이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 일반 항체 또는 항체 생명 치료제에 사용될 수 있는 인간화된 마우스 모델뿐만 아니라 자가면역 경향이 마우스 모델의 이해를 촉진합니다. 형광의 계속 확장 범위를 가진 시약의 가용성은 개별 적인 세포에 다중 파라미터의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었다.
유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정합니다. 안녕하세요, 저는 믿음 해리스입니다. 오늘 절차를 시연할 것입니다.
각 동물에서 각 세포 유형의 백만을 96웰 U-바닥 플레이트로 알리싱하는 것으로 시작합니다. 전체 얼룩, 형광 - 마이너스 - 1 샘플 및 각 형광에 대한 얼룩이없는 샘플을 포함하여 모든 샘플 및 컨트롤에 충분한 우물을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 골수 성숙 패널과 비장 성숙 패널의 경우, 각 전체 얼룩 샘플에 대해 잘 1백만 개의 세포로 알리쿼트 세포를 넣습니다.
단일 색상 보정 생존가능성 컨트롤의 경우 각 셀 유형각각2백만 개의 셀을 개별 우물에 추가합니다. 섭씨 4도에서 2분간 845 x g의 플레이트원심분리기. 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의하여 접시를 싱크대 위로 빠르게 반전시키고 쓸어 넘기면 상체를 제거합니다.
DPBS의 200 마이크로 리터에서 두 번 세포를 세척합니다. 원심 분리기와 각 세척 후 상퍼를 디칭합니다. DPBS에서 희석된 생존성 염료 100마이크로리터에서 세포를 1-1000의 비율로 재일시 중단하여 단일 색상 보정에 사용되는 세포를 피한다.
각 얼룩 세트에 대해 완전히 얼룩지지 않은 샘플 및 생존 가능성 FMO 제어를 위해 얼룩이 없는 추가 우물을 남기고 완전히 얼룩지지 않은 샘플 및 기타 컨트롤을 남겨 둡니다. 이러한 우물에 PBS를 추가합니다. 희석된 생존성 염료의 200 마이크로리터에서 단일 색상 보정 생존 가능성 제어의 세포를 다시 중단합니다.
이 세포의 100 마이크로리터를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 65도에서 5분 동안 가열된 세포를 나머지 살아있는 세포와 함께 원래로 다시 옮기시다. 빛으로부터 보호되는 30분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 다른 우물을 교차 오염시켜 서퍼나탄을 가볍게 하거나 반전시면 상퍼를 제거합니다.
DPBS의 200 마이크로 리터에서 다시 중단하여 세포를 씻어 낸 다음 원심 분리기를 하고 이전과 같이 상퍼를 데칭하십시오. DPBS 세척을 다시 반복합니다. 1-50의 비율로 스테인 버퍼로 희석된 FC 블록의 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.
회중 세포의 경우, 비특이적 염색을 줄이기 위해 5개의 마이크로리터를 모노사이클 차단제를 첨가한다. 그런 다음, 빛으로부터 보호, 15 분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양. 텍스트 원고의 항체 테이블을 사용하여 백만 세포당 100 마이크로리터의 최종 부피를 위해 얼룩 버퍼에 전체 얼룩 마스터 믹스 및 FmOs를 준비합니다.
FC 블록을 제거하지 않고, 선택한 우물에 전체 얼룩 믹스와 FmOS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 각 항체 및 얼룩 세트에 대한 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다. 보상 구슬을 사용하는 경우 제조업체의 지시에 따라 다.
세포와 구슬을 4°C에서 30분간 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 원심 분리기를 뒤집어 접시를 가볍게 하여 상체를 장식합니다. 세포와 구슬을 200 마이크로리터의 얼룩 버퍼로 세 번 씻고 매번 상체를 원심분리하고 해독합니다.
DPBS에서 2%파라포름알데히드의 200 마이크로리터에서 세포와 구슬을 다시 중단하여 분석을 위한 샘플을 수정합니다. 세포와 구슬을 섭씨 4도에서 30분간 배양하고, 빛으로부터 보호한 다음 원심분리기를 제거한 다음, 판을 뒤집거나 쓸어넘기면 상퍼를 데칭합니다. 얼룩 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포와 구슬을 다시 중단합니다.
필터 플레이트를 깨끗한 96웰 U-바닥 플레이트 위에 놓고 각 샘플을 멀티 파이펫을 사용하여 필터 플레이트의 우물로 옮기습니다. 필터 플레이트를 원심 분리하고 상체를 데칭합니다. 골수 및 비장 성숙 패널의 경우 얼룩 버퍼 100 마이크로리터에서 완전히 얼룩진 세포를 다시 중단하십시오.
각 동물에 대한 두 개의 우물을 하나의 우물로 결합합니다. 나머지 패널, FmOs 및 컨트롤을 스테인 버퍼 200마이크로리터에서 다시 중단합니다. 고정 된 세포와 구슬을 밤새 섭씨 4도에서 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
준비된 단일 얼룩 보정을 사용하여 각 얼룩 패널에 대한 보상 컨트롤을 기록하고 각 샘플에 대해 긍정적이고 음수 게이트를 설정합니다. 소프트웨어를 사용하여 보상 행렬을 계산합니다. 첫 번째 샘플을 획득하기 시작하여 게이트가 적절하게 설정되었는지 확인합니다.
텍스트 원고에 언급된 대로 각 샘플의 다양한 셀 이벤트를 실행하고 기록하도록 컴퓨터를 설정합니다. 텍스트 원고의 게이팅 전략에 따라 흐름 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행합니다. 복막에서 복막 B 세포의 특성화를 위한 유동 세포 측정 분석은 마우스에서 실행 가능한 복막 세포, 총 B 세포, B-1 및 B-2 서브셋뿐만 아니라 B-1a 및 B-1b 세포의 주파수를 나타낸다.
골수 B 세포가 분석되었을 때, 실행 가능한 세포의 주파수, 총 B 세포, 분획 A, 사전 프로 B 세포, 분획 B, 분획 C, 분수 C'분수 D, 미성숙 분수 E, 과도기 분수 E 및 마우스내분수 F B 세포가 결정되었다. 비장 B 세포의 분석은 생쥐에서 실행 가능한 비장 세포, 총 B 세포, 과도기 B 세포, T1, T2, T3 세포, 성숙한 B 세포, 여포 I 세포, 여포 II 세포, 전구체 및 성숙한 한계 영역 세포 및 B-1 세포의 주파수를 나타낸다. 마우스내 면역글로불린 카파 및 면역글로불린 람다 B 세포의 주파수는 비장의 유동 세포 측정 분석으로 결정되었다.
이 프로토콜을 수행할 때보정 컨트롤을 사용하여 한 검출기의 신호를 다음 단계로 이상 출혈로 해결해야 합니다. 이러한 컨트롤은 셀이 소독적으로 염색되거나 상업적으로 이용 가능한 보상 구슬이 있을 수 있습니다. 추가 분석법은 림프구 내세포 국소화를 시각화하기 위한 면역조직화학과 같은 유동 세포측정과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 실제 공간과 시간에 B 세포 반응을 분석하기 위해 2개의 광자 현미경 검사법을 사용할 수 있다.
B 세포 구획의 유동 세포 분석은 BCR 및 관련 결핍, BCR 신호 분자의 방해 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 붕괴와 관련된 표현형의 특성화를 허용합니다.
