세포가 단백질 항상성을 유지하는 방법은 세포 스트레스와 노화의 맥락에서 잘 이해되지 않는다. 이 프로토콜에서 우리는 살아있는 세포에서 단백질 항상성의 핵심 구성 요소 인 단백질 회전율을 계산하는 간단하고 정확한 방법을 제공합니다. Pulse SILAC는 실험자에게 다른 방법보다 생물학적 시스템에 더 확실한 높은 처리량 방식으로 개별 단백질 및 전체 프로테옴에 대한 단백질 회전율을 측정 할 수있는 능력을 제공합니다.
이 방법의 원리는 전체 유기체를 포함하여 대사적으로 표지 될 수있는 모든 시스템에 적용될 수 있습니다. 이 방법은 또한 세포 노화, 노화 및 신경 퇴행성 질환에 대한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 질량 분광법 분석은 세제와 같은 특정 화학 오염 물질에 매우 민감합니다.
이 절차 전반에 걸쳐 LC-MS 등급 시약을 사용하여 고품질 데이터 수집을 보장하십시오. 세포의 대사 표지를 시작하려면, 노화 및 정지 세포의 세 플레이트 각각에 대한 배지를 30 밀리리터의 SILAC 라이트 배지로 교체하십시오. 별도로 세 개의 노년기 플레이트와 세 개의 정동작 플레이트의 매체를 30 밀리리터의 SILAC Heavy로 교체하십시오.
배지를 변경하지 않고 사흘 동안 세포를 성장시킵니다. 배양 플레이트로부터 세포를 분리하기 위해, 미리 가온된 트립신 시약 5밀리리터를 각 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 인큐베이션한다. 나중에, 분리된 세포를 배양에 사용된 동일한 배지의 다섯 밀리리터에 10 밀리리터의 총 부피로 재현탁시킨다.
다음으로, 세포를 얼음으로 옮기고 섭씨 네 도에서 300배 G에서 세포를 원심분리한다. 펠렛을 두 번 세척한 후, 세포를 다시 스핀다운하고, 펠렛을 150 마이크로리터의 갓 제조된 8몰우레아 및 50밀리몰 중탄산암모늄 용해 완충액에 재현탁시키기 전에 상층액을 제거하였다. 튜브의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
단백질 샘플의 분취량 50 마이크로 그램을 새로운 튜브에 넣고 용해 버퍼로 샘플을 동일한 부피로 가져옵니다. 그런 다음 디티오트레이톨을 튜브에 20-밀리몰의 최종 농도로 첨가하고, 진탕하면서 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 실온에서 10분 동안 냉각시키도록 허용한 후 요오도아세트아미드를 최종 농도 40밀리몰로 첨가하고 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 샘플을 50-밀리몰 암모늄 중탄산염 완충액으로 일몰 우레아 이하로 희석한다. 시작 단백질의 50 마이크로그램 또는 1:50 트립신에서 샘플 대 단백질 비율에 대해 트립신 1마이크로그램을 첨가한다. 샘플을 섭씨 37도에서 밤새 진탕 배양하여 단백질을 펩티드로 소화시킨다.
다음날, 단백질 소화를 켄칭하기 위해 샘플의 1 % 부피에 포름산을 첨가하십시오. 샘플 정리를 위해 제조업체의 지침에 따라 각 샘플에 대해 하나의 추출 카트리지를 사용하여 진공 매니폴드에 고체상 추출 카트리지를 놓습니다. 추출 후, 펩티드 샘플을 진공 매니폴드로부터 제거하고, 이를 진공 농축기에서 완전히 건조시킨다.
건조에는 약 세 시간이 걸립니다. 질량 분광법 또는 MS 분석을 위해, 펩티드 샘플을 마이크로리터 당 400 나노그램의 농도로 0.2%포름산 완충액에 재현탁시킨다. 펩티드를 재가용화시키려면, 샘플을 다섯 분 동안 혼합한다.
그런 다음 수조 초음파 처리기에서 다섯 분 동안 초음파 처리하십시오. 이어서, 샘플을 원심분리하여 불용성 물질을 펠릿화하고, 펩티드 상청액을 MS 바이알 내로 옮긴다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 또는 LC-MS-MS를 사용하여 프로테오믹 분석을 위해 샘플을 제출한다.
질량 분광법 시설에 의한 비표적 분석에 권장되는 설정을 사용합니다. 샘플을 분당 400 나노리터의 유속으로 분석 컬럼에 로딩하여 유기 및 무기 용매의 혼합물을 사용하여 90분 선형 구배에 걸쳐 펩티드를 용출시키고, 유기 용매는 5 ~ 35%범위의 질량 분광법 데이터를 수집하고, MS1 조사 스캔의 연속 사이클과 HCD 단편화를 통한 20개의 데이터 의존적 MS2 스캔을 통해 데이터 의존적 MS2 스캔을 획득한다. Proteome Quantitation 소프트웨어 도구에서 무겁고 가벼운 펩티드에 대한 펩티드 피크 영역을 정량화하십시오.
이어서, 무겁고 가벼운 펩티드 피크 영역을 내보낸다. 단백질 반감기를 계산하려면 SILAC 분석 통합 문서를 Raw Data라는 첫 번째 시트에 열고 UniProt ID, 유전자 이름, 무겁고 가벼운 피크 영역을 표시된 열에 붙여 넣습니다. 그런 다음 Analysis라는 네 번째 시트를 열고 G 열과 H 열이 표본이 범위를 벗어났음을 나타내는 행을 제거하고 범위 내에서 읽은 행을 유지합니다.
노화 표현형을 노화 관련 베타-갈락토시다제 활성 및 RT-qPCR 분석을 사용하여 검증하였다. 베타-갈락토시다제 활성의 경우, 노화 세포는 파란색으로 나타난 반면, 정지 대조군 세포는 전혀 또는 최소의 색을 가졌다. RT-qPCR 분석에서, 노화 세포는 정지 세포에 비해 더 높은 인터루킨-6, CXCL8 및 CDKN1A-P21 mRNA를 나타냈다.
반대로, 증식 마커에 대한 라민 B1 인코딩의 수준은 노인성 세포에서 낮거나 결석하였다. 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램은 무겁고 가벼운 펩티드 신호의 상대적 비율을 밝혀냈다. 경노화 세포에 비해 무거운 펩티드 신호의 낮은 비율은 더 느린 단백질 턴오버 속도를 나타냈고, 빛에 비해 더 높은 무거운 펩티드 신호는 더 빠른 단백질 턴오버 속도를 나타냈다.
표지되지 않은 샘플은 무거운 펩티드 시그널을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 질량 분광분석으로부터 확인된 695개의 단백질에 대한 반감기가 계산되었다. 반감기는 정지 세포에 대한 노화의 로그 두 비율로보고되고 화산 플롯에 플롯됩니다.
노화 세포에서 단백질 턴오버 속도의 계산에 이어서, 하류 분석은 프로테오스타시스 메카니즘에 의해 조절되는 후보 생물학적 경로를 밝혀낼 수 있다. Pulse SILAC는 연구자들이 전례 없는 세분성과 처리량으로 단백질 역학을 연구할 수 있는 길을 열었으며, 이를 통해 우리는 많은 개별 단백질에서 단백질 항상성의 변화를 연구할 수 있었습니다.
