이 작품 (김 영 연)를 국가 연구 한국 재단 (2015R1D1A1A01060839)에서 교부 금에 의해 그리고 (MSIT) 한국 정부에 의해 자금 한국 국가 연구 재단 (NRF) 교부 금에 의해 지원 되었다 (번호 2016R1A2B2008887 호 2016R1A5A2007009) (Jeanho 윤)에.

1. 노 쇠를 Oncogene 유도 유도
<ol><li>
준비는 H-RasV12 레트로 바이러스
	<ol>
<li>실 온에서 0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트.</li>
		<li>진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.</li>
		<li>접시 3 x 106 ecotropic BOSC 23 포장 코팅 문화 접시와 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스, 전지와 CO2 조직 문화에서 37 ° C에서 문화 1 d 인큐베이터입니다.</li>
		<li>다음 날, transfect retroviral 포장 DNA (pGAG/폴의 2 µ g과 pVSVG의 0.25 µ g) 함께 pBabe 순수 하지 않아-H-RasV12 DNA의 2 µ g transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.</li>
		<li>Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 어떤 세포질 파편을 제거 합니다.</li>
		<li>0.45 μ m 주사기 필터와 h 조-Ras 바이러스 포함 된 미디어를 필터링 합니다. 참고: 어떤 및 효율적인 바이러스 감염에 대 한 바이러스 supernatants의 해빙 하지 마십시오. 최고의 효율을 얻기 위해 바이러스 감염으로 같은 날에 수확 했다를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 WI-38 정상적인 인간의 fibroblasts
	<ol>
<li>10 %FBS 1% 페니실린/스 1 d H RasV12 레트로 바이러스를 수확 하기 전에 포함 된 DMEM 5 x 104 WI-38 셀 60 m m 문화 접시에 접시와 37 ° c.에 1 일에 대 한 문화</li>
		<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 H-RasV12 레트로 바이러스 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 2 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가 1 mL를 추가 합니다. 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 1 일에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>H RasV12 레트로 바이러스 혼합 후 24 h를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 2 일 동안 puromycin의 2 µ g/mL로 세포를 치료.</li>
		<li>Puromycin 선택의 2 d, 후 성장 매체를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 셀 습도 37 ℃, 5% CO2 배양 기 전 까지는 지정 된 시간 ( 그림 1A 는 회로도 참조)에 문화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 모니터링 노화 관련 된 β-galactosidase 통해 노화 얼룩
<ol><li>
다음 재고 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) 디 메 틸 formamide (DMF)에서 20 mg/mL를 준비 합니다. -20 ° c.에 솔루션 저장</li>
		<li>(126 m m) 나2HPO4.7H2O 3.377 g을 용 해 하 여 연산/나트륨 인산 염 버퍼를 준비와 연산 (36.8 m m) 100 mL의 증류수의 0.708 g. 필요한 경우 6.0, pH를 조정 합니다.</li>
		<li>0.5 M 칼륨 ferrocyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장</li>
		<li>0.5 M 칼륨 ferricyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장 참고: 노화 관련 된 β-galactosidase (SA β-gal) 얼룩 솔루션의 pH는 정확한 결과 위해 중요 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5mm 칼륨 ferrocyanide, 5 mM 칼륨 ferricyanide, 20% (v/v) 연산/나트륨 인산 염 버퍼, 그리고 1 mg/mL의 X 재고 솔루션을 diluting 하 여 신선한 SA β-gal 얼룩 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>문화 미디어를 제거 하 고 세척 셀 1 x 1 x PBS. 실 온에서 5 분 동안 3% 포름알데히드와 셀을 수정 합니다. 참고: 셀 하지는 레트로 바이러스와 함께 감염 되는 부정적인 컨트롤으로 사용 한다. 감염된 제어 셀 proliferating 그들의 상태를 유지 하기 위해 passaged를 계속 해야 합니다.</li>
	<li>셀에서 고정 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS로 그들을 씻어. 추가 갓 1 x SA β-gal 얼룩 솔루션 (1.5 mL 60mm 문화 접시에서)을 준비 합니다. 건조를 방지 하 고 37 ° c.에 24 h에 대 한 그것을 품 어 파라핀 영화와 함께 요리를 봉인 또는, 습도 챔버에 함께 요리를 품 어. 참고: 통 솔루션 3% 포름알데히드를 포함 해야 합니다 수 삭제의 유해 폐기물로. CO2 없이 인큐베이터는 인큐베이션 기간 동안 pH 변화를 방지 하는 것 이다.</li>
	<li>다음 날;에 현미경으로 세포의 착 색 상태를 확인 SA β-gal-긍정적인 세포 perinuclear 지역에 파란색 표시 됩니다. 참고: proliferating 제어 셀 SA β-gal-긍정적인 세포의 낮은 주파수 표시. 경우는 얼룩 빛, 계속 약간 더 긴 기간 동안 보육 (대표 예 그림 1B 를 참조).</li>
	<li>CCD 카메라는 10 배 또는 큰 렌즈를 사용 하 여 SA β-gal 얼룩 이미지를 취득 합니다. 충분 한 수 착 색 비율을 계산 하는 이미지의 캡처 (> 200 셀).</li>
	<li>셀의 총 수를 기준으로 SA β-gal-긍정적인 세포 수를 측정 하 여 SA β-gal 얼룩진 셀의 비율을 계산 합니다. 참고: SA β-gal 얼룩 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반 복제 실험 (그림 1 C)의 결과에. 적절 한 셀 밀도 SA β-gal 얼룩 실험을 위해 중요 하다. 높은 confluency 노화 관련 형태에 변화를 방해 하 고 유도 제어 셀에 긍정 신호 수 있습니다.</li>
</ol>3. 측정 h 조-Ras-유도 노화 중 반응성 산소 종 유도
<ol><li>플레이트 2 x 105 WI-38 세포 60 m m 문화에 요리 하 고 1 단계에서 설명한 대로 h 조-Ras-유도 노화를 자극. 참고:이 프로토콜은 다른 유형의 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.</li>
	<li>표시 된 시간 시점 (2, 4, 또는 6 일), 성장 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀. 0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 셀 수를 결정 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브로 1 x 105 셀을 전송 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>신선한 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-다) 얼룩 미디어 문화 매체 (DCF 다의 작업 농도 50 µ M)의 10 mL를 10mm DCF 다 50 µ L을 추가 하 여 준비 합니다. 참고: DCF 다 빛에 민감한입니다. 빛의 노출은 피해 야 한다. 얼룩 시간과 DCF 다의 농도 세포 유형에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에서 성장 매체를 신중 하 게 제거 하 고 갓된 DCF 다 얼룩 매체의 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부정적인 얼룩 제어로 얼룩진 비 샘플을 포함 합니다. 참고: DCF 다 하지 물 확산 셀 부정적인 제어로 준비 한다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 하 고 그들을 씻어 1 x 1 x PBS의 2 mL. 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend 하 고 적절 한 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 튜브 샘플을 전송.</li>
	<li>
2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-다) 형광 신호 교류 cytometer 갖춘 적절 한 레이저 소스를 사용 하 여 측정 합니다. 블루 레이저 샘플을 자극 (488 nm) 530 ± 30 nm 검출기 (FITC) 로그 눈금을 사용 하 여 내보낸된 형광을 검출 하 고.
	<ol>
<li>먼저 비 스테인드 부정적인 제어 셀을 분석 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)의 점 플롯에서 제어 도구를 사용 하 여 라이브 셀을 선택 하 고 죽은 세포 및 세포 잔해 제거. 참고: 셀 크기 변경 해야 신중 하 게 모니터링 FSC 대 SSC의 도트 음모에. 노화 세포의 크기가 크게 증가 하는 경우에, FSC 대 SSC의 도트 음모에서 게이팅 후 DCF 다 강도 같은 크기의 세포 인구에 비교 한다.</li>
		<li>DCF 다 표시 하는 단일 매개 변수 히스토그램에서 (488 nm) x의 로그 눈금에 형광-축과 y의 선형 눈금에 이벤트 (휴대폰 번호) 수-축에서 피크를 488 nm 레이저의 전압 조정 왼쪽 가장자리-스테인드 셀.</li>
		<li>DCF 다 스테인드 샘플 및 각 샘플에 대 한 기록 이상 10000 이벤트를 분석 합니다. 특정 흐름 cytometer 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 평균 형광 값을 취득 합니다. 참고: 선생님 측정 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균 값이 결과에서 계산 해야 합니다. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 2에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantifying 일리노이-6와 노화 관련 분 비 표현 형 분석을 사용 하 여 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 대 한 IL-8 mRNA 식
<ol><li>
총 RNA 준비
	<ol>
<li>100 m m 문화에 접시 3 x 105 부-38 세포 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM에 요리 하 고 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화를 1 일. 각 시간 지점에 대 한 중복 문화를 준비 합니다.</li>
		<li>H-RasV12 레트로 바이러스 1 단계에서 설명한 대로 셀을 감염에 의해 노화를 유도.</li>
		<li>수확 하기 전에 1 일에서 씻어 셀 2 x 1 x PBS, FBS 없이 DMEM의 3 mL를 추가. 참고:이 단계는 ELISA 단계 5에서에서 설명한 대로 사용 조건된 매체를 생산 하기 위해 실시 됩니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로.</li>
		<li>나중 각 샘플 24 h 조건된 매체를 수집 하 고 ELISA-80 ° C에서 매체 저장.</li>
		<li>0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 단계 5에서에서 설명한 대로 ELISA 결과의 정규화에 대 한 셀 수를 결정 합니다. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수확.</li>
		<li>부드러운 흡입에 의해 매체를 제거 하 고 RNA 추출 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 다음, 소용돌이 15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 s. 그 후, 클로 프롬 및 적극적으로 소용돌이 다시 추가 15에 대 한 혼합물의 200 µ L을 추가 s.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 17000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 그럼, 신중 하 게 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 상단 단계 전송. 참고:은 interphase 및 낮은 유기 단계 한다 교란 되지 새 튜브를 상위 단계의 전송 중.</li>
		<li>소 프로 파 놀 RNA 침전 하 여 부드러운 반전에 의해 잘 그들을 혼합의 400 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어.</li>
		<li>17000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 관을 원심 그런 다음 RNA 펠 릿을 유지 하도록 상쾌한을 삭제 합니다. 75% 에탄올의 1 mL을 추가 하 여 RNA를 세척 하 고 반전 튜브 2-3 배. 17000 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>실 온에서 RNA 펠 릿 건조 하 고 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 50 µ L에서 RNA를 분해-증류수를 취급. RNA의 1 µ L를 사용 하는 분 광 광도 계와 총 RNA 농도 계량. 참고: RNA;의 용 해도 감소 시킬 것 이다 Overdrying 따라서, RNA를 overdrying 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
cDNA 준비
	<ol>
<li>얇은-벽으로 PCR 튜브에 다음을 추가 하 여 각 샘플에 대 한 반전 녹음 방송 반응 혼합물 준비: 총 RNA의 2 µ g (RNase 무료 물으로 10 µ L 볼륨 조정), RT 버퍼, 무작위 뇌관 (50 pmol), 25 x dNTP 믹스 (100의 0.8 µ L의 1 µ L x 10의 2 µ L mM), MMLV 역전사 (50 U / µ L)의 1 µ L와 5.2 µ L의 RNase 무료 물.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 반전 녹음 방송 반응 프로그램 설정: 42 ° C 60 분 동안 95 ° C 5 분 장소는 PCR에 대 한 열 cycler에 시작 프로그램 관.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실시간 중 합 효소 연쇄 반응
	<ol>
<li>모든 반응에 대 한 실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 샘플에 대 한 반응 혼합물은 다음과 같습니다: 실시간 PCR 주인 혼합, 1 µ L 각 6 IL 또는 IL-8에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 및 매우 순수한 증류수 (DNase 및 RNase 프리)의 21 µ L x 2의 25 µ L. 표 1을 참조 하십시오. 참고: 내부 통제로 걸 RNA 뇌관을 포함 하는 각 샘플에 대 한 실시간 PCR 반응 혼합물을 준비 합니다. GAPDH는 정규화에 대 한 내부 컨트롤로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>96-잘 광 정량 접시에 각 잘을 48 µ L 마스터 믹스와 2 µ L의 물으로 3 희석된 cDNA 제품을 추가 합니다. 3 중 각 반응을 수행 합니다. PCR 컨트롤로 cDNA 서식 파일을 포함 하지 않는 컨트롤 잘 준비 합니다.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 실시간 PCR 반응 프로그램 설정: 95 ° C, 40 사이클 of15 s 95 ° c (변성), 그리고 (어 닐 링 및 확장) 60 ° C에서 1 분에서 10 분.</li>
		<li>실시간 PCR을 수행 하 고 PCR 주기 완료 후 임계값 주기 (CT) 값을 기록 합니다. 일리노이-6 또는 IL-8 2-ΔΔCΤ 메서드가20을 사용 하 여 mRNA 레벨을 계산 합니다. 참고 다음 수식을 사용 하 여 말라 수준의 정규화 후 식에 상대 배 변화 결정 됩니다.: 접어 변화 2-Δ (ΔCT)를 = 여기, ΔCT = CT, 일리노이-6 또는 IL-8-CT, 말라; 그리고 Δ (ΔCT) =T, 자극ΔC-ΔCT, 제어.
</li>
		<li>각 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다. 참고: 정량 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반으로 이러한 결과에. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 3에 나와 있습니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 분 비 형 노화 관련 분석 ELISA를 사용 하 여 분 비 하는 일리노이-6와 IL-8 단백질의 레벨 측정
<ol><li>4 단계에서 설명한 대로 재개 조건된 매체의 3 mL 노화 WI-38 셀에서 수확. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거 합니다.</li>
	<li>10 배 조절된 매체를 집중 원심 필터 단위를 사용 하 여 20 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여. 참고: 조절된 매체의 농도 샘플 형식에 반드시 의존 하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>
조건 화 된 매체의 집중된 각 샘플의 50 µ L를 사용 하 여 적절 한 일리노이-6와 IL-8 ELISA 키트와 ELISA를 수행 합니다. 참고: 두 개의 ELISA 우물에 각 샘플을 테스트 합니다. 각 시간 지점 복제 되므로 4 단계에서이 분석 ELISA 분석 결과 샘플 준비 기술 모니터링을 우리가 있습니다.<ol>
<li>ELISA 플레이트 코팅에 대 한 희석 IL 6 또는 1 x PBS 0.5 µ g/mL의 농도를 가진 항 체 IL-8 일리노이-6 또는 0.125 µ g/mL에 대 한 IL-8. ELISA 격판덮개의 각 음에 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 필름을 밀봉 하는 ELISA 플레이트와 플레이트를 봉인 하 고 실 온에서 하룻밤 동요 없이 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x (0.05 %PBS 트윈-20). 각 잘을 블로킹 버퍼 (PBS에 1 %BSA)의 300 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 차단 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 표준 곡선을 생성 하기 위해 순차적으로 희석된 ELISA 희석 버퍼 (0.05% 트윈-20 및 0.1 %BSA PBS)에서 표준을 준비 합니다. 참고: 일리노이-6에 대 한 직렬 희석은 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 및 2000 pg/mL. IL-8에 대 한 직렬 희석 2.34, 4.69, 9.38, 18.75, 37.5, 75, 및 150 pg/mL 이다.</li>
		<li>각 잘을 100 µ L의 표준 솔루션 또는 샘플 솔루션 (µ 집중된 매체 50 L 희석 버퍼의 50 µ L) 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.</li>
		<li>열망 하 여 표준 또는 샘플 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. IL-8에 대 한 IL 6 또는 0.25 µ g/ml 0.1 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼와 탐지 항 체 희석. 잘 당 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 0.05 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 희석. 잘 당 streptavidin HRP 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) 기판 솔루션을 각 영역 100 µ L를 추가 합니다. 색상 개발에 대 한 수 있도록 20 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어. 1 M HCl 정지 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
		<li>450에서 ELISA 리더와 각의 흡 광도 읽고 nm.</li>
		<li>생성 된 표준에 대 한 표준 곡선을 플롯. 표준 곡선에 따라 조건된 중간에 IL 6와 IL-8의 농도 계산 합니다. 세포 수를 정규화 한 후 결과 플롯 합니다. 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다. 참고: ELISAs 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 따라 이러한 결과 (그림 4)에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes &amp; Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+senescence.">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li><li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress.">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li><li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species.">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li><li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells.">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li><li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast.">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li><li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts.">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening.">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li><li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+faces+of+cellular+senescence.">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype:+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li><li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+senescent+cells+in+ageing.">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence.">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li><li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a.">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry.">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li><li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte.">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li><li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence.">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li><li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence,+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16(ink4a).">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li><li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence.">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency.">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders.">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li><li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging.">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li><li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice.">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li><li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li><li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL.">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190 (2016).</li><li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment.">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 노화 동안 세포내 선생님 레벨을 모니터링 하기 위한 방법을 제시. 라이브 세포에서 세포내 선생님 수준 양적 세포 투과 시 DCF 다를 사용 하 여 측정 될 수 있다과 cytometry 합니다. 세포질 통풍 관에 DCF 다 세포내 esterases에 의해 deacetylated 이며, 형성 높은 형광 2', dichlorofluorescein (DCF)-7' 선생님에 의해 연속적으로, 산화. DCF 형광 cytometry...

50 년 이상 전, Hayflick와 무어 헤드 정상 세포 세포 분열1의 특정 번호 후 그들의 증식 잠재력의 고갈에 돌이킬 수 없는 성장 검거 입력 밝혔다. 이 현상은 이제 일차 노화 라고 고 organismal 노화2와 강하게 상관 하기 위하여 믿어진다. Telomeres의 점진적 침식 일차 노화의 주요 원인으로 간주 됩니다, 하지만 DNA 손상, 종양 활성화 및 산화 스트레스 등 다양 한 세포 스트레스 보고 되었습니다 다른 유형의 세포 노화를 유도 "조기 노화" 또는 "-스트레스로 노화" 라고합니다. 흥미롭게도, 조기 노화는 h 조-Ras와 BRAF oncogenes의 활성화에 따라 강력한 종양 진압 역할을 한다. 조직과 인간의 마우스 모델의 연구 생산 biomarkers 세포 노화의 종양 Ras와 BRAF 활성화 하지만에서 개발한 악성 암에 점감 되었다 premalignant 병 변에서 주로 존재 했다 강력한 증거 이러한 병 변3,,45. 노화 및 종양 억제의 역할을 넘어 세포 노화 상처 치유, 조직 복구, 면역 감시, 그리고 배아 개발6을 포함 하 여 다양 한 생리 적 과정에 역할을 이전 연구에 표시 되었습니다.
성장 검거 세포 노화7의 특징으로 광범위 하 게 공부 하고있다, 비록 증거의 중요 한 신체는 세포 반응성 산소 종 (선생님)도 세포 노화8에 기여 나왔다. 세포 노화, 일차 노화 및 노화 (OIS), oncogene 유도 포함 하 여 다양 한 유형의 동안 선생님 수준 상승 수십 년 전 원래 알려졌다9,10. 더 직접, H2O2 의 sublethal 복용량 exogenous 치료 노화11,12유도합니다. SOD1, 같은 선생님 청소 효소의 금지는 또한 조기 노화13발생합니다. 반면, 주변 산소 조건 낮은 선생님 청소 지연 노화10,,1415의 발병을 증가 하 고. 이러한 결과 의심할 여 지 없이 선생님은 중요 한 중재자 또는 세포 노화 유도의 결정 요인 다는 것을 나타냅니다. 그러나, 선생님 세포 노화와 세포 노화 중 선생님 레벨은 상승 하는 어떻게의 유도에 기여 하는 방법 조사 더 필요 합니다.
최근 연구는 노화 세포는 인접 세포와 SASP16,17를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 계시 했다. 세 조직에 노화 세포를 증식 세포의 자치 고갈 뿐만 아니라 SASP 통해 많은 경로 연령 관련 조직 장애를 통해 홍보. 다양 한 proinflammatory 요인, 일리노이-6와 같은 일리노이-8, TGFβ, 그리고 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 노화 세포에 의해 분 비 원인이 조직의 항상성, 조직 구조의 파괴의 장애를 통해 나이 관련 조직 장애 인접 셀과 살 균 염증18,19의 노화. 그러나, SASPs는 생물학 컨텍스트에 따라 유익한 효과 가질 수 있습니다. 또한, SASPs의 heterogenetic 자연 노화 세포 유형과 더 연구19에 대 한 필요성을 강조 셀 단계에 따라 달라 집니다.
여기, OIS 동안 세포내 ROS 수준을 평가 하기 위한, 빠르고 민감한 cytometry 기반 기술을 설명 합니다. 또한, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)와 ELISA를 사용 하 여 SASP 요인의 분석에 대 한 방법은 소개 했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOSC 23</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>wellgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30013.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBabe puro-H-RasV12&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGAG/pol</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSVG</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>8 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>2 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#946; D-galactopyranoside (X-gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>wellgene</td>
			<td>LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCF-DA</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D6883</td>
			<td>10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMLV Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR master 2X mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>PR820A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C118A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 ELISA assay</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>#900-TM16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 ELISA assay</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>#900_TM18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>16555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>BEMIS&#160;</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4ml</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>UFC800324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>BioDrop</td>
			<td>80-3006-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI Prism 7500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EMax microplate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative measurement of reactive oxygen species and senescence-associated secretory phenotype in normal human fibroblasts during oncogene-induced senescence

세포 노화 증식 능력 또는 다양 한 스트레스에 노출의 고갈에 따라 돌이킬 수 없는 성장 검거의 상태를 고려 하고있다. 최근 연구 개발, 상처 치유, 면역 감시 및 연령 관련 조직 장애를 포함 하 여 다양 한 생리 적 프로세스를 세포 노화의 역할을 확대 했습니다. 세포 주기 검거 세포 노화의 중요 한 특징은, 증가 된 세포내 반응 산소 종 (선생님) 생산 또한 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 또한, 최근 연구는 노화 세포 인접 세포와 노화 관련 분 비 형 (SASP)를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 전시 밝혔다. 세포 노화에 대 한 치료 전략에 대 한 관심이 급상승 노화 메커니즘, 세포내 선생님 등은 SASP의 정확한 이해를 위한 필요를 강조 한다. 여기, 우리는 양적 h 조-Ras-유도 세포 노화 선생님-민감한 형광 염료와 cytometry 사용 하 여 동안 세포내 선생님 레벨을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, mRNA 식의 유도 및 SASP 요인의 분 비의 분석을 위한 중요 한 기술을 소개합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.

H 조-Ras-유도 노화의 예는 그림 1에 표시 됩니다. WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포와 H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 유도 극적인 형태 변화 (그림 1B). 또한, 그림 1C에서 같이, SA β-gal 얼룩 활동 H RasV12 식에 따라 현저 하 게 증가 되었다. 셀의 70% 이상 보여준 SA β-gal 활동 6 d H RasV12 레트로 바이러스 감염 후...

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A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

a-quantitative-measurement-reactive-oxygen-species-senescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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비디오: A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) in spermatozoa is of high importance in any species, but these methods are rarely used and even less in teleost. Cryopreservation is a useful technique in aquaculture for different purposes, including gene banking and guaranteed sperm availability throughout the year. Freezing/thawing procedures could cause ROS production and damage the sperm cells. Considering the prospective damage that an excess of ROS production could cause in spermatozoa depending on their localization, here a detailed methodology to detect H2O2 and to evaluate its intracellular localization by confocal microscopy is provided. For this purpose, a combination of 3 fluorochromes (2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), a live mitochondria stain and 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) are used to evaluate the co-localization of H2O2 with spermatozoa nuclei or mitochondria in Solea senegalesis sperm samples.

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

This protocol describes a detailed methodology for detecting H2O2 localization within Solea senegalensis spermatozoa using a sensitive fluorochrome DCFH-DA for ROS, a live mitochondria stain for mitochondria, and DAPI for nuclei visualization, respectively. The protocol is designed to be performed within 2 h with either fresh or thawed spermatozoa.

Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...