이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01 GM092993)에서 SHO 보조금에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (NSF 경력 수상 및 DBI 0,964,216), 해군 연구 국 (ONR) 젊은 탐정 프로그램 및 생명 공학에 대한 미네소타 파트너십 수상 의학 유전체학. 장치 제조는 국가 나노 기술 인프라 네트워크를 통해 NSF에서 지원을받는 미네소타 대학의 Nanofabrication이 센터 (NFC)에서 수행 하였다. 이 작품은 건강 (NS048357, R21 NS073684), 국립 다중 경화증 학회 (CA1060A11), 알파 밤, 힐튼, 피터슨과 샌포드 기초 및 McNeilus 가족의 국립 연구소에서 MR 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 주사 전자 현미경에 대한 지원은 그림과 Shailabh 쿠마에 대한 지원은 Hyungsoon 임 감사드립니다.

마이크로 웰 어레이 기판의 1. 미세 가공 <ol><li> 열 성장 산화물 (100) (Nm)에 4 인치의 실리콘 웨이퍼로 시작. </li><li> 30 초 동안 4,000 rpm에서 웨이퍼에 SPR-955 0.7 포토 레지스트를 스핀. </li><li> 90 초 동안 115 ° C에서 열판에 굽는다. </li><li> 포토 레지스트를 노출합니다. <ol><li> 배열은 2mm X 2mm 면적 3 μm의 기간이 육각형으로 배열 1 ㎛의 구멍을 만들 것입니다 마스크를 사용하십시오. </li><li> 6mm의 스텝 사이즈 200 엠제이 / cm 2의 노출을 사용하여 i 선 스테퍼에 웨이퍼를 노출시킨다. </li></ol></li><li> 90 초 동안 115 ° C에서 열판에 굽는다. </li><li> 90 초 총 개발 시간의 웨이퍼에 CD-26의 2 웅덩이을 입금 스핀 Developer를 사용하여 개발할 수 있습니다. </li><li> N 2 고순도의 DI 물과 건조로 철저히 씻어. </li><li> 아르곤 50 sccm으로, CF 4의 25 SCCM 및 CHF 3 FLO 50 SCCM으로 6 분 동안 반응성 이온 에칭 기에서 산화물을 에칭75 mTorr의 압력에서 날개. </li><li> C 4 F 8 63 SCCM, SF 6의 27 SCCM, 아칸소의 40 SCCM, 및 O 2가 14 mTorr의 압력에서 흐르는 10 SCCM 2 분 ICP 깊은 트렌치 반응 이온 에칭에 실리콘 에칭. </li><li> 저항 제거하기 위해 아세톤, 메탄올, 이소프로판올에 씻어. </li><li> H 2 SO 4의 목욕 장소 : H 2 O 2 1:1 표면을 청소하는 10 분. </li><li> N 2 고순도의 DI 물과 건조로 철저히 씻어. </li><li> 250 ° C에서 원자 층 증착에 의해 알이 1,080 Å O 3을 입금 </li></ol> 폴리 2. 준비 (디메틸 실록산) 스퀴지 <ol><li> 가능하면, 클린 룸에서 작동합니다. 그렇지 않으면 가능한 깨끗한 환경에서 작동합니다. </li><li> ≥ 13mm의 측면과 함께 플라스틱 페트리 접시 (또는 다른 깨끗한 일회용 용기)를 구합니다. </li><li> 그 접시에, 50g의 PDMS의 BAS 다음, 5g PDMS 경화제을 부어전자 에이전트 (또는 대부분 페트리 접시를 채울 1:10 비율로 무엇이든). 일회용 플라스틱 피펫 또는 막대로 충분히 섞는다. </li><li> 거품이 혼합물 (약 30 분) 나올 때까지 진공을 적용, 진공 라인과 챔버에서 혼합 된 PDMS를 배치하여 거품을 제거합니다. </li><li> 이미 배양 접시에 기포의 생성을 방지 페트리 접시에 PDMS를 부어하지 않을 경우. </li><li> 50 ° C (적은 시간에 대한 높은 열이 또한 작동)&gt;에서 핫 플레이트에서 하룻밤 치료. </li><li> 새 / 깨끗한 면도날로,주의 깊게 가능한 한 깨끗한 표면을 유지, 사각형 조각 약 2.5 × 2.5 cm를 잘라. 깨끗한 포셉 함께 껍질. (이것은 스퀴지 공정에 사용되는 에지 예정) 가능한 한 날카로운 위쪽 가장자리를 만들기 위해, 한 동작으로 면도날을 눌러서 하나의 에지 (1.5 cm 아래로)를 잘라냅니다. </li><li> 다음 아세톤, 메탄올, 이소 프로필 알코올, 및 초순수 DI 물을 청소하고, 청소 질소 가스로 건조한다. 깨끗한 페트리 접시에 보관합니다. </li></ol> 소포의 3. 준비 <ol><li> 지질 재고 25 ㎎ / ㎖ 달걀 포스파티딜콜린 (PC)의 솔루션 및 1 ㎎ / ㎖, 1,2 - 디 팔미 토일-sn-phosphoethanolamine-N을 수집 - 클로로포름 (리사 민 로다 민 B의 설 포닐) 암모늄염 (RHO-DPPE) 클로로포름 / 메탄올 monosialoganglioside GM1의 0.5 ㎎ / ㎖의 원액 (2 : V / V). </li><li> 작은 유리 병에 25 ㎎ / ㎖의 PC의 18.9 μL, 0.5 밀리그램의 39.6 μL / ㎖ GM1 및 7.9 μl를 추가하여 97 몰 %의 PC에, 2 몰 % GM1 1 몰 % RHO-DPPE 결과 혼합물을 1 ㎎ / 유리 주사기를 사용하여 ML RHO-DPPE. </li><li> 참고 :. 나이 르 등 25 보충 자료는 원하는 구성의 소포를 만드는 데 필요한 지질의 양을 계산하는 뛰어난 사용자 정의 Excel 스프레드 시트가 포함되어 있습니다. </li><li> 진공 건조기에서 유리 병을 넣고 6 시간 동안 진공 유리 병을 떠나는하여 용매를 제거한다. </li><li> 0.1의 수용액을 만들M의 NaCl. 건조한 지질 필름을 함유하는 바이알에, 0.1 M NaCl 용액 0.5 ㎖를 추가. </li><li> 수성 지질 혼합물이 하룻밤 휴식을하실 수 있습니다. </li><li> 소포의 현탁액을 생성하기 위해 잠시 동안 소용돌이 혼합 한 다음 실온에서 욕조 초음파 처리기에서 20 분 동안 초음파 처리. </li><li> 100 nm의 기공 크기를 갖는 폴리 카보네이트 막을 통해 소포 현탁액을 돌출. 필터의 17 배를 통해 소포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 4 ℃에서 유리 병에 돌출 된 소포를 저장 </li></ol> 구형 지원 지질 이중층의 4. 형성 <ol><li> 700 나노 미터 직경의 SiO2 구슬을 수집합니다. 구슬은 1.4 × 10 11 비즈 / ㎖의 재고 농도 증류수에 공급된다. </li><li> 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 0.1 M NaCl을 893 μL에 구슬 원액 107 μL를 추가하여 1.5 × 10 10 비즈 / ㎖의 농도가 1 ㎖ 비드 현탁액을 준비합니다. </li><li> 잘 마일 보장하기 위해 서스펜션을 흔든다XED. </li><li> 20 분 후 상층 액을 버린다 1,700 XG에 현탁액을 원심 분리기. 0.1 M의 NaCl 1 ㎖에 비즈를 Resuspend. 철저하게 구슬을 씻어 두 번 더이 단계를 반복합니다. </li><li> , SSLBs를 형성 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 1 ㎎ / ㎖ 소포 현탁액 200 μL에 그런가 2 비드 현탁액의 25 μl를 추가합니다. 소용돌이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 서 보자. 이 단계에서 SSLB 농도는 1.7 × 10 9 SSLBs / ㎖이어야한다. </li><li> SSLBs 펠렛 20 분 1,700 XG에 원심 분리기. 펠렛 인해 구슬 RHO-DPPE와 소포의 파열에 핑크를 나타납니다. </li><li> 225 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS), pH가 7.4에서 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. 반복 SSLB 서스펜션에서 모든 비 파열 소포를 제거하는 4.6-4.7 두 번 더 단계. </li></ol> SSLB 배열 5. 총회 <ol><li> 4-6 마이크 사각형 조각의 결과로 마이크로 웰 어레이 베기 웨이퍼조각 당과 Rowell 배열. </li><li> 소용돌이가 SSLB 현탁액을 혼합, 각 마이크로 웰 어레이에 SSLB 현탁액의 10 μl를 놓습니다. 1 시간 동안 나머지는 SSLBs 표면에 정착 할 수 있도록 않도록. </li><li> 다음 조심스럽게 얕은 접시에 준비 PBS 욕조에 잠수함, 세척 병에서 PBS와 마이크로 웰 어레이 칩을 씻는다. </li><li> 잠수하는 동안 부드럽게 마이크로 웰 어레이 칩의 PDMS 스퀴지 플러시를 배치하고 부드럽게 마이크로 웰에 고정되지 않은 SSLBs을 제거하기 위해 표면에 5 배를 따라 밀어 넣습니다. </li><li> 그립은 부드럽게 마이크로 웰 어레이 핀셋 칩 및 초과 SSLBs를 제거하는 PBS 욕조에 흔들. </li><li> 빨리 스퀴지 화장실에서 칩을 제거하고 더 사용할 때까지 신선한 PBS 욕조에 넣습니다. 칩의 표면은 SSLBs을 유지하기 위해 젖은 상태로 있어야합니다. </li></ol> 참고 : 위에서 설명한 조립 방법은 마우스의 뇌, 또는 포에서 격리 수초 입자처럼, 자연의 막 입자의 배열을 만들 수 있습니다그런가 2 비드 지원없이 spholipid 소포. 이 작품은 비텐 베르크 등에 자세히 설명되어 있습니다 알. (21) 대표 결과는 다음과 같습니다. 6. 콜레라 독소 결합 분석 <ol><li> PBS에 소 혈청 알부민 (BSA)의 2 ㎎ / ㎖ 용액을 준비합니다. </li><li> 2 ㎎ / ㎖ BSA와 PBS에서 알렉사 488 - 복합 콜레라 독소 B-서브 유닛의 원하는 농도의 용액을 제조. </li><li> PBS 화장실에서 SSLB 어레이 칩을 제거하고 닦아 실험실을 사용하여 PBS 솔루션의 대부분을 떨어져 심지. SSLB 배열이 수화 유지하기 위해 칩에 충분한 PBS를 남겨주세요. </li><li> 비특이적 결합을 방지하기 위해, 2 ㎎ / ㎖ SSLB 어레이 칩 BSA 용액 200 μl를 추가합니다. 가습 상자에 1 시간 동안 휴식을 보자. </li><li> 마이크로 피펫으로, SSLB 어레이 칩의 상단에서 솔루션 200 μl를 제거합니다. </li><li> SSLB 어레이 칩에 콜레라 독소 솔루션 200 μl를 추가하고 가습 상자에 1 시간 동안 휴식을 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 모든 언 바운드 콜레라 독소를 제거하기 위해 세척 병에서 PBS와 SSLB 어레이 칩을 씻는다. </li><li> 실험실을 사용하여 심지 멀리 초과 PBS는 닦아냅니다. 24mm X 40mm 커버 슬립으로 커버 칩 이미징 전에. </li><li> 필터를 사용하여 직립 현미경 이미지 배열은 관심의 형광에 적합한 설정합니다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어의 자동화 된 입자 분석 기능을 사용하여 배열의 개별 SSLBs의 형광 강도를 분석. </li><li> 주어진 배열에서 발견 SSLBs의 강도를 요약 막대 그래프로 개별 SSLBs에서 평균 형광 강도를 컴파일합니다. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Spectroscopic+Detections.">Multiplexed Spectroscopic Detections.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).</li><li>Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Monitoring+of+Lipid+Transfer+Between+Vesicles+and+Hybrid+Bilayers+on+Au+Nanoshells+Using+Surface+Enhanced+Raman+Scattering+(SERS).">Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).</a> Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).</li><li>Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Properties+of+Nanohole+Arrays+in+Metal-Dielectric+Double+Films+Prepared+by+Mask-on-Metal+Colloidal+Lithography.">Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography.</a> ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).</li><li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers.">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs.">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads.">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li></ol>

저자는 공개 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

본 연구에서 우리는지지 지질 이중층 코팅 단 분산의 SiO2 비즈 지질 이중층 또는 기판 표면 상에 리간드를 표적에 대한 필요없이 마이크로 웰 어레이로 배열 될 수 있으며, 배열이 독소 - 지질 상호 작용을 특성화에 사용될 수 있음을 보여준다. CTx/GM1 바인딩에 대해 계산 된 해리 상수 우리에 의하여 이전의보고와, 문헌 값의 폭 격차 관련, 바람직 비교 윈터 등. 지질 - 코팅 된 비드의...

지질 이중층 막 자연에 필수적인 구조입니다. 셀룰러 원형질막 및 소기관 막은 생활에 필요한 분자의 수를 반영 지질 이중층으로 구성되어있다. 많은 생명 유지 과정은 세포의 표면에 발생하거나 지질 이중층의 세포막과 관련된 분자에 의해 매개된다. 사실, 많은 제약 대상 프로세스 또는 분자는 1,2 또는 세포막에서 발견된다. 그것은 해석 등의 막 표면에 발생하는 화학 반응 또는 비공유 결합 이벤트와 같은 프로세스를 조사 할 필요가있다. 천연 막은 센서 분리 및 / 또는 인터페이스하기 어려울 수 있기 때문에, 많은 연구자들은 분석적 연구를 수행하기 위해 단순화 된 모델 막을 이용한다. 모델 멤브레인 시스템의 수는 나노 크기 3,4와 리포좀 직경 미크론의 수백 수만 할 수 있습니다 거대한 소포에 이르기까지 문헌에 설명되어 있습니다. Alternatively, 고체 지지체 상에 증착 평면 지질 이중층, 즉, 지질 이중층 (SLB 수)이 다른면의 개수에 형성 될 수 있고, 광범위하게, 생물 리 학적 생화학 및 분석 애플리케이션 (5)에 사용 된 지원. 전기 또는 광학 재료와 SLB 수 커플 링은 서로 다른 분석 기술의 사용을 통해 막 생화학 및 생물 물리학의 조사를 가능하게한다. 형광 현미경 (6), 전기 화학 7, 광학 분광 8, 주사 탐침 현미경 9, 표면 플라즈몬 공명 (10)와 질량 분석기 (11)는 모든 SLB 수의 구조와 특성을 연구하기 위해 사용되어왔다. SLB 배열은 다중 분석 (12, 13)에 대한 센서의 설계에 추가 기능성을 제공합니다. 다른 응용 프로그램은 면역 세포 (14) 사이에 형성하는 접합을 모방하는 SLB 배열을 사용합니다. SLB 배열을위한 준비 방법은 microflu에서 변화 한IDIC 인접 SLB 패치 사이의 물리적 장벽을 사용하는 사람들에게 (15)에 접근한다. 16 다른 그룹은 인쇄 방법 17을 사용하고, 광 화학적 패턴 (18) 및 다양한 나노 공학은 SLB의 배열을 만들 수 (19)에 접근한다. 이 논문 및 첨부 된 영상에서 우리는 마이크로 웰 (20)의 정렬 된 어레이로 SLB-SiO2로 코팅 된 비드를 증착함으로써 SLB 어레이를 형성하는 방법을 보여준다. 우리는 구형 지원 지질 이중층 (SSLBs)로 SLB-코팅 그런가 2 구슬을 참조하십시오. 이 기술은 우리는 또한 예를 들어 결과를 보여되는 천연 자원 21에서 파생 된 인지질 소포 및 생체막의 배열을 생성 이전 작업의 연장이다. 생체막 입자 또는 소포를으로 배열하는 다른 방법은 소포 표면에 포함 된 보완 리간드와 연관 표면에 특정 표적 리간드의 패턴에 의존하고있다. 예 비오틴을 포함아비딘 협회 22,23 및 DNA 혼성화 기법 24. 우리의 접근 방식은 필요없는 타겟팅 또는 인식 부분과 마이크로 웰 어레이를 필요로합니다. SSLBs의 크기는 낮은 폴리 분산도가 그런가 2 비드 지원의 직경에 의해 정의된다. SSLB 직경보다 더 큰 단지에 마이크로 웰 지름을 조정함으로써, 단일 SSLB 각 마이크로 웰 나오기. 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS) 고무 롤러는 표면에서 마이크로 웰에 고정되지 않은 모든 SSLBs을 제거합니다. 마이크로 웰과 결과 SSLB 배열은 3 ㎛의 중심 간 간격과 육각형의주기와 높은 밀도 (~ 10 5 SSLBs / ㎟)가있다. 직렬 다른 지질 조성물로 SSLBs을 증착함으로써, 임의로 배치 SSLBs 가진 다 성분 배열을 생성 할 수있다. SSLB 배열의 감지 기능을 설명하기 위해, 우리는 SSLBs에 통합 강글리오사이드 (GM1)와 콜레라 독소 (CTx가)의 상호 작용을 사용했다. 와천연 막 입자, 우리는 두 가지 종류의 세포로부터 멤브레인 재료를 함유하는 다 성분 어레이 셀 고유 지질을 검출 할 수 있었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">4-inch silicon wafers</td>
			<td style="width:91px;">University Wafer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">425</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">SPR955-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MICROPOSIT CD-26 developer</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">CD-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">i-line stepper</td>
			<td style="width:91px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;">2500 i3 stepper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vision 320 reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Vacuum</td>
			<td style="width:119px;">Vision 320 RIE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Deep trench reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Plasma Therm</td>
			<td style="width:119px;">SLR-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Atomic layer depostion system</td>
			<td style="width:91px;">Cambridge NanoTech</td>
			<td style="width:119px;">Savannah</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit</td>
			<td style="width:91px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">egg phosphatidylcholine</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:239px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">monosialoganglioside GM1&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Silica beads</td>
			<td style="width:91px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">SS03N/4666</td>
			<td>Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C-34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">NL1326R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">FM1-43</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-401-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of biomembrane microarrays with a squeegee-based assembly method

지질 이중층 막은 세포의 원형질막을 형성 및 세포 내 소기관의 경계를 정의한다. 자연 속에서, 이러한 세포막은 지질의 많은 종류의 이종 혼합물이다 막 결합 단백질을 포함하고 탄수화물로 장식되어 있습니다. 일부 실험에서, 천연 막과는 지질 이중층의 생물 리 학적 또는 생화학 적 성질을 분리하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에는 거 소포, 리포좀 또는지지 지질 이중층 (SLB 수)와 같은 모델 시스템의 사용을 요구한다. SLB 수의 배열은 응용 프로그램을 감지하고 세포 - 세포 상호 작용을 모방 특히 매력적이다. 여기에서 우리는 SLB 배열을 형성하는 새로운 방법을 설명합니다. 서브 마이크론 직경의 SiO2 구슬 먼저 구형 SLB 수 (SSLBs)를 형성하는 지질 이중 막으로 코팅되어 있습니다. 비즈는 다음의 마이크로 제조 서브 마이크론 직경의 마이크로 웰의 배열로 입금됩니다. 갈려하면서 제조 기술은, 기판 표면을 청소하기 위해 &quot;스퀴즈&quot;를 사용마이크로 웰에 정착 SSLBs 뒤에 g. 이 방법은 마이크로 웰 기판의 화학적 인 수정이나 SSLB에 특정 표적 리간드가 필요하지 않습니다. 잘 직경이 비드 직경보다 그냥 크게 조정되어 있기 때문에 마이크로 웰은 작은 구슬에 의해 점유되어 있습니다. 나머지는 비어있을 동안 일반적으로 우물의 더 많은 최대 75 %를 점유하고 있습니다. 버퍼 SSLB 어레이보다 일주의 장기 안정성을 표시. 우리는 강글 리오 시드 GM1와 콜레라 독소의 상호 작용을 특성화하여 보여 이는 SSLBs 여러 종류의 시리얼 증착에 의해 하나의 어레이에 배치 될 수 있으며, 어레이는 감지를 위해 사용될 수있다. 우리는 또한 셀룰러 소스로부터 비드 지지체 및 생체막없이 인지질 소체는 동일한 방법으로 배열 될 수 있고, 셀 고유 막 지질은 식별 될 수 있음을 보여준다.

SiO2로 비즈 인지질, 형광 지질 등 강글리오사이드와 같은 다른 지질로 구성된 소포 용액과 혼합하는 경우도 1a에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 소체는 SSLBs을 형성 할 SiO2를 비드 표면에 파열. SSLBs 세척 후, SSLB 용액의 방울을 마이크로 웰 어레이에 배치되고, 비드 표면에 정착하는 것이 허용된다. (그림 1B1)이 그림 1B2에 표시됩니다 인지질 소포 또는 자연 ...

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Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K 조회수.  University of Minnesota.  지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다. 

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

실버 씨앗 중재 성장 방법과 골드 Nanostar 합성

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

연구

생체공학

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.