단백질 분리에 대한 해물의 1/100 볼륨. 참고 :이 후속 분석 (그림 1)에 대한 &quot;입력&quot;샘플 될 것입니다. </li><li> 내가 500 ml의 당 아비딘 300 μg의 추가nitial 효모 문화와 일정 압연 (10 회전)에서 4 ℃로 (이 10 분으로 감소 될 수있다) 30 분 동안 품어. 참고 : 스트렙 타비 딘 비드에 결합에서 아비딘 차단 비오틴과 바이오틴 단백질. </li><li> 세포 용 해물과 배양 전 스트렙 타비 딘 비드 사전 세척 하였다. <ol><li> 구슬이 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 슬러리 스트렙 타비 딘의 약 300 μl를 전송하고 상단에 뜨는을 제거합니다. 이 구슬 250 μL가 발생합니다. 빠른 용해 완충액 1 ㎖로 두 번 구슬을 씻으십시오. 각 단계 사이에 4 ℃로 2 분 동안 660 XG에 스트렙 타비 딘 구슬을 원심 분리기. </li><li> 0.5 신속한 용해 완충액 ㎖, 10 ㎎을 0.5 ㎖ / ml의 BSA, 10 ㎎ / ㎖의 효모 tRNA는 10 μL로 1 시간 동안 인큐베이션하여 구슬 차단. 비드 O / N 필요한 경우 회전을 4 ℃로 차단 용액에 남아있을 수있다. </li><li> 빠른 용해 버퍼 1 ㎖로 두 번 씻으십시오. 자성 비드는 또한 시간, 배경을 감소시키기 위해 사용될 수있다 : 참고아 운드. 이러한 그러나, 세 파로스 구슬보다 더 낮은 용량을 가지고있다. </li></ol></li><li> (단계 1.14에서) 아비딘 함유 해물로 미리 세척 된 스트렙 타비 딘 비즈 250 μl를 추가하고 일정한 회전 (10 회전)와 4 ° C에서 1 시간을 품어. 참고 :이 배양 시간이 충분 바인딩 시간을 제공하고 RNA의 분해 가능성을 최소화 사이의 타협이다. </li><li> 4 O를 C에서 2 분 동안 660 XG에 원심 분리기는 스트렙 타비 딘 비즈를 지우고 새로운 15 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 각각 따로 1/50 및 RNA와 단백질 분리 용 해물의 1/100 볼륨을 설정합니다. 참고 : 다음은 &quot;언 바운드&quot;샘플 될 것입니다. </li><li> 단계 1.17에서와 같이 부드럽게 흔들어 신속하게 용해 버퍼의 1 ml의 구슬을 씻으 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송하고 원심 분리기. 이 단계를 세 번 반복합니다. </li><li> 1 빠른 세척 버퍼 ml의, 4 ℃에서 5 분 동안이 시간 회전 (10 회전)으로 구슬을 씻으십시오. 두 번이 단계를 반복합니다. </l난&gt; <li> 위와 같이 1 1X PBS ㎖의 원심 분리기로 구슬을 씻으십시오. </li><li> 1X PBS 120 μl를 다시 구슬을 씻으십시오. 원심은 위와 같이하고, &quot;세척&quot;시료로 RNA와 단백질 추출을위한 전체 상층 액을. 참고 :이 마지막 세척 샘플이 세척의 엄격 성을 나타냅니다 및 용출 샘플과 동일한 볼륨이어야합니다. 이 이후의 분석에서 처리 및 로딩을 단순화합니다. </li><li> 열에서 RNA와 RNA 관련 단백질을 용출 1X PBS에서 6 밀리미터 비오틴 120 μl를 추가하고 일정한 회전 (10 회전)으로 4 ° C에서 45 분 동안 품어합니다. </li><li> 원심 분리기는 구슬 위와 같이 새로운 1.5 ML 튜브에 용출 자료를 전송합니다. 다시 용출 샘플을 스핀과 구슬의 어떤 이월 없도록 새로운 1.5 ML 튜브에 위의 위상을 전송합니다. </li><li> RNA 또는 단백질 추출을위한 샘플을 채취. 주 : 촬영 볼륨이 RNA 또는 관심 단백질의 다음 분석 및 발현 수준에 의존한다. 북부 분석 (26)에 대한 가이드 라인으로서, 웨스턴 블롯 (23,27) 또는 RT-PCR (28)에 대해, 샘플의 80 %을 20 %을, 그리고 질량 분석 (29)에 대해, 새로운 단백질을 발견 전체 샘플을 채취 할 수 있습니다. </li></ol> 2. RNA 추출 <ol><li> 배 가교 반전 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 65 ° C에서 45 분 동안 품어. RNA 추출을 위해 직접 진행합니다. 참고 : 가교 반전 버퍼가 크게 RNA 추출 (20)을 향상 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함한다. </li><li> 표준 페놀을 사용하여 클로로포름 방법 (26)를 &quot;입력&quot;및 &quot;언 바운드&quot;샘플 (1.13 및 1.17 단계)에서 RNA를 추출 할 수 있습니다. 주 : 이들 샘플은 (예를 들어, RT-PCR)을 따라서, LiCl이 침전 (30)을 제거하기 위해 권고되는 후속 역방향 Transcriptase- (RT)를 이용 분석을 억제 할 수있는 RNA 분해 효소 억제제, 헤파린 많은 양을 함유한다. 은 &quot;WASH &quot;및&quot;용출 &quot;샘플 (1.21 및 1.24 단계) RNA의 소량을 함유하고 다음 단계로 석출된다. </li><li> 은 &quot;세척&quot;와 &quot;용출&quot;샘플 8M 구 아니 디늄 염산 (GuHCl) 100 % 에탄올 두 권의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적어도 2 시간 동안 -80 ℃에서 인큐베이션. 참고 : 구 아니 디늄 효율적으로 단백질을 변성시켜 샘플에서 RNases 및 단백질 분해 효소를 억제한다. </li><li> 20,000 XG, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 20,000 XG, 15 분 동안 4 ° C에서 다시 차가운 80 % 에탄올과 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 의 RNase없는 물 400 μL의 RNA 펠렛을 용해하고 남은 GuHCl 또는 기타 오염 물질을 제거하기 위해 다시 침전. 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.2 ~ 100 % 에탄올 800 μL의 40 μL를 추가 적어도 1 시간 동안 -20 ℃에서 배양한다. </li><li> 원심 분리기 단계 2.4에서와 같이 씻어 10 μl를 끝으로 모든 에탄올을 제거하고. RNA의의 펠을 재현 탁10 μL의 RNase 무료 물 등. RNA의 펠렛은 일반적으로 볼 수 없습니다로 추가주의하십시오. 참고 : 23 (도 1)에 기술 된 바와 같이 샘플 노던 분석을 위해 사용될 수있다. </li></ol> 3. 단백질 서쪽 오점 또는 질량 분광법 분석을위한 준비 <ol><li> 단백질 시료에 4 배 램 믈리 샘플 버퍼 (LSB)의 1/3 볼륨을 추가하고 RNA와 단백질의 가교 역 65 ° C에서 45 분을 품어. 참고 : 시료는 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (SDS-PAGE) (31)에 실행 단백질. 분석 될 단백질의 크기에 따라, 겔의 비율을 조정한다. 참고 : 10 % 아크릴 아미드 겔 분리 폭넓게 제공하고 제 근사치 좋다. </li><li> 분리 효율 (그림 1C)의 제어를위한 표준 면역 분석 (27)과 막 단백질을 전송합니다. 쿠마시 블루 R 중 하나와 얼룩질량 분석 분석 전에 250 실버 얼룩. 참고 : 더 민감하고 더 나은 감지 (그림 1B)를 할 수 있기 때문에 실버 스테인이 선호하는 선택입니다. 염색은 수동으로 준비 솔루션 또는 상업적 키트 중 하나를 수행 할 수 있습니다. 최종 염료 용액에 겔의 배양 시간은 실험적으로 결정되어야한다. 긴 배양 낮은 풍부한 단백질을 밝힐 수 있지만, 이러한 MS2-CP-SBP-GFP로 높은 발현 된 단백질이 넘는 스테인드 질 수 있습니다 자신의 주변에 주변의 단백질을 마스크 수 있습니다. 또한, 높은 배경이 발생할 수 있습니다. 조심스럽게 반응을 수행하고, 적절한시기에 중지 솔루션을 추가합니다. </li><li> 겔에서 밴드를 잘라 1.5 ml의 튜브로 전송. -20 ° C에서 보관 샘플, 또는 LC-MS / MS 분석 (32) 다음에 단백질 추출 및 트립신 소화 보냅니다. </li><li> 겔 분리 단계를 제외하는 다른 단백체 접근함에 따라, 단계 1.24의 용출 물질 다이제스트LC-MS / MS 분석 (33)에 트립신과 피사체를 사용 lution. 참고 : SDS-PAGE 분리를 생략하는 프로토콜을 단순화하고 수율을 증가시킨다. 그러나, 샘플은 질량 분석 분석을 억제 세제 NP-40의 흔적을 포함 할 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해 다음 단계를 수행 <ol><li> 15 분 - 10 SDS-PAGE (31)에서 단백질을 실행합니다. </li><li> (단백질이있는 예) 차선의 전체 부분을 잘라. 주 : 단백질 샘플 낮은 풍부한 단백질의 신호를 모호하게 할 수있다 MS2-CP-SBP 단백질의 상당한 양을 포함 할 수있다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs,+suggesting+an+extensive+regulatory+system.">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255 (2008).</li><li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li><li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+processing+and+its+regulation:+global+insights+into+biological+networks.">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li><li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria.">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li><li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks.">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li><li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING.">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203 (2014).</li><li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system.">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li><li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo.">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li><li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p.">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li><li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions.">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li><li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Genomics:+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation.">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li><li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins.">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes.">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li><li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+factor+eEF3+(Yef3)+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner.">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).</li><li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3'-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein.">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li><li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast.">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li><li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3'-UTRs+and+their+ORFs.">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RaPID:+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes.">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs.">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li><li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRFbeta,+a+novel+regulator+of+calcium+signaling,+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain.">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li><li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells:+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes.">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li><li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site.">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li><li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria.">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(1D+SDS-PAGE).">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li><li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow.">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).</li><li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry.">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li><li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StreptoTag:+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins.">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li><li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+steps+forward--one+step+back:+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes.">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li><li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein.">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li><li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum.">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage.">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14 (2004).</li><li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR/Cas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway.">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572 (2015).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li><li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation.">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li><li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC+yeast:+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification.">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

다양한 방법 관련 단백질 11,34 (35)를 식별하는 특정의 mRNA의 분리를 사용한다. 이러한 방법은 RNA 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 생체 외 및 생체 전략에 적용됩니다. 체외 방법은 외생 RBPs를 캡처 RNP 단지 (36, 37)을 분리하는 세포 용 해물과 RNA를 전사 품어. 이 유형의 효과적인 방법은 규제 RNA 모티프 (18)에 결합 신규 단백질의 식별 가능하게?...

RNA 결합 단백질 (RBPs)는 S.의 약 10 %를 차지 cerevisiae의 단백질 2 및 포유 동물 단백질의 약 3 ~ 15 %. 그들은 이러한 mRNA의 전사 후 처리 및 규제, 번역, 리보솜 생물 발생, tRNA의의 aminoacylation 및 수정, 크로 마틴 리모델링, 그리고 더 많은 세포 과정에 연루되어있다. RBPs의 중요한 하위 그룹은 mRNA에 결합 단백질 (mRNPs) 6,7입니다. mRNA의 성숙의 과정에서, 다른 RBPs은 성적 증명서를 결합하여 핵, 세포 현지화, 번역 및 열화 6-8에서 핵 처리, 수출을 중재. 따라서, 어느 시점에서 특정 성적 증명서에 바인딩 RBPs의 고유 한 세트의 처리 및 궁극적으로 운명을 결정합니다. 의 mRNA와 관련된 RBPs의 식별은 크게 자신의 전사 후 조절을 기본 프로세스에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 유전 다양한현미경, 생화학 및 생물 정보학 방법 (9-11 검토) mRNA의 조절에 관여하는 단백질을 식별하는 데 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법의 일부는 특정 대상의 mRNA와 관련된 단백질의 식별을 가능하게한다. 참고로 효모 세포에서 발현 라이브러리를 화면에 미끼로 관심의 mRNA를 이용하는 효모 세 하이브리드 시스템 (Y3H)입니다. 양성 클론은 일반적으로 성장 선택 또는 리포터 식 12-14를 통해 관찰된다. 이 방법의 핵심 이점은, 셀룰러 환경과 RNA - 단백질 상호 작용의 강도를 측정 할 수있는 능력으로 스캔 할 수있는 단백질의 큰 수이다. 단점으로 인한 비특이적 결합에 위양성 결과의 상대적으로 큰 수 및 융합 단백질 먹이 또는 미끼 RNA의 미스 폴딩으로 인해 일부 위음성 결과에 대한 높은 가능성을 포함한다. 유전자 접근 방식에 대한 대안은 친 화성 purifi입니다관련 단백질과 RNA의 양이온. 폴리 A를 함유하는 mRNA를 올리고 DT 컬럼을 사용하여 분리 될 수 있고, 그와 관련된 단백질을 질량 분석에 의해 검출된다. RNA의 단백질 상호 작용은 단거리 공유 결합을하게 가교하여 그 세포 문맥에 보존된다. 올리고 DT 컬럼의 사용은 mRNA의 3,5,15를 A-포함 된 폴리와 관련된 전체 프로테옴의 글로벌 뷰를 얻을 수 있습니다. 그러나 이것은 특정의 mRNA와 관련된 단백질의 목록을 제공하지 않는다. 아주 몇몇 방법은 식별을 수행 할 수 있습니다. 한 쌍의 방법은 표적 mRNA의 16, 17에 상보성 핵산의 트랜 스펙 션을 수반한다. 핵산은 또한 상호 작용 부위에 가까운 부근에 가교 RBPs 허용하는 펩티드에 부착된다. 가교 후, RBP-펩티드 핵산을 분리 할 수 ​​있고, 단백질 체학 분석을 실시한. 최근에, 앱타 머가 기반 방법이었다성공적으로 포유류 세포 선 (18)로부터 추출에 적용. 스트렙 타비 딘에 향상된 친 화성을 갖는 RNA 앱 타머 개발하고 (이 경우, AU 부유 요소 (ARE)) 관심의 서열에 융합되었다. 앱타 머는 ARE-RNA는 스트렙 타비 딘 비드에 부착 된 세포 용 해물과 혼합 하였다. ARE 시퀀스와 연관된 단백질을 정제하고, 질량 분석 (MS)에 의해 확인되었다. 이 방법은 셀룰러 설정 (즉, 생체 외) 외부에서 발생하는 연결을 검출되지만, 상기의 mRNA와 관련된 단백질의 분리를 게놈에 앱 타머를 도입함으로써 가능하도록 미래에 수정 될 가능성이있는 반면 셀룰러 환경 (즉, 생체 내). 유전자 조작이 잘 확립되어 효모에서, (교수 제프 Gerst의 실험실에서 개발) 빠른 방법은 생체 협회 (19)의 전망을 제공합니다. 급속한은 (특정과 MS2 코트 단백질의 결합 강한 MS2-을 결합등) 스트렙 타비 딘 - 결합 도메인 (SBP의 MS2의 RNA 서열 CP)는 공액 비드를 스트렙 타비 딘. 이 스트렙 타비 딘 비즈를 통해 MS2 - 태그의 mRNA를 효율적으로 정화 할 수 있습니다. 또한, MS2 루프 12 카피의 발현은 RNA에 동시에 결합 및 분리의 효율을 높이기 위해 여섯 MS2-CP를 최대 허용한다. 이 프로토콜에 따라서 용출 샘플을 질량 분석기에 의해 단백질 체학 분석을 실시한되면 신규 mRNA에 관련된 단백질의 식별 가능하도록 제안 하였다. 우리는 최근에 효모 PMP1의 mRNA (20)와 관련된 새로운 단백질을 식별하기 위해 빠른을 이용했다. PMP1 mRNA의 이전 ER 막과 연관 될 및 3 &#39;번역되지 않은 지역 (UTR)이이 협회 21의 주요 결정 요인 인 것으로 밝혀졌다 줬습니다. 따라서 PMP1 3 &#39;UTR 바인딩 RBPs은 자국어에 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 빠른 액체 크로마토 그래프 다음Y 질량 분석 / 질량 분석기 (LC-MS / MS)은 PMP1 (20)와 상호 작용하는 많은 새로운 단백질의 동정 결과. 여기서, 우리는 빠른 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공해야 할 중요한 컨트롤을 수행하고, 수율 및 특이성을 향상시킬 수있다 기술적 인 조언한다.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm diameter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Hot phenol lysis buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% and 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID lysis buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &amp;micro;g/ml Leupeptin, 10 &amp;micro;g/ml Aprotinin, 10 &amp;micro;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &amp;micro;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Cross-linking reversal buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID wash buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&amp;nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>161-0449</td><td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>SD selective medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td><td>Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

급속한은 관련 단백질과 특정 대상 RNA의 분리 할 수 ​​있습니다. 성공에 중요하여 단백질의 충분한 양을 얻을 최대한 그대로 RNA를 유지한다. RNA의 분리 효율과 품질을 확인하려면, 북부 분석 (그림 1A)를 수행한다. 노던 분석을 직접 신속의 효율성과 품질을보고하는 이점을 갖는다. 따라서, 전체 길이 및 분해 생성물의 상대적인 양 번의 실행에서 결정될 수?...

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K 조회수.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

암 연구학

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

유전학

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

생물학

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57516">Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells. J. Vis. ...