우리는 FCP 정화에 모이 라 Adeel 아마 드 감사합니다. 교수 클 Büchel 유용한 토론에 대 한 인정은 원고를 읽고. 이 작품은 LD (DI1956-1/1)에 독일 연구 재단 및 LD. Feodor Lynen 친교의 훔볼트 재단에 의해 지원 되었다

참고: FCPs 등 광합성 단지는 빛과 열에 매우 취약 합니다. 항상 얼음에 및 아주 희미 한 불빛 아래에서 작동 합니다.
1입니다. 셀에서 FCP의 격리
<ol><li>
C. meneghiniana 세포에서 Thylakoid 격리
	<ol>
<li>C. meneghiniana 각 ASP 매체23,25 및 50 백만 셀의 300 mL 가득 5 500 mL 플라스 크에 성장. 면 마 개와 함께 플라스 크를 연결 하 고 빛 16 h 120 rpm에서 통에 약 1 주일에 대 한 지 수 성장 단계 및 8 h 40 µmol photons/(m²s) 흰 빛에서 어두운 단계 15-18 ° C. 사이의 온도에 성장 하는 세포 수 셀 카운터 챔버와 1.5-2 백만 셀/mL 사이 휴대폰 번호 인지 확인 합니다.</li>
		<li>고속 원심 분리기에 15 분 동안 500 mL 원심 분리기 튜브 (4 ° C)와 precooled로 터에서 4000 x g 에서 셀 원심 다시 pipetting으로 균질 버퍼 (HB, 표 1)의 12 mL에서 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.<ol>
<li>단일 50ml 플라스틱 튜브에 정지를 전송. -80 ° C에서 샘플을 저장 하거나 1.1.3 단계를 진행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>전 멋진 비드 밀 및 장비. 유리 비드 혼합물으로 75% 비드 밀의 50 mL 비 커를 세포 현 탁 액 추가. 세포 파쇄, 최고 속도로 30 7 x 45의 펄스 사용 각 맥 박 사이 냉각의 s. 1.1.6 단계에서의 품질 검사에 대 한 방해 셀 20 µ L를 가져가 라.</li>
		<li>그들은 분명히 표시 때까지 유리 구슬에는 HB를 붓는 의해 유리 필터 퍼 널 및 세척 방해 세포를 필터링 합니다. 여과 액으로 씻어 분수 풀입니다. 150 mL 보다 낮은 최종 볼륨을 유지.</li>
		<li>140 x g 3 50 mL 플라스틱 튜브를 사용 하 여 작은 세포 파편을 15 분에 대 한 샘플 원심 신중 하 게 20 mL 폴 리카 보 네이트 ultracentrifugation 튜브에는 상쾌한 전송 및 삭제는 펠 릿.<ol>
<li>HB와 튜브를 작성 하 고 무게를 equilibrate 300000 x g 와 펠 렛의 thylakoid 막에 4 ° C에서 1 시간에 대 한 적합 한 회전자에 원심.</li>
		</ol>
</li>
		<li>원심 분리 시간을 사용 하 여 1.1.3에 20 µ L 샘플 400 배 확대에 현미경에 의해 방해 셀의 비율을 확인. 엽록체를 무료 고 frustules (실리 카 포탄)를 포함 하는 엽록체 사이의 비율을 계산 합니다. 참고: 규조류 세포 벽 높게 현미경에서 물질을 diffracting로 표시 되는 실리 카의 만들어집니다. 엽록체를 녹색 점 발생 한다 발표 되었습니다 셀에서 셀 중단 했다면.</li>
		<li>다시 가능한 작은 세척 버퍼와 막 펠 릿을 일시 중단 (0.5-1 mL) 작은 페인 터의 브러시를 사용 하 여. 폴 리 카보 네이트 ultracentrifugation 튜브 버퍼 (표 1) 세척 하는 것을 채워, 그들의 무게와 200000 x g 와 4 ° C에서 20 분 동안 원심 분리기 equilibrate<ol>
<li>다시는 페인 터의 브러시 세척된 막 일시 중단 합니다. 가능 한 한 높은 thylakoid 농도 유지 하는 데 필요한 경우에 세척 버퍼를 추가 합니다. 하나의 샘플 유리병 (15 mL)에 모든 thylakoids 풀.</li>
		</ol>
</li>
		<li>미리 100% 아세톤의 90 µ L와 10 µ L의 샘플을 사용 하 여 샘플을 희석. 침전 된 단백질 pellet을 5 분 동안 12000 x g 에서 원심. predilution의 10 µ L 고 990 µ L 90% 아세톤의 혼합.<ol>
<li>엽록소 a와 c 664에서의 흡 광도 (ABS) 측정 및 630 nm에서 90% 아세톤. ABS750nm 두 값에서 뺍니다. 다음 수식을 사용 하 여 총 엽록소 콘텐츠 결정:24 1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq1.jpg"> 2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq2.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>1.5 mL 반응 관에서 총 엽록소의 0.5 mg의 부분에서 aliquot thylakoids 액체 질소에서 그들을 멈추게 하 고 추가 사용까지-80 ° C에서 그들을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분리 및 FCP 복합물의 농도
	<ol>
<li>자당 그라데이션 솔루션을 준비 하 고 ultracentrifuge 튜브 로딩 볼륨 (300-500 µ L) 마이너스 상단까지 작성. 그들은 완전히 고정 될 때까지-20 ° C에서 튜브를 고정 합니다. 튜브는 17 mL 튜브에 대 한 3-4 h + 4 ° C에서 녹여 수 있습니다.<ol>
<li>두 번을 더 나은 해상도 대 한 그라데이션 수정 동결-해 동 주기를 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1.1.9 엽록소의 0.5 밀리 그램에 해당에서 얻은 샘플을 사용 하 고 버퍼 B1 조정 (표 1) 2 mL의 최종 볼륨을. 가용 화, 20 m m의 최종 농도에 n-라우릴-β-D-maltopyranoside (b-DDM)를 추가 합니다.<ol>
<li>반전 튜브 3 번 하 고 부드러운 거품을 피하기 위해 동요와 20 분 동안 얼음에 그것을 배치. 12000 x g + 4 ° c.에 미리 냉각된 테이블 상단 원심 분리기에서 5 분 동안 원심 분리기</li>
		</ol>
</li>
		<li>그라데이션에 상쾌한을 로드 합니다. 17 mL 튜브 사용 하는 경우에 그라데이션 당 총 엽록소의 이상의 125 µ g를 로드 하지 마십시오. 22 h g 와 + 4 ° C x 100, 000에 대 한 원심 분리기<ol>
<li>주사기 (그림 2A)를 사용 하 여 그라데이션에서 원하는 갈색 FCP 분수를 복구 합니다. 5 µ L aliquot 고 B1a의 995 µ L로 희석.</li>
		</ol>
</li>
		<li>UV-VI-분 광 광도 계에 370-750 nm 사이의 흡 광도 (ABS) 스펙트럼을 측정 합니다. 세미 마이크로 광학 유리 큐 벳을 사용 합니다.<ol>
<li>스펙트럼 관리자 소프트웨어, 열고, 스펙트럼 모드에가 서 750 370에서 기준 기록 nm 다음 샘플 측정. 다음 설정을 사용 하 여: 스캔 속도, 200 nm/분; 데이터 피치, 0.5 nm; 응답, 중간입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>micropipette와 복구 된 샘플의 볼륨을 측정 합니다. B1 버퍼 (표 1) 두번 복구 된 볼륨을 추가 하 여 FCP 복합물을 세척. 1000 x g 및 적어도 20의 ABS672nm 에 4 ° C에서 컷오프 30 kDa 막 집중 장치에 집중 한다. 참고: B-DDM 농도 micelle 농축 샘플 칸에 인해 상승 수 있습니다. 이 FCP 단지의 추가 가용 화 이어질 수 있습니다! 세제 사용 가능한 버퍼 B1 추가 단계를 세척 하는 경우 잔여 자당을 제거 하는 데 필요한 추가-가용 화를 하지 마십시오.</li>
		<li>20 µ L aliquot 컨트롤에 대 한 가져가 라. 액체 질소에는 샘플을 동결 충격과-80 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig2.jpg"> 그림 2: FCP, 광 제어 및 순도 확인의 정화. (A) 하룻밤 원심 분리 후 자당 농도 기온 변화도의 전형적인 모습 FCPa 및 FCPb. pigm. 구성 된 FCP 수영장을 포함 하는 모든 갈색 밴드-언바운드 안료, PS-(파란 선) 전에 FCP의 photosystems (B) 흡 광도 스펙트럼 (오렌지-점선) 농도 30 kDa 컷오프와 원심 필터 장치를 사용 하 여 후 . 특히, 카로 티 노이 드 500-550 nm 사이 지역에서 낮은 흡 광도 착될 FCP에서 손실 경향이 있다. 그래프는 최대 ~ 670에서 엽록소 Qy 으로 정규화 nm. Chl c의 여기 (C) 엽록소 a 방출 스펙트럼 (465 nm) 기능 여기 에너지 전송 테스트. Chl chl c의 에너지 전송 하는 경우는, 방해 ~ 640에서 추가 형광 밴드 nm (chl c) 발생. 그래프는 최대 방출에 정규화 됩니다. (D) 여기 스펙트럼 기록 675 chl 에너지 전송 테스트 nm (chl 최대 형광)는 모든 안료 370 사이 흡수에서 nm와 600 nm. Chl에 에너지를 전송 하는 경우는 비효율적, 형광 항복 465와 550 nm 사이 특히 감소 것입니다. 그래프는 최대 약 440으로 정규화 nm. 스펙트럼 (b), (C)와 (D) 농도 잘 작동 하는 경우 거의 같습니다. (E) 28트리 스 tricine 젤 사용 하 여 격리 된 FCP의 순도를 확인 합니다. FCPa 및 FCPb 18-19 kDa 사이의 소 단위 있다. 모든 보이는 실버 스테인드 단백질 20 kDa 보다 큰은 오염 물질입니다. Thyl입니다. -Thylakoids <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"><li>
분 광 및 젤 기반 컨트롤
	<ol>
<li>1.2.5 단계 후 B1a의 995 µ L에서 FCP의 5 µ L의 370-750 nm 사이의 흡 광도 기록 합니다. 1.2.4 단계에서 얻은 스펙트럼과 그것을 비교 합니다. 같은 계측 및 단계 1.2.4에서에서 설명한 대로 설정을 사용 합니다.<ol>
<li>*.Csv로 데이터를 내보내기 하 고 스프레드시트에 데이터를 가져옵니다. Chl 최대 두 스펙트럼을 정규화는 약 672의 Qy 밴드에 nm 그림 2B에서 같이.</li>
		</ol>
</li>
		<li>0.03의 원하는 ABS672nm 에 의해 측정 된 ABS672nm 를 분할 하 여 단계 1.2.4와 1.3.1에서에서 샘플의 희석 비율을 계산 합니다. 그에 따라 샘플을 희석 B1a와 특별 한 유리 형광 큐 벳에 그들을 전송.</li>
		<li>Chl chl (그림 2C) chl c에서 그대로 빛 에너지 이전을 spectrofluorometer로 형광 방출 스펙트럼을 기록 합니다.<ol>
<li>분석기 소프트웨어를 사용 하 고 다음 설정 사용 하 여 스펙트럼 측정 모드에가 서: 모드, 방출; 슬릿 폭 여기 및 방출, 3 nm; 감도, 중간; 스캔 속도, 100 nm/분; 데이터 피치, 0.5 nm; 여기 파장, 465 nm; 방출, 600-800 nm입니다. 오토 및 측정을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>동일한 샘플 및 공개 chl 모든 안료에서 그대로 에너지 전송 장비와 여기 스펙트럼 (그림 2D) 기록 합니다. 설정을 변경: 모드, 여기; 방출 파장, 675 nm; 여기, 370-600 nm 스펙트럼을 기록 합니다.<ol>
<li>Rhodamine 스펙트럼 램프- cf의 스펙트럼 속성에 대 한 동일한 범위에 수정 합니다. 사용자 설명서에 지시입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>믹스 FCP 샘플 해당 chl의 1 µ g 하는 SDS 로딩 버퍼의 10 µ L로. 25 ° c.에서 10 분 동안 품 어 탁상용 원심 분리기에서 12000 x g에 5 분 동안 원심 분리기.<ol>
<li>트리 스 tricine 젤28에 상쾌한 로드. 150 V에 2 시간에 대 한 별도 고 실버-분리40후 그것은 얼룩. 참고: FCP subunits FCPa 및 FCPb29 (그림 2E) 지역구는 18-19 kDa 사이의 두 저명한 단백질 대역으로 구분 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 리 및 FCP의 설립의 준비
<ol><li>
지질 혼합 및 지질 세제 micelles 준비 참고: 지질 산화 조건와 결합 하는 온도 따뜻하게 받습니다. 냉장 및 N2 분위기에서 지질을 유지 하려고 합니다.<ol>
<li>Vieler 외. 200730에 따르면 C. meneghiniana 에 대 한 원하는 thylakoid 지질 비율을 계산 합니다. Supplemental 표 1에 주어진 예제를 참조 하십시오. 지질 용 매 증거 컨테이너에서 제조업체에서 권장 하는 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>원하는 양의 2 mL 반응 관에 지질 플라스틱 부드러운 질소 흐름을 사용 하 여 클로 프롬을 증발 고 지질 관 자료의 전체 영역에 걸쳐 하려고 합니다. 모든 용 매 증발 될 때까지 N2 흐름을 보자.</li>
		<li>4 헤 품 30 ° c.에서 10 분 동안 지질 혼합 4 ° C에서 29 µ L n octyl β-D-glucopyranoside 솔루션 (OG)의 지질 혼합물을 solubilize 30에 의해 중단 하는 25 ° C에서 3 x 3 분 sonicator 목욕에 지질을 품 어 얼음에 s.<ol>
<li>Tricine 버퍼의 221 µ L 4 x 투 버퍼의 250 µ L를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>0.1 µ m 폴 리 카보 네이트 멤브레인과는 압출 기를 사용 하 여 정의 된 liposome 직경 50-70 nm의에 대 한. 멤브레인 및 필터 지원으로 압출 조립. 공기 거품을 방지 하 고 어셈블리를 철저 하 게 조입니다.</li>
		<li>4 x 투 버퍼 한 주사기와 없는 거품 두 번째 주사기에서 볼 수 있습니다 때까지 미리 압출 기를 젖은.</li>
		<li>압출 기에 지질 세제 micelles을 적용 하 고 다른 한 주사기에서 솔루션 앞 누르고 다시. 솔루션 동종 나타날 때까지 5 번이이 단계를 반복 합니다. 참고: 이 솔루션은 4 ° C에서 며칠 동안 저장할 수 있습니다. 꼼짝 하지 마십시오!</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FCP 단지 및 세제 및 집계의 제거의 참고: 우리는 지질/chl 12: 1의 비율을 사용 하 여이 예제에는 약 100: 1의 지질/단백질 비율에 해당 합니다.<ol>
<li>FCP chl의 20 µ g 크거나 추가 500 µ L 250 μL 압출된 지질 micelles의 B1a 버퍼의 고 투 버퍼 x 4의 250 µ L의 총 볼륨에. 얼음에 30 s 일시 중지에 의해 중단 하는 1500-3000 rpm에서 thermomixer에 25 ° C에서 3 x 3 분 샘플을 품 어.</li>
		<li>여전히 뚜껑에 맞는 반지를 주는 상단 바로 아래 4 개의 1.5 mL 반응 관의 뚜껑을 잘라. 투 석 막의 1.5 c m x 1.5 c m 조각 준비 및 1 x 투 버퍼의 20 mL에 그들을 씻어합니다</li>
		<li>각 뚜껑을 샘플의 250 µ L을 입력 합니다. 구획 완전히 채워집니다 샘플 없음 기포 발생, 신중 하 게 뚜껑에 막을 하다. 닫힌 구획이 하려면 어셈블리에 반응 튜브 반지를 조입니다.</li>
		<li>넘어지는 셰이 커에 얼음에 하룻밤 투 버퍼 x 1의 50 ml (12-16 h) 샘플을 dialyze. 신선한 것으로 사용 된 투 석 버퍼를 교체 하 고 적어도 6 h에 대 한 남은 세제를 제거 하려면 adsorbent 구슬의 7 mg을 추가 합니다.</li>
		<li>다시 투 석 버퍼를 교체 하 고 dialyze 다른 12 헤 200 µ L micropipette 팁 투 석 막 피어 싱으로 리 복구에 대 한 반응 관 뚜껑에서 모든 리 발음.</li>
		<li>선택적 단계: 경우 고 순도 (> 95%)이 필요. 투 석 버퍼에 6%, 10%, 15%와 20% 자당 epichlorhydrin 공중 합체를 포함 하는 단계 17 mL에 불연속 밀도 그라데이션 ultracentrifugation 튜브를 준비 합니다. 상단과 4 h 진동 물통 회전자에 대 한 100000 x g에서 ultracentrifuge에 리를 로드 합니다.<ol>
<li>주사기와 위 갈색 밴드를 복구, DP와 샘플 1: 5을 희석 하 고 단계로 진행.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 x 1.5 h g와 4 ° C x 100, 000에 대 한 투 석 버퍼의 최소 2 ml에서 FCP 리 원심 45 °의 각도에서 원심 분리기 관으로는 리를 복구 합니다. 1 분 (그림 3A) 이동 리를 허용 합니다.</li>
		<li>25-50 µ L.의 최종 볼륨에서 FCP 리 침전을 방해 하지 않도록 복구할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
컨트롤 1: 흡 광도, 형광 분광학
	<ol>
<li>1 투 석 버퍼 및 12000 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL 최종 볼륨 FCP-리의 3 µ L 약 수를 추가 합니다.<ol>
<li>1.2.4에 설명 된 대로 동일한 장비와 FCP 리 370 및 750 nm 사이의 흡 광도 기록 합니다. Chl (670-680 nm)의 Qy 지역에서 최대 스펙트럼을 정상화 하 고 solubilized FCP (그림 3C)의 정규화 된 스펙트럼을 비교 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>흡 광도 (ABS)와 DP의 1 mL에서 준비 하는 FCP 리 670-680 nm 사이 최대 기준 0.03 =. Diluting B1a와 같은 abs 단계 1.2.6에서에서 세제에서 solubilized FCP를 조정 합니다.</li>
		<li>1.2.4에 설명 된 대로 두 샘플의 흡 광도 스펙트럼을 기록 합니다. 1.3.3에서 설명 된 대로 두 샘플의 형광 방출 스펙트럼 chl를 기록 합니다. 참고: FCP liposome 샘플 (그림 3D 및 cf. 토론.)에 형광 수확량 감소</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig3.jpg"> 그림 3: 격리 FCP proteoliposomes의 뒤에 광 컨트롤과 confocal 영상. (A) 원심 분리 후 FCP 리의 복구. 45 °를 원심 분리 관을 돌려 약 1 분을 기다립니다-에 리는 FCP 집계는 리 스틱 튜브 벽에 통합 되지는 반면 아래로 이동 합니다. (B) 세제 (파란색)에서 solubilized FCP와 리 (오렌지)에서 FCP의 흡 광도 스펙트럼의 비교 (C) (B)와 같이 동일한 스펙트럼 정규화 chl 빨간 지역에서 최대 (~ 670 nm-Qy 피크); 세제 (파란색)에서 solubilized FCP와 리 (오렌지)에서 FCP. 잠재적으로, 될 수 있다 주로 카로 티 노이 드의 색소 손실 볼 수 500-550 nm 지역에서. FCP는 리에의 클러스터링 및 이어질 수 있습니다 피크 확대는 chl의 약간의 변화는 최대 (~ 670 nm)는 빨간색. (D) 세제에서 solubilized FCP와 liposome에서 FCP의 방출 스펙트럼. FCP는 liposome에서의 클러스터링 FCP 단지는 형광 수율 (오렌지색 곡선)을 절감 하 고 방출 맥시 마 약간 빨간색의 활기찬 상호 작용을 향상 시킵니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

저자는 공개 없다.

천연 지질 성분과 FCP 리 광 속성을 조사 하 편리한, 간단 하 고 재현 가능한 도구를 제공 생체 외에서. FCP 리에서 지질 환경 자연 조건에 가까이 있는 실험 결과를 야 기한 thylakoid 막 내 상황을 유사 합니다.
C. meneghiniana 를 사용 하 여 FCP 안테나를 모델 시스템으로 서의 몇 가지 이점이 있다. 그것은 비교적 빨리 성장 하 고 다른 규조류 모델 종, 예를 들어, Thalassi...

규조류 등 광합성 유기 체 조명 조건 변화에 대처 하 고 정교한 새 환경 순응 메커니즘을 높은 광합성 효율을 유지 하 고 과도 한 빛에 의해 발생 하는 사진 산화 손상에서 보호로 응답 해야 합니다. 광합성 진핵생물에서 주요 빛 보호 프로세스는 높은 에너지 냉각 (E)의 q 가벼운 스트레스 조건1,2 비 광화학 냉각 (NPQ)에 주요 기여로 발생 하는 빛을 흡수 ,3. 광 수확 안테나 복합물 (LHC) 여기 에너지 이동 통로의 규칙에서 포함 된다. 높은 빛에 대 한 응답에 낮은 pH 상태 냉각 상태를 수확 하는 빛에서 안테나 시스템 전환 엽록체 루멘에서 유도. 이 에너지 되는 낭비 적인 상태 photosystems (PS) 및 thylakoid 막에서 다른 단지 사진 산화에서 보호합니다. 광합성 진핵생물에서 qE 는 일반적으로 두 가지 요인1,,23에 의해 유발 됩니다. 한 요인은 낮은 pH에 반응 하는 단백질을 수확 하는 특수 빛 이다. PsbS 단백질 높은 식물4q전자 유도합니다. LhcSRs5, PsbS 활동에 의해 변조 녹색 조류6q전자 유도. 규조류는 LHCSRs7,8,,910와 구조적으로 관련 된 Lhcx 같은 단백질을가지고 있다.
QE 의 두 번째 요소는 안테나의 카로 티 노이 드 드 epoxidation에 의해 사진 보호 형식으로 변환 하 고 epoxidation에 의해 복귀 빠진 주기입니다. 식물과 녹 조류, violaxanthin 제 아 잔 틴으로 변환 됩니다. 규조류에 diadinoxanthin 다음 NPQ11의 범위와 상관 한다 diatoxanthin로 변환 됩니다. 안테나를 수확 하는 규조류 빛 비록 그것이 진화 식물 및 조류 LHCs와 관련 된 몇 가지 특성을 소유한 다. 사진 보호에 수확 하는 빛에서 스위치 엄청나게 빠른 이며 NPQ 용량 높은 식물12비교. 하나의 이유는 규조류 매우 성공적인 그들은 해양 순 주 생산13의 45%를 담당 하는 방식에서 다른 생태 틈새에서 수 있습니다. 따라서, 규조류 수확 시스템 빛은 광합성 연구의 흥미로운 개체입니다.
규조류, 중심 종 Cyclotella meneghiniana thylakoid 본질적인 빛 수확 하는 그들은 안료 후 명명 된 시스템을가지고 같은 바인딩-fucoxanthin, 엽록소 (chl) a와 c, 그러므로 FCP. 빛 수확 하는 단백질, FCPs, 등 몇몇 막 층으로 구성 된 thylakoid 막 시스템에 포함 된. 규조류는 3 thylakoids의 악대를 형성 한다. 이 복잡 한 상황 어려운 thylakoid 막에 있는 분자 수준에 그들을 공부 하. 또한, 많은 구성 요소 (위 참조)를 수확 하는 빛의 조절에 기여 한다. 따라서, 많은 접근에는 단지 n-라우릴-β-D-maltopyranoside (β-DDM), 막 solubilize 하지만 FCP 단지 그대로 유지 같은 가벼운 세제를 사용 하 여 막에서 분리 했다. 많은 분 광 연구 조사 intramolecular 에너지 전송14,15,,1617solubilized FCP를 사용 하 여 수행 했다. 그러나, 전 이렇게는 에너지 전송 규칙 다른 안테나 단지 또는 photosystems와 excitonic의 상호 작용을 필요로 하기 때문에 제한 되었다. 따라서, 이러한 종류의 연구 수 없습니다 실시 solubilized 단지와 단지 사이 상호 작용은 손실 때문에.
안테나 규칙에 있는 중요 한 기능 안테나와 thylakoid 막18에 photosystems의 "분자 크롤 링"입니다. 이 효과 시뮬레이션 하는 간단한 접근 방식을 실시 되었다 이전, 생체 외에서. 세제, 안테나 복합물의 임의의 집합에 이르게 제거 되었습니다. 합리적인 데이터가 접근17,19에 의해 얻은, 비록 세제 제거 vivo에서 상황을 반영 하지 않는 하 고는 단지 하지 그들의 일반 차에 상호 작용 하는 때문에 몇 가지 한계가 구조입니다.
리를 사용 하 여 여러 전 한계 극복. 3 차 구조는 여전히 완벽 하 게 그대로. Liposome 막 안테나 단지에 대 한 준 네이티브 환경을 제공합니다. 막 외부 환경에서 있는 liposome의 내부를 분리합니다. 이러한 방법으로 리 이온과 pH 기온 변화도의 또한 전송 프로세스에 관해서는 연구에 대 한 두 가지 반응 구획을 제공합니다. 또한, 실험 시스템의 매개 변수는 thylakoid 막에서 연구에 대 한 더 쉽게 제어할 수 있습니다. 리 이미 광합성 단지 공부 하는 훌륭한 도구를 보였다. 과거에 주요 초점 식물 LHC 변경 된 지질 구성의 효과 LHC II20에 테스트 되었습니다 했다. 다른 접근 방식에서 다른 LHC II 단백질-단백질 상호작용 조사21를 했다. 또한, 일부 연구 녹색 조류에 실행 되었다 LHC22사이 자발적인 클러스터링을 설명 하는. 수생 생태계에 대 한 규조류의 중요성을 고려 하면 상대적으로 적은 연구 규조류의 안테나 단지 수행 했다. 두 연구 조사 어디 표시 했다 전기 화학 기온 변화도24 FCP 안테나23 FCP의 응답성의 클러스터링 중심 Cyclotella meneghiniana 의 안테나 복합물. 따라서, 리 공부 규조류 안테나 및 그들의 상호 작용 및 거의 기본 조건에서 규정 하는 훌륭한 도구입니다. 리 지질 구성, liposome 크기, 단백질 밀도 많은 조건 이후 다목적 이며 주변 수성 단계를 제어할 수 있습니다. 또한, 메서드는 낮은 양의 샘플 필요합니다. 실험 시스템은 강력 하 고 매우 재현. 리의 서 산도 공부 가능 하며 안테나 복합물의 규칙에 있는 이온 기온 변화도 중요 한 요인.
여기, 우리 C. meneghiniana 에서 FCP 안테나 복합물의 격리와 자연 thylakoid 지질 성분과 리에 그들의 설립을 설명합니다. 또한, 우리 solubilized FCP의 분 광 특성에 대 한 모범 데이터를 제공 하 고 리에서 FCP와 그들을 비교. 메서드 요약 지식 및 Gundermann 및 Büchel 201223, 나탈리 외. 201622, 그리고 아마 드와 Dietzel 201724의 개선에서 얻은 표준된 프로토콜.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> 그림 1: 워크플로 도식 표현. (1) 세포 성장, 중단 및 자당 밀도 기울기;에 FCP 분리를 따르는 thylakoid 절연 설명 단락 1 참조 C. m. -Cyclotella meneghiniana 세포. 2와 octylglycoside (OG)와 지질 세제 micelles의 창조 (2) 자연 thylakoid 지질 혼합물 (MGDG, DGDG 및 SQDG)의 준비 절에서 설명합니다. 정의 된 지질-micelle 크기 정의 기 공 직경의 막을 사용 하 여 압출 함으로써 이루어집니다. FCP 및 지질 micelles 미리 정의 된 지질에서 통합: 단백질 비율과 OG 및 β-DDM 세제는 제거를 통해 제어 투 FCP proteoliposomes를 형성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill VI 2</td>
			<td>Edmund-B&#252;hler (edmund-buehler.de)</td>
			<td></td>
			<td>newer version: Vibrogen-Zellm&#252;hle Vl 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 400 &#181;m</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>5223-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td>
			<td>Sigmund-Lindner.com</td>
			<td>4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitraPOR filter funnel - por1</td>
			<td>ROBU GmbH</td>
			<td>21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>314348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor T 865</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>51411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td>
			<td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td>
			<td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td>
			<td>51428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>&#34;6040-10-10&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>V-630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor AH629-17-mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td>
			<td>54285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>4307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biometra Minigel-Twin</td>
			<td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td>
			<td>846-010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td>
			<td>1610449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>libre office spread sheet</td>
			<td>The document foundation</td>
			<td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td>
			<td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td>
			<td>101-10-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td>
			<td>Jasco (jasco.de)</td>
			<td>FP-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-loading buffer Roti-Load</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>ANATRACE (anatrace.com)</td>
			<td>O311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1300</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1310</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>59-1230</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td>
			<td>Larodan AB (larodan.com)</td>
			<td>37-0150</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P3782 SIGMA</td>
			<td>make stock solution in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator bath S-50TH</td>
			<td>Sonicor (getmedonline.com</td>
			<td>SONICOR-S-50TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuleopore polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td>
			<td>ROTH (carlroth.com)</td>
			<td>0653.1</td>
			<td>boil in destilled water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads SM2 Adsorbent</td>
			<td>Biorad (Bio-rad.com)</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td>
			<td>Beranek Laborger&#228;te (Laborgeraete-beranek.de)</td>
			<td>252150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TFT 80.4</td>
			<td>Millipore (merckmillipore.com)</td>
			<td>54356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>material listed in order of appearance </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard lab material and substances are not listed.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

식물, 조류와 규조류의 광합성 성능을 강력 하 게에 따라 다릅니다 빛 수확과 에너지의 신속 하 고 효율적인 규제 엽록체의 thylakoid 막에서 전송 프로세스. 규조류의 안테나를 수확 하는 빛, 이른바 fucoxanthin 엽록소 a/c 바인딩 단백질 (FCP), 빛 흡수를 위한 요구 되 고 광합성 반응에 효율적인 전송 센터 뿐만 아니라 과도 한 빛에서 사진 보호에 관해서는. 이 두 함수 사이의 스위치 연구의 오랜 문제 이다. 이러한 연구의 대부분을 실시 되었습니다 FCP와 세제 micelles에. 상호 작용 연구에 대 한 세제 제거 되었습니다, FCP 단지의 불특정 집계를 주도. 이 방법에서는, 유물과 순수 관련 데이터를 구분 하기 어렵다. 따라서, 만약 그들이 그들의 네이티브 지질 환경에 포함 된 단백질-단백질 상호 작용, 에너지 전송 및 기타 광 기능을 공부 하 여 FCP 및 단지 수확 다른 바인딩된 막 빛에 대 한 더 유용한 정보를 얻을 수 있습니다. 주요 장점은 리는 정의 된 크기와는 FCP 클러스터링의 범위 제어는 정의 된 지질/단백질 비율. 또한, vivo에서 수확 하는 빛을 조절 하는 pH와 이온 구성에서 변경 쉽게 시뮬레이션할 수 있습니다. Thylakoid 막에 비해는 리 있습니다 더 균일 하 고 덜 복잡 한 분 광 데이터 이해를 쉽게 하. 프로토콜의 FCP 격리 및 정화, liposome 준비, 그리고 천연 지질 성분과 리도 FCP의 설립 절차를 설명합니다. 일반적인 응용 프로그램에서 결과 주어진 고 설명.

프로토콜에는 Cyclotella meneghiniana 에서 총 FCP 분수의 고립과 네이티브 지질 성분과 리를 설명합니다. Thylakoid 격리는 높은 재현 하지만 thylakoid 수율 변경 될 수 있습니다. 결과 모든 안료의 50% 이상 단계 1.1.4에에서 복구 하는 경우 허용 됩니다. 80% 이상이 최적입니다.
thylakoids의 가용 화는 중요 한 단계입니다. 잘 solubilized ?...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

여기, 선물이 fucoxanthin 엽록소 a/c 바인딩 단백질 (FCP) 규조류에서 격리 하 여 이온 구성 변경 시 여기 에너지 전달 연구를 자연 지질 작곡과 리로 그들을 통합 하는 프로토콜.

분리 및 통합 규조류 Cyclotella Meneghiniana Thylakoid 지질으로 리에서에서 광 수확 안테나

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

isolating-incorporating-light-harvesting-antennas-from-diatom

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

7.7K 조회수.  Goethe University. 여기, 선물이 fucoxanthin 엽록소 a/c 바인딩 단백질 (FCP) 규조류에서 격리 하 여 이온 구성 변경 시 여기 에너지 전달 연구를 자연 지질 작곡과 리로 그들을 통합 하는 프로토콜.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually determined by transcriptomic, proteomic, metabolomics and lipidomic measurements. In this protocol, we introduce a simple method for the reproducible extraction of metabolites, lipids and proteins from biological tissues using a single aliquot per sample. The extraction method is based on a methyl tert-butyl ether: methanol: water system for liquid: liquid partitioning of hydrophobic and polar metabolites into two immiscible phases along with the precipitation of proteins and other macromolecules as a solid pellet. This method, therefore, provides three different fractions of specific molecular composition, which are fully compatible with common high throughput 'omics' technologies such as liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometers. Even though the method was initially developed for the analysis of different plant tissue samples, it has proved to be fully compatible for the extraction and analysis of biological samples from systems as diverse as algae, insects, and mammalian tissues and cell cultures.

A protocol for comprehensive extraction of lipids, metabolites and proteins from biological tissues using one sample is presented.

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for skin-care cosmetics. The goals of the protocol are: (1) to process chicken feathers into KH by alkaline-enzymatic hydrolysis and purify it by dialysis, and (2) to test if adding KH into an ointment base (OB) increases hydration of the skin and improves skin barrier function by diminishing transepidermal water loss (TEWL). During alkaline-enzymatic hydrolysis feathers are first incubated at a higher temperature in an alkaline environment and then, under mild conditions, hydrolyzed with proteolytic enzyme. The solution of KH is dialyzed, vacuum dried, and milled to a fine powder. Cosmetic formulations comprising from oil in water emulsion (O/W) containing 2, 4, and 6 weight% of KH (based on the weight of the OB) are prepared. Testing the moisturizing properties of KH is carried out on 10 men and 10 women at time intervals of 1, 2, 3, 4, 24, and 48 h. Tested formulations are spread at degreased volar forearm sites. The skin hydration of stratum corneum (SC) is assessed by measuring capacitance of the skin, which is one of the most world-wide used and simple methods. TEWL is based on measuring the quantity of water transported per a defined area and period of time from the skin. Both methods are fully non-invasive. KH makes for an excellent occlusive; depending on the addition of KH into OB, it brings about a 30% reduction in TEWL after application. KH also functions as a humectant, as it binds water from the lower layers of the epidermis to the SC; at the optimum KH addition in the OB, up to 19% rise in hydration in men and 22% rise in women occurs.

The goal of the protocol is to prepare keratin hydrolysate from chicken feathers by alkaline-enzymatic hydrolysis and to test whether adding keratin hydrolysate into a cosmetics ointment base improves skin barrier function (heightening hydration and diminishing transepidermal water loss). Tests are conducted on men and woman volunteers.

각 질의 닭 깃털 및 화장품에의 응용에서의 준비

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human cancers, is processed by farnesylation and carboxymethylation due to the presence of a &#39;CAAX&#39; box motif at the C-terminus. An engineered baculovirus system was used to express farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in insect cells and has been described previously. Here, we describe the detailed, practical purification and biochemical characterization of the protein. Specifically, affinity and ion exchange chromatography were used to purify the protein to homogeneity. Intact and native mass spectrometry was used to validate the correct modification of KRAS4b and to verify nucleotide binding. Finally, membrane association of farnesylated and carboxymethylated KRAS4b to liposomes was measured using surface plasmon resonance spectroscopy.

Prenylation is an important modification on peripheral membrane binding proteins. Insect cells can be manipulated to produce farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in quantities that enable biophysical measurements of protein-protein and protein-lipid interactions

완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They allow the analysis of the intrinsic properties of microtubules, such as dynamics, and their interactions with microtubule-associated proteins (MAPs). The &#8220;tubulin code&#8221; is an emerging concept that points to different tubulin isotypes and various posttranslational modifications (PTMs) as regulators of microtubule properties and functions. To explore the molecular mechanisms of the tubulin code, it is crucial to perform in vitro reconstitution experiments using purified tubulin with specific isotypes and PTMs.
To date, this was technically challenging as brain tubulin, which is widely used in in vitro experiments, harbors many PTMs and has a defined isotype composition. Hence, we developed this protocol to purify tubulin from different sources and with different isotype compositions and controlled PTMs, using the classical approach of polymerization and depolymerization cycles. Compared to existing methods based on affinity purification, this approach yields pure, polymerization-competent tubulin, as tubulin resistant to polymerization or depolymerization is discarded during the successive purification steps.
We describe the purification of tubulin from cell lines, grown either in suspension or as adherent cultures, and from single mouse brains. The method first describes the generation of cell mass in both suspension and adherent settings, the lysis step, followed by the successive stages of tubulin purification by polymerization-depolymerization cycles. Our method yields tubulin that can be used in experiments addressing the impact of the tubulin code on the intrinsic properties of microtubules and microtubule interactions with associated proteins.

This protocol describes tubulin purification from small/medium-scale sources such as cultured cells or single mouse brains, using polymerization and depolymerization cycles. The purified tubulin is enriched in specific isotypes or has specific posttranslational modifications and can be used in in vitro reconstitution assays to study microtubule dynamics and interactions.

중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...