이 작품 (하 제 미), 국가 한국 연구 재단 (2016R1D1A1B03931949)에서 교부 금에 의해 그리고 한국 (NRF) 부여 (J.Y에 한국 government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009)에 의해 투자 연구 재단에 의해 지원 되었다 .)

1. 미토-Keima (mt Keima) 표현 HeLa 세포의 생성
<ol><li>
Mt Keima lentivirus의 준비
	<ol>
<li>0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염-버퍼링 식 염 수 (PBS)의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트 고 실 온에서 5 분 동안 서 서 있습니다.</li>
		<li>진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.</li>
		<li>플레이트 1.5 x 106 HEK293T 셀 코팅된 문화 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM의 10 mL와 함께 요리 하 고 CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 셀 1 일 문화.</li>
		<li>DNAs (psPAX 2 µ g과 pVSVG 0.25 µ g) 포장 함께 mt Keima lentiviral 플라스 미드29 DNA의 2 µ g transfect transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.</li>
		<li>Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 합니다. 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 수집 된 미디어에서 세포질 파편을 제거 하 고 0.45 μ m 주사기 필터와 필터링. 참고: 장기간 사용에 대 한 aliquots lentiviral 입자의 만들고-80 ° c.에 샘플 저장 바이러스 샘플을 동결-해 동 주기 효율적인 바이러스 감염에 대 한 복종 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mt Keima lentivirus 감염 헬러 Parkin 셀
	<ol>
<li>플레이트 5 x 104 HeLa 세포 DMEM 포함 10 %FBS 1% 페니실린/스 37 ° C에서 마운트 Keima lentivirus 수확 전에 하루 4 mL와 60 mm 문화 접시에 Parkin (헬러-Parkin)를 표현. 참고: 헬러 세포30, 더 명확 하 게 쇼 CCCP 유도 mitophagy 여기 익숙해 헬러 Parkin 셀에에서 생 Parkin 식의 부재 때문에. 이 절차는 또한 다른 주 또는 불멸 하 게 셀 라인에 적용할 수 있습니다.</li>
		<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 산 Keima lentiviral 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 3 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가적인 2 mL를 추가 합니다. CO2 조직 문화 인큐베이터에서 1 일 동안 품 어.</li>
		<li>다음 날 mt Keima lentiviral 혼합물을 제거 하 고 씻어 1 x PBS로 두 번 셀. 성장 매체의 4 mL를 추가 하 고 이틀 동안 2 µ g/mL puromycin 셀 치료.</li>
		<li>Puromycin 선택의 2 일 후에 성장 매체를 제거 하 고 두 번 1 x PBS로 세포 세척. 성장 매체를 추가 하 고 사용까지 CO2 배양 기에서 세포 문화. 참고: 이 메서드는 안정적으로 mt-Keima, 다른 세포 선 및 1 차 셀을 포함 하 여 표현 하는 셀을 생성 하 적용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유도 mitophagy CCCP 치료를 사용 하 여 및 FACS 샘플 준비
<ol style="margin-left: 40px;"><li>플레이트 5 x 104 헬러 Parkin 세포 mt-Keima-60mm 문화 표현 10 %FBS 1% 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 함께 요리 하 고 CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 일 문화.</li>
	<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 신선한 DMEM 포함 10 µ M 카보닐기 시안 m-chlorophenylhydrazone (CCCP)의 4 개 mL를 추가. 헬러-Parkin-mt-Keima 셀 6 h에 대 한 CO2 조직 배양 기에 품 어.</li>
	<li>나중에 6 h 성장 매체를 제거 하 고 1x PBS의 2 mL로 세포 세척. 트립 신/EDTA 솔루션으로 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체를 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 15 mL 원뿔 튜브로 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 셀 원심</li>
	<li>조심 스럽게 포부에 의해 성장 매체를 제거 하 고 차가운 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend.</li>
	<li>적합 한 FACS 튜브에 세포를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치. 참고: 부정적인 통제로 감염 되지 않은 HeLa 세포를 준비 합니다. 참고: 세포, 몇 시간 동안 얼음에 가능한가 그리고 mt Keima 형광 신호 또한 안정적으로 유지.</li>
</ol>3. FACS 분석 mitophagy
참고:이 연구에 셀 흐름 cytometer 405 nm 및 561-nm 레이저 장착으로 분석 되었다. 바이올렛 레이저로 세포 흥분 했다 (405 nm) 방출 BV605 검출기와 노란색-녹색 레이저 610 ± 10 nm에서 감지와 (561 nm) 방출 동시에 610 ± 10 nm에서 PE CF594 검출기에 의해 감지 (그림 1)와 함께.
<ol><li>
라이브 셀 게이팅
	<ol>
<li>교류 cytometer와 컴퓨터 그리고 분석 소프트웨어에 로그인.</li>
		<li>새로운 실험을 생성 하거나 기존 실험을 복제 합니다. 보라색으로 세포를 자극 (405 nm)와 노란색-녹색 (561 nm) 레이저 및 방출 610 ± 10 nm 검출기에서 검출, 앞으로 분산형 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 필요한 fluorophores로 매개 변수 창에서 BV605와 PE-CF594을 선택. 참고: 모든 fluorophores 선형 모드에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>와 동 각 셀 샘플 짧게 분산 셀을 집계 합니다.</li>
		<li>Mt Keima lentivirus 샘플 주입 포트와 감염 되지 않은 컨트롤 헬러 Parkin 셀 샘플을 포함 하는 튜브 놓고는 cytometer에서 "실행된" 버튼을 누릅니다.</li>
		<li>SSC 대 FSC의 도트 줄거리에서 점 작의의 중앙에 세포를 FSC 그리고 SSC 전압을 조정 합니다.</li>
		<li>P1 게이트 라이브 셀 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 그리고 죽은 세포 및 세포 잔해 (그림 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
보라색과 녹색 레이저에 대 한 전압 조정
	<ol>
<li>튜브 샘플 주입에 mt Keima lentivirus 감염 포함 헬러 Parkin 셀 포트와 cytometer에서 "실행된" 버튼을 눌러 놓습니다.</li>
		<li>BV605의 도트 음모에서 (405 nm) 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현이 mt-Keima (그림 2B)를 표현 하지 않는 제어 셀에서 명확 하 게 구별 되도록 BV605 전압을 조정 SSC, 대.</li>
		<li>PE-CF594의 점 플롯에 (561 nm)는 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현 명확 하 게 고유 컨트롤 셀 (그림 2B)에서 PE CF594 전압을 조정 SSC, 대.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitophagy 셀의 비율을 평가
	<ol>
<li>선형 눈금을 사용 하 여 PE CF594 점 플롯 대 BV605를 취득 합니다. 셀 마운트-Keima, 표현 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 게이트 그리고 하지 mt-Keima (그림 3A)를 표현 하는 세포를 제거. Mt Keima 형광 양성 세포 인구 "산 Keima" 문 이라고 합니다.</li>
		<li>PE-CF594 유일한 "산 Keima"를 보여주는 대 BV605의 다른 점 플롯 만들기-셀 문이. 이 점 플롯에서 치료 mt-Keima-긍정적인 세포 주위 게이트를 그립니다. 기저 mitophagy 활동 제어 헬러의 셀 낮습니다, 그리고 PE-CF594/BV605에서 방출의 비율은 1 보다 작은. 따라서,이 문 이라고 하는 "낮은" 게이트.</li>
		<li>"낮은" 게이트의 위의 영역을 포함 하는 다른 게이트를 그립니다. 이 게이트는 그것은 높은 mitophagy 활동, 즉, 셀 셀 PE-CF594/BV605 (그림 3B)에서 방출의 높은 비율을 포함 하기 때문에 "높은" 게이트 라고 합니다.</li>
		<li>"높은" 문 셀의 비율을 계산 하려면 "인구 계층 보기" 메뉴를 선택 합니다. 상위의 "%" (% 부모) 값 산-Keima-긍정적인 인구 중 "높은" 문 셀의 비율을 나타냅니다.</li>
		<li>"산 Keima" 중지 게이트에 기록 하 고 각 샘플을 실행 하려면 적어도 10000 이벤트를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+More+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li><li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+revisited.+Alternative+functions+of+mitochondria.+Bioscience+Reports.">Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports.</a> Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).</li><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. 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H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology.">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li><li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission.">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li><li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SESN2/sestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages.">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li><li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells,+C.+Elegans,+and+mice.">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 mt Keima을 표현 하는 세포에 세포 mitophagy 활동을 측정 하 cytometry 사용 하기 위한 신속 하 고 중요 한 방법을 제시. Mitophagy의 높은 수준을 겪고 셀 전시 PE CF594의 증가 비율 (561 nm) / BV605 (405 nm) 여기. 따라서, mitophagy 활동 높은 561/405 비율을 전시 하는 셀의 백분율로 나타낼 수 있습니다. 우리 PE CF594의 도트에 "높은" 게이트 영역에서 셀의 비율을 계산 (561 nm) BV605 대 (405 nm), 그리고 결과 CCCP ...

미토 콘 드리 아 세포 증식과 생리학에 필수적인 세포는. 미토 콘 드리 아 생성 산화 인 산화를 통해 ATP 공급의 80% 이상 및 그들은 또한 생 합성 및 대사1,2에 대 한 다양 한 대사 중간체를 제공 합니다. 에너지 공급 및 물질 대사에 그들의 역할 외에도 미토 콘 드리 아 중앙에서 역할 많은 다른 중요 한 프로세스, 반응성 산소 종 (ROS) 생성, 세포 죽음, 그리고 세포내 캘리포니아2 + 역학3의 규칙을 포함 하 여 . 미토 콘 드리 아 기능으로 변경 인간의 질병, 암, 당뇨병, 다양 한 신경 질환4,5등와 연결 되었습니다. 증가 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 미토 콘 드리 아 DNA 변이 정상적인 노화 과정6,,78을 생각 된다 또한. 따라서, 품질 관리 미토 콘 드리 아에서 중요 한 문제입니다. 미토 콘 드리 아에는 지속적으로 늘어나는 네트워크와 짧은, 조각난 형태 사이 그들의 모양을 변경할 수 있는 매우 동적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아 역학 mitophagy9를 통해 그들의 저하 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아의 기능 유지에 중요 한 역할을 한다.
Mitophagy는 autophagy 기계를 사용 하 여 전체 미토 콘 드리 아의 선택적 저하를 포함 하는 메커니즘입니다. Mitophagy 원리 메커니즘 기본 미토 콘 드 리아 회전율과 손상 또는 역 기능 mitochondria의 제거 이다. 이 과정에서 미토 콘 드리 아 막, autophagosomes, 다음 가수분해 저하9리소좀과 융합의 형성의 결과로 처음 둘러싸여 있다. 초파리 에서 유전자 연구 제안 두 파 킨 슨 병 관련 유전자, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (PINK1) (PARK6) Parkin (PARK2), 동일한 통로10,11에 기능. 시퀸스 연구 PINK1 Parkin 통로 제거 손상 된 미토 콘 드리 아에 대 한 책임 및 역 기능 mitophagy이 통로에 결함을 인간의 질병12,13에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 결함 mitophagy 프로세스에 최근 다양 한 인간 질환, 암, 심장 질환, 간 질환과 neurodegenerative 질병 14를 포함 하 여 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 또한 나타났습니다 그 mitophagy는 차별화, 개발, 면역 응답15,,1617,18 등 많은 생리 과정에 중요 한 ,19, 제안 하는 mitophagy 세포 기능을 조절에 더 적극적인 역할을 재생할 수 있습니다.
최근 확인 mitophagy 미토 콘 드리 아에서 두 품질 관리에 중요 한 역할 및 인간의 질병, 밑에 mitophagy 분자 메커니즘 제대로 유지에 불구 하 고 이해. Mitophagy 관련 메커니즘에서 효 모 연구 체계적으로, 비록 포유류 세포에서 mitophagy 관련 메커니즘을 탐구 하기 위한 연구 PINK1 Parkin 통로에 주로 집중 했다. 이전 연구는 PINK1 Parkin 통로 주로 mitophagy12,20,21을 통해 손상 된 미토 콘 드리 아의 선택적 제거에 대 한 책임을 설립 하 고 있다. 그러나, 최근 연구는 일부 모델에 mitophagy 활성화 될 수 있다 기능 PINK122,,2324의 부재에도 보고 있다. 이 결과 PINK1 Parkin 통로, 거기 mitophagy를 활성화할 수 있는 추가 미확인된 통로 이외에 하는 것이 좋습니다.
Mitophagy 활동을 평가 하는 편리한 방법의 부재 탐험 경로 mitophagy 및 병 태 생리 이벤트에서의 역할에 중요 한 장애 이다. 전자 현미경 직접 autophagosome를 가득 채우고 미토 콘 드리 아를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 그러나, 전자 현미경 mitophagy 활동 측정에 한계가 있다. 비록 microtubule 관련 단백질 1를 사용 하는 전략 빛 체인 3 (LC3)-GFP LC3, 등 활용된 형광 프로브는 현재 가장 널리 사용 되 접근25, LC3 기반 신호의 과도 특성 및 그것의 높은 속도의 허위-긍정 신호 셀26에서 mitophagy을 탐지 하기 위한 그것의 감도 제한 합니다. 미토 콘 드리 아 단백질 수준, autophagosomes 또는 리소좀 미토 콘 드리 아 colocalize 미토 콘 드리 아 DNA, 형광 현미경 분석의 정량화를 측정 하기 위해 서 부 럽의 조합 평가 하기 위한 좋은 방법이 될 것 이라고 mitophagy입니다. 그러나, 정량화 한계 및 기존 방법론의 부족 새로운 접근에 대 한 호출합니다. 새로운 pH 의존 형광 단백질, 미토 콘 드 리아 대상 Keima (mt Keima)의 소개는 크게 mitophagy27을 감지 하는 능력 향상. 시 토 크롬 c 산화 효소 소 단위 VIII (콕스 VIII) Keima로의 미토 콘 드리 아를 대상으로 순서를 융합 하는 여 산 Keima는 미토 콘 드리 아를 감독 이다. 440에서 여기 Keima 피크에에서 큰 변화 586 nm (해당 pH 7과 pH 4, 각각) 수 nm 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험28,29에 민감하게 좋은 mitophagy를 평가 하기 위해 활용 . 더 중요 한 것은, lysosomal 저하 산 Keima의 저항 리소좀, mitophagy 활동의 쉬운 양적 측정에 대 한 허용에 mt Keima 신호 통합을 발생 합니다. Mt-Keima에서 발생 하는 형광 변경 중 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석 될 수 있다 또는 흐름 cytometry28,29. 그러나, mt Keima를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 교류 cytometry 기반 방법까지 자세히 제공 되어 하지 않았습니다.
여기, 우리 산 Keima를 사용 하 여 셀에 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 흐름 cytometry 기반 기술에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 여기에 표시 된 Parkin 표현 하는 HeLa 세포에서 성공적으로 감지 CCCP 유도 mitophagy을 교류 cytometry 분석을, 비록이 기술은 다양 한 셀 형식에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermos scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m syringe filter</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>FACSDIVA</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSDIVA (v8.0.1)</td><td></td></tr></tbody></table>

sensitive measurement of mitophagy by flow cytometry using the ph-dependent fluorescent reporter mt-keima

Mitophagy 선택적 제거의 autophagy 기계를 사용 하 여 손상 되거나 불필요 한 미토 콘 드리 아의 과정 이다. 결함이 mitophagy 및 신경 퇴행 성 질환, 암, 대사 질환 등 다양 한 인간 질병 사이 가까운 연결이 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 mitophagy는 차별화 및 개발 등의 정상적인 세포 프로세스에 관여 나타났습니다. 그러나,의 정확한 역할 및 mitophagy 기본 분자 메커니즘 연구를 해야 합니다. 따라서, 그것은 mitophagy 활동에 변화를 측정 하기 위한 강력 하 고 편리한 방법을 개발 하는 중요 한입니다. 여기, 우리는 양적 cytometry 미토 콘 드리 아-타겟 형광 단백질 Keima (mt Keima)를 사용 하 여 통해 mitophagy 활동을 평가 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 더 신속 하 고 민감하게 전통적인 현미경 검사 법 또는 immunoblotting 기반 방법 보다이 흐름 cytometry 분석 결과 mitophagy 활동을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양 한 셀 형식에 mitophagy 활동 분석에 적용할 수 있습니다.

헬러 Parkin 셀에 mitophagy CCCP 유도의 흐름 cytometry 분석의 예는 그림 4에 표시 됩니다. 위에서 설명한 흐름 cytometry 분석 방법을 사용 하 여, 우리는 "높은" 게이트 mitophagic 셀에 극적인 증가 검색할 수 있습니다. "높은" 문 셀의 백분율은 치료 제어 셀 (그림 4A)에 비해 10 배 이상 증가 했다. Mitophagy 활동에 있는이 증가 bafilomycin A (BFA) (<...

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Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K 조회수.  Dong-A University. Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

연구

생물학

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

면역학 및 감염병학

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

의학

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. Mitophagy is the primary mechanism of mitochondrial quality control and is generally studied using microscopic observation, however in vivo mitophagy assays are difficult to perform. Evaluating mitophagy by imaging live organelles is an alternative and necessary method for mitochondrial research. This protocol describes the procedures for using the cell-permeant green-fluorescent mitochondria dye MitoTracker Green and the red-fluorescent lysosome dye LysoTracker Red in live cells, including the loading of the dyes, visualization of the mitochondria and the lysosome, and expected outcomes. Detailed steps for the evaluation of mitophagy in live cells, as well as technical notes about microscope software settings, are also provided. This method can help researchers observe mitophagy using live-cell fluorescent microscopy. In addition, it can be used to quantify mitochondria and lysosomes and assess mitochondrial morphology.

Mitophagy is the primary mechanism of mitochondrial quality control. However, the evaluation of mitophagy in vivo is hindered by the lack of reliable quantitative assays. Presented here is a protocol for the observation of mitophagy in living cells using a cell-permeant green-fluorescent mitochondria dye and a red-fluorescent lysosome dye.

미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

예쁜꼬마선충(C. elegans)과 간암 세포주(Liver Cancer Cell line)의 유사분열(Mitophagy) 정량화

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

저자 스포트라이트: Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes(세포기관 특이적 염료를 사용한 예쁜꼬마선충 및 포유류 세포의 유사 분열 검출)  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

요약

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효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출