이 방법은 골수성 세포 혈통의 성숙 이상으로 진화하는 골수증 증후군 또는 그밖 혈액학 질병과 같은 골수성 질병의 진단에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석 및 해석에서 조사자의 주관성을 감소시키는 것입니다. 이 방법은 myelodysplasia에 대 한 가장 차별 매개 변수에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
그것은 정상적인 골수성 세포 집단에서 차이의 정량화를 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 박사 후 동료 인 Tiphanie Picot가 될 것입니다. 먼저 1차 세포 샘플의 600마이크로리터를 15밀리리터의 세정 버퍼와 혼합하여 15밀리리터 원심분리및 세척당 10밀리리터의 신선한 세척 버퍼를 넣습니다.
두 번째 세척 후, 400 마이크로리터의 신선한 세척 완충제에서 펠릿을 다시 중단하고, 백본 항체의 전체 패널을 포함하는 5밀리리터 폴리프로필렌 FACS 튜브로 세포 현탁액의 350 마이크로리터를 이송한다. 세포를 철저히 혼합한 후, 파이펫은 세포 항체 용액의 동일한 부피를 3개의 새로운 폴리프로필렌 튜브로 가져와 필요에 따라 신선한 세척 버퍼로 최대 200 마이크로리터의 각 튜브에 최종 부피를 가져옵니다. 다음으로, 혼합과 관심있는 세포 표면 마커에 대한 적절한 항체의 적절한 부피를 실내 온도에서 30 분 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
인큐베이션이 끝나면 라이싱 용액 2밀리리터를 혼합하여 실내 온도에서 10분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 원심분리에 의해 용액 세포를 수집하고 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브의 마지막 50 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 폐기하십시오. 나머지 상수체에 펠릿을 다시 일시 중단하고 부드러운 혼합으로 각 샘플에 신선한 세척 버퍼 2 밀리리터를 추가합니다.
두 번째 세척 후, 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에 약 50 마이크로 리터 잔류 볼륨을 남기고, 슈퍼 나탄을 폐기하십시오. 즉각적인 분석을 위해 PBS의 200 마이크로 리터에서 혼합을 통해 펠릿을 다시 중단합니다. 유동 사이토미터에서 샘플을 읽으려면 먼저 유동 사이토미터 소프트웨어에서 새 실험을 열고 이름, 샘플 유형 및 날짜에 따라 실험이름을 바꿉니다.
3개의 튜브에 대한 새로운 표본을 만들고 실험 레이아웃에서 각 튜브에 사용되는 항체를 지정한다. 사이토미터 설정을 열고 응용 프로그램 설정을 선택하여 월별 설정에서 얻은 값을 적용합니다. 새로운 글로벌 워크시트를 열고 단일 세포를 게이팅하는 데 적합한 점 플롯을 만들뿐만 아니라 과립구, 단세포, 폭발 및 림프구 집단을 만듭니다.
보상 컨트롤에 대한 새 전역 워크시트를 만듭니다. 그런 다음, 각 튜브에서 500, 000 이벤트를 중간 획득 속도로 획득하여 기술 검증 후 FCs 3.0 파일로 데이터를 내보냅니다. 새 분석을 시작하기 전에 일반 골수 데이터를 포함하는 cyt 파일을 다운로드하여 호중구, 단낭식 및 핵적 인 적색 혈통및 분석 파일을 inp 형식으로 다운로드하십시오.
그런 다음 데이터를 데스크톱에 저장합니다. 호중구 성숙을 데이터 베이스에 저장하기 위해 먼저 Infinicyt 소프트웨어를 열고 호중구 성숙 데이터에 해당하는 cyt 파일을 엽니다. APS 그래프에 성숙 경로를 그리고 호중구의 성숙 경로를 데이터베이스에 저장합니다.
분석해야 하는 호중구 혈통 성숙을 위한 fcs 파일을 엽니다. 프로파일 탭에서 호중구 성숙 성 개시 파일을 업로드합니다. 이 계보에 대한 분석은 세 단계로 나뉩니다.
CD34 양성, 호중구 커밋 된 폭발의 선택으로 시작합니다. 이를 목표로 7개의 게이트의 교차를 사용하여 CD34 긍정, CD117 긍정, HLADR 로우, CD10 음수, CD13 양성, CD11b-음수 이벤트를 선택할 수 있도록 합니다. CD117 양성, CD34 음성 호중구 전구체의 선택으로 분석을 계속한다.
더 성숙한 호중구 세포의 선택으로 분석을 계속합니다. 다음으로, 단핵 계보 세포의 분석을 보여 준다. APS 그래프에 성숙 경로를 그립니다.
성숙감을 나타내는 화살표가 미성숙, 단세포 세포, CD14 음성, IREM2 음성, 성숙한 단핵구, CD14 양성, IREM2 양성으로부터 지향되는지 확인한다. 데이터베이스에 단화 혈통에 대한 성숙 경로를 저장합니다. 분석해야 하는 단화 계보 성숙을 위해 fcs 파일을 엽니다.
단화 계보 분석을 위해 프로필을 업로드합니다. 단세포 계보 세포를 식별하려면 CD64 긍정 하이, CD117 긍정, CD117 음수, HLADR 양성 이벤트를 선택할 수 있는 4개의 게이트의 교차점을 사용합니다. 이러한 이벤트를 모집단 계층 구조 트리의 단화 탭에 할당합니다.
NRC 데이터베이스에 저장해야 하는 NRC cyt 파일을 엽니다. APS 그래프에 성숙 경로를 그리고 핵으로 된 적혈구 성숙 경로를 데이터베이스에 저장한다. 분석해야 하는 FC 파일을 엽니다.
프로파일에서 핵적 인 적혈구에 대한 분석 템플릿을 업로드합니다. 이 계보에 대한 분석은 두 단계로 나뉩니다. CD34 양성의 선택으로 시작, 에리스로이드 커밋 폭발.
여기서, CD34 긍정, CD117 긍정, HLADR 로우, CD105 긍정, CD33 네거티브, CD36 양성, CD71 양성 이벤트를 선택할 수 있도록 7개의 게이트의 교차를 사용합니다. 이러한 이벤트를 인구 계층구조의 NRC 탭에 할당합니다. 가시성에서 CD34 포지티브 에리스로이드 커밋된 폭발을 제거합니다.
더 성숙한 적혈구를 식별하려면 CD45 음수 및 CD45 양성 낮은, 측면 산란 저, CD36 양성 높은 CD71 의 차별을 허용하는 네 개의 게이트의 교차점을 사용합니다. 이어서, CD36 높은 측산란을 핵적적 세포로부터 낮은 혈소판을 제거하고, NRC 탭에 이 집단을 할당한다. 골수 구획에서 골수성 성숙을 평가하기 위해 평가해야 하는 경우로부터 관심의 계보에 해당하는 시동 파일을 엽니다.
모집단 계층 구조 트리에서 호중구 탭에 할당된 이벤트만 표시합니다. APS 그래프에 성숙 경로를 그리고 일반 골수에서 호중구의 성숙에 대응하는 데이터베이스를 로드하고 데이터를 비교합니다. 데이터가 적어도 부분적으로 호환되는 경우 소프트웨어는 성숙 차이를 시각화하기 위해 정규화된 성숙 차이 다이어그램과 매개 변수 대역을 만듭니다.
골수 구획의 단핵구 성숙을 비교하기 위해, 단핵세포 데이터베이스를 포함한 정상 골로의 데이터와 함께 새로운 케이스에 대해 단핵 세포 계보에 해당하는 cyt 파일을 엽니다. 모집단 계층 구조 트리의 단핵구 탭에 할당된 이벤트만 표시하고 APS 그래프에 성숙 경로를 그립니다. 일반 골격 에 단핵구 성숙에 대응하는 데이터베이스를 로드하고 데이터를 비교합니다.
골수 구획에서 핵으로 된 적혈구 성숙을 비교하기 위해, 새로운 경우, NRC 데이터베이스에 포함된 정상 골로의 데이터와 함께 NRC의 혈통에 해당하는 cyt 파일을 엽니다. 인구 계층 구조 트리의 NRC 탭에 할당된 이벤트만 표시합니다. 그리고 APS 그래프에 성숙 경로를 그립니다.
정상적인 골격 에 NRC 성숙에 해당하는 데이터베이스를 로드하고 데이터를 비교합니다. 그런 다음 데이터베이스에 포함된 새 파일과 데이터 간의 차이점의 중요성을 시각화하려면 정규화된 성숙 차이 및 확대/축소를 클릭합니다. 흐름 사이토메트릭 데이터 분석에서 계층적 분류 알고리즘을 사용하는 방법은 세포 집단 중복에 포함되지 않기 때문에 매우 주관적이고 본질적으로 부정확하다는 것을 기억하십시오.
골수성 정상 성숙 데이터베이스에 대하여 MDS인 것으로 의심되는 사이토페니아의 새로운 케이스의 평가는, 세포학 또는 세포원 이상 없이 조차 호중구, 단세포 및 NRC 혈통의 비정상적으로 표현된 성숙 항원의 확인을 허용합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 표준화 된 방식으로, 월별 사이토미터 설정, 일일 검사를 수행하고, 사용하기 전에 항체를 엄격하게 피펫하고, 염색 시간을 존중하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 나침반과 같은 다른 방법은 다른 사례 그룹을 비교하고 특정 사례 그룹에 대한 최종 타이픽 인쇄물과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 이형성 공정에 안정적으로 관련된 최종 타이픽 변화를 식별하기 위해 불확실한 잠재력의 클로널 혈종의 경우, 골수성 세포 성숙 패턴을 탐구에 관심이 연구자에 대한 길을 포장. 건강한 기증자의 데이터 수가 증가함에 따라 데이터베이스를 업데이트하면 분석의 견고성이 향상될 수 있습니다.
