우리는 흐름 cytometer에 액세스 로리 Destroismaisons과 뛰어난 기술 지원을 사라 Peyrard 및 Dr.Alexandre 프라 감사합니다. 우리는 또한 준비에서 수초의 제거에 대한 그의 기여에 대한 박사 티모시 밀러를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR) 신경 근육 학 연구 파트너십, 혁신에 대한 캐나다 재단, 캐나다의 ALS 협회, ALS 연구를위한 프릭 재단, 미끼 재단과 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 (CVV)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 두 CVV 및 NA는 연구 학자 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 및 CIHR 새로운 수사. SP 캐나다의 ALS 협회에서 팀 노엘 재학 지원됩니다.

본 연구에 사용 된 동물은 캐나다에 의해 설명 된대로 국가 표준을 다음과 동물의 보호를위한 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 4 대학 몬트리올 (CRCHUM) 기관위원회의 승인 프로토콜 (N08001CVsr)에 따라 엄격하게 처리하여, 동물 관리 협의회 (CCAC). 이 프로토콜 (표 1)을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 준비합니다. 장비, 소모품 및 공급 업체에 대한 다른 모든 세부 사항은 재료의 목록에서 찾을 수 있습니다. <img alt="표 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> 표 1 버퍼 조성물은. 쥐 척수의 1 컬렉션 <ol><li> 깊이 4 % isoflorane와 쥐 (스프 라그)를 마취시키다. 일의 곤란에 반사의 부족에 의해 진통제를 확인전자 앞발. 단두대를 통해 잘린 쥐를 안락사. 안락사이 방법은 척수 왜곡이있는 다른 사람들보다 더 선호된다. </li><li> 척추를 노출 뒤의 피부를 잘라. 다만 골반 뼈 위의 뼈 가위로 척추를 잘라. 척주의 개통을 시각화. </li><li> 척추에, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 채워진 200 μL 피펫 팁 (불꽃을 통해 약간 녹는 통해 부착)로, 10 ML의 주사기를 삽입합니다. </li><li> 플런저 압력의 매체 량을 적용하여 척수 세척. </li><li> 모든 혈액 척수에 존재하는 경우, 다음 단계로 진행하기 전에 PBS로 헹군다. 참고 :이 방법은 또한 뇌와 간을 위해 검증되었습니다. 이러한 조직을 포함하는 경우, 절반 안락사 래트에서 뇌 및 척수에서 동일 간 중량의 조각을 모은다. 다른 모든 단계는 동일 남아있다. </li></ol> 척수에 Mit의 2 절연ochondria (반데 Velde 외 각색. 4) <ol><li> 5 볼륨 (~ 3.25 ml)에 균질화 버퍼 (HB) 5 ㎖의 유리 균질의 전체 손상 척수과 장소를 수집합니다. 격리 된 미토콘드리아의 최적의 복구의 경우, 얼음 또는 차가운 방에서 모든 단계를 수행합니다. 조직의 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 손으로 약 8 스트로크를 조직을 균질화. 둘 (2 ㎖) 또는 셋 (1.7 ml)에 마이크로 원심 튜브에 균질를 놓습니다. 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리기 1300 XG. </li><li> 5 ML의 초 원심 분리기 튜브에 상층 액과 장소를 복구 할 수 있습니다. 펠릿 함유 microcentrifuge 관에 750 μL (~ 0.5 권) HB를 추가하고 부드럽게 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하고 재 부상은 두 번 더 반복합니다. 위의 수영장 같은 5 ML의 초원 심 분리기 튜브에 모든 상층 액 (S1A 및 S1B). 이 단계는 작은 파편을 제거하는 역할을한다. </li><li> 원심 분리기는 S1이 스윙 버킷 부패가 장착 된 초 원심 분리기를 사용하여 풀링또는 4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 세포질 분획 (웨스턴 블롯 분석을위한 예를 들어) 관심사 인 경우 추가 처리를 위해 상등액 (S2)를 유지한다. 4 ML의 HB + 50 mM의 KCl을 펠릿에 (P2), 조 미토콘드리아 분획을 재현 탁. 스윙 버킷 로터에서 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기 17,000 XG. 뜨는을 취소하고 부드럽게 800 μL의 HB에서 펠렛 (P3)을 재현 탁. NOTE : 미토콘드리아 어떤 비특이적 미토콘드리아 관련 오염 물질을 제거하기 위해 HB + 50 mM의 KCl을로 세정된다. </li><li> 새로운 5 ㎖의 초 원심 분리기 튜브에서 재 부유 펠렛 (P3)의 정확히 800 μl를 추가합니다. </li><li> 이에 의해이 튜브에 12 % Iodixanol의 최종 농도를 만들어, Iodixanol (밀도 구배 배지) 200 μl를 추가한다. 온화하지만, 철저 P1000 피펫을 통해 함께 튜브의 내용물을 혼합한다. 제 Iodixanol 첨가하고 재현 탁 펠릿 (P3)의 철저한 혼합을 촉진하는 것이 바람직 할 수있다. ULT에서 원심 분리기4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에서 스윙 버킷 로터가 장착 racentrifuge. </li><li> NOTE : 간이 미엘린을 제공하지 않으며, 단지 간 처리되는 경우에는, 따라서이 단계는 필요하지 않다. CNS 간 미토콘드리아와 동시에 처리되는 경우, 그것은 동일하게 모든 조직을 치료하는 것을 권장한다. </li><li> 튜브의 상단에 미엘린의 레이어를 대기음 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛이 느슨 할 수 있습니다. 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 다시 4 ℃에서 10 분 동안 17,000 XG에. 뜨는을 취소하고 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 100 ~ 200 μL의 HB에 최종 펠릿 (P7)을 재현 탁하고, 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 이 샘플은 격리 된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다. </li><li> 단백질 정량 진행합니다. 미토콘드리아 두리의 충분한 용해를 보장하기 위해 샘플 및 2 % 도데 실 황산나트륨 (SDS)의 표준 곡선을 희석NG 단백질 정량. </li></ol> 유동 세포 계측법에 대 한 격리 된 미토콘드리아의 3 Immunolabeling <ol><li> 각 염색 믹스를 테스트하기 위해서는, 피펫 1.7 ML microcentrifuge 관에 고립 된 미토콘드리아의 25 μg. 각 실험에서 흠없는 샘플을 포함; 각 항체에 대한 적절한 이소 타입 제어를위한 샘플을 포함해야합니다. </li><li> 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 4 ° C (차단 단계)에서 15 분 동안 10 % 지방산 무료 BSA와 보충 50 ㎕의 미토콘드리아 버퍼 (M 버퍼)에 격리 된 미토콘드리아를 재현 탁. 참고 : 라벨 동안 4 ° C에서 냉장고에 인큐베이션을 수행합니다. </li><li> 튜브에 차 항체 (토끼 항 Mfn2, ML 당 20 μg)을 추가하고 4 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 참고 : 적정에 의해 경험적으로 각 항체의 최적 농도를 결정합니다. 집중력 및 / 또는 P의 변동urity, 동일한 제조업체의 같은 항체의 다른 많은 다른 결과가 발생할 수 있습니다; 따라서 적정 항체의 새 많이 필요합니다. </li><li> 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 부드럽게 200 μL M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 50 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 튜브에 차 항체 (당나귀 항 - 토끼 IgG의 피코 에리 트린 (PE) ML 당 0.5 μg)을 추가하고 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분, 위해 샘플을 배양한다. </li><li> 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 200 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 500 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 이벤트가 사실 미토콘드리아에있는 보장하기 위해,와 얼룩 고립 미토콘드리아빛으로부터 보호 RT에서 15 분 동안 미토콘드리아 특정 형광 염료. 다른 기능 매개 변수 (미토콘드리아 막 횡단 전위 또는 슈퍼 옥사이드 생산)의 염색이 필요한 경우가 아닌 경우, 수집을 위해 5 단계로 진행 4 단계로 진행합니다. 참고 :이 차 항체의 발광 스펙트럼은 기능 염료의와 호환되는지 확인하는 것이 중요합니다. (: 예 650 내지 / 엠 660 nm의 APC)를 예를 들어, 테트라 메틸 메틸 에스테르 (TMRM)와 FITC 및 횡단 전위 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 상용 염료 미토콘드리아 순도를 확인하는 경우, 가능한 이차 항체 알로 피코된다. 보상 컨트롤을 추가, 즉, 샘플 immunolabeled 또는 적용 할 때 하나의 형광 물질로 염색. </li><li> 사이토로드 흐름에 적합한 튜브에 전송합니다. (. 작은 샘플 크기, 미세 적정 튜브 ML 튜브의 유동 세포 계측기 (3) 내부에 배치를 용이하게하기 위해) 얼음에 샘플을 유지하고 즉시 진행취득 흐름 cytometer. </li></ol> 4 시금 미토콘드리아 막 횡단 잠재력 및 유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아 과산화물 생산 <ol><li> 격리 된 미토콘드리아가 빛으로부터 보호 실온에서 15 분, 대한, 단계 3.8에서, 100 nm의 TMRM (예 548 nm의 / 엠 574 nm의) 오 염색하여 그대로 횡단 잠재력을 가지고 있는지 확인합니다. 샘플 및 인구, TMRM (1-30 nm의)의 상 / 비 담금질 농도의 사용 사이 횡단 잠재력의 비교를 위해, 6 더 적합 할 수있다. <ol><li> TMRM 염색법, 100 μM 카르 보닐 시아 나이드 m-클로로 페닐 하이드라진 (CCCP)의 존재하에 100 nM의 TMRM 가진 얼룩 절연 미토콘드리아 미토콘드리아 탈분극 것이다 미토콘드리아 uncoupler 대 대조군. 낮은 농도의 염료가 사용되는 경우 미토콘드리아 탈분극 필요 CCCP의 농도는 작을 수있다. </li></ol></li><li> 격리 된 미토콘드리아가 성하여 미토콘드리아 과산화물을 생성되었는지 확인빛으로부터 보호 RT에서 15 분에 대해, 또한 단계 3.8에서, 적합한 미토콘드리아 과산화물 표시기 7 aining. <ol><li> 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생산, 10 μM Antimycin A, 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생성을 보강한다 호흡 연쇄의 복합체 III의 억제제의 존재 하에서 염료 얼룩 절연 미토콘드리아 대 대조군. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아를 고립 Immunolabeled의 5 수집 및 분석 <ol><li> 악기 설정 : 선형에서 스위치 전압 절연 미토콘드리아 및 설정 전압의 분석을 용이하게하기 위해 모드를 기록 (FSC : 450, SSC : 250). 이벤트가 FSC-A (영역) 모드뿐만 아니라 FSC-W (폭) 및 FSC-H (높이)에 수집되어 있는지 확인, 이중선을 (배제 할 수 있어야합니다 즉, 같은 시간에 검출기를 통과하는 두 개의 이벤트, ) 분석 후 데이터 수집. 이벤트의 설정 번호는 100000로 수집합니다. 보상 컨트롤 획득(해당되는 경우). </li><li> 데이터 수집 : 데이터 수집하기 전에 샘플을 텍싱 마십시오. 대신에 부드럽게 튜브를 활용하여 혼합한다. 처음 게이팅하는 동안, 낮은 압력에서 이벤트를 수집. 전체 인구에 문입니다. 이에 따라 히스토그램의 전압을 조정 일반적으로 흠없는 샘플의 피크는 두 번째 10 년 (10 두)에 해당됩니다. 게이트가 확립되고, 샘플이 처리되고 나면, 높은 압력으로 전환 할 수있다. </li><li> 분석 : FSC-W FSC 대 플롯에 의해 이중선을 시각화. 단봉과 이중선을 확인합니다. 단봉에 문입니다. 미토콘드리아 선택적 염료 긍정적으로 염색 이벤트에 게이팅에 의해 미토콘드리아 인구를 선택합니다. </li><li> 이소 타입 컨트롤에서 배경 표시를 확인합니다. 이소 제어 샘플을 사용 Mfn2 항체 양성 미토콘드리아 인구 라벨의 비율을 결정합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration.">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li><li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes:+from+animalcules+to+quantum+dots.">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. 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P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이는 미토콘드리아가 정상적인 생리와 질병 모두에서 핵심 선수임을 점점 더 분명하다. 면역 블로는 특정 조건에서 미토콘드리아 내에서 또는 미토콘드리아 표면에 전체 인구의 평균이 방법 보고서를 발견되는 단백질을 확인할 수있다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군 또는 부분 집합의 상대적 농도에 대한 정보를 얻을 수 없습니다. 이 왔지만 이전에 모든 미토콘드리아가 동등하게 필드가 점점 ...

미토콘드리아는 높은 에너지 수요의 사이트로 이송 및 생리 학적 자극 하나에 빠르게 반응하는 핵분열 및 융합의 여러 라운드를 거쳐 매우 동적 인 세포 소기관이다. 그것이 점점 다른 조직에서 미토콘드리아를 인식하고 있기 때문에, 심지어 다른 세포 구획, 새로운 방법은 이러한 고유 한 미토콘드리아의 하위 집합을 식별하는 데 필요한 별개의 기능 프로파일을 가지고있다. 현미경 개별 미토콘드리아가 가시화 될 수있다 수단 및이 면역에 의해 결정될 수있다이나 미토콘드리아에서 단백질의 존재를 제공한다. 그러나,이 방법에 의해 정량 분석​​은 노동 집약적이고, 일차 또는 무한 증식 세포주를 이용한 실험에 더 적합하다. 조직에서 파생 된 개별 미토콘드리아의 연구는 훨씬 더 어렵고 대부분의 방법은 evalu과 동시에 미토콘드리아 부분 집합을 쉽게 식별 할 수 있도록하지 않습니다미토콘드리아 기능 3의 ation. 이 장애물, 유동 세포 계측법에 의해 짐승 조직으로부터 분리 및 후속 분석 미토콘드리아 immunolabel하는 신규 한 방법을 해결하기 위해 개발되었다. 이는 신속한 검출 및 현미경으로 분석하여 비교 미토콘드리아 외막으로 지역화 단백질의 정량화를 허용 훨씬 덜 노동 집약적이고, 단일 샘플에서 미토콘드리아의 수천의 분석을 허용한다. 이 분석은 미토콘드리아에서 항시 존재하는 것으로 생각되는 미토콘드리아 외막 단백질의 거동 및 상대적인 양을 모니터에 적용 할 수있는, 미토콘드리아 표면 단백질의 채용, 또는 병리학 적 조건의 미토콘드리아에 mislocalized 단백질의 검출. 또한, 종래의 형광 인디케이터 염료의 혼입은 별개의 미토콘드리아에서 미토콘드리아 기능의 특정 측면의 동시 평가를 가능하게소집단.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:349px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:543px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Rats</td>
			<td style="width:349px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 400</td>
			<td style="width:543px;">Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:349px;">Kontes Glass Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">885450-0022</td>
			<td>Duall 22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:349px;">Beckman Coultier</td>
			<td style="width:119px;">344057</td>
			<td>Transparent, thin walled&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sorvall Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall WX UltraSeries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">AH-650 rotor and buckets&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:267px;">Opti-prep</td>
			<td style="width:349px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:119px;">1114542</td>
			<td>Iodixanol, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8806</td>
			<td>Must be fatty acid free for mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sodium succinate dibasic hexahydrate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:267px;">Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:267px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:349px;">Jackson Immuno Research&#160;</td>
			<td style="width:119px;">011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Anti-Rabbit IgG PE</td>
			<td style="width:349px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">12-4739-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Micro titer tube</td>
			<td style="width:349px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">223-9391</td>
			<td>For sample acquisition by flow cytometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoTrackerGreen (MTG)</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td>100 nM: Ex490 nm/Em516 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">TMRM</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T668</td>
			<td>100 nM: Ex548 nm/Em574 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CCCP</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoSOX Red</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M36008</td>
			<td>5 &#181;M: Ex540 nm/Em600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BS FACSDiva Software</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FlowJo</td>
			<td style="width:349px;">TreeStar Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software used for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">BCA protein assay kit&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td style="width:543px;">Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

방법은 검색과 동물의 조직은 미토콘드리아 생리학 및 병태 생리를 연구하는 필수적인 미토콘드리아 외막 단백질 구성 요소를 모니터링 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐의 조직에서 분리 된 미토콘드리아가 immunolabeled 및 유동 세포 계측법에 의해 분석하는 기술에 대해 설명합니다. 미토콘드리아는 설치류 척수로부터 단리 미엘린, 신경 조직으로부터 제조 미토콘드리아 분획의 주요 오염 물질을 제거하기 위하여 빠른 농축 공정을 실시한다. 고립 된 미토콘드리아는 다음 선택의 항체와 형광 접합 된 이차 항체로 표시되어 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 분석은 검출 및 immunolabeled 단백질의 정량 하였다 미토콘드리아 특정 염료로 염색하여 미토콘드리아 제제의 상대적 순도를 검증한다. 이러한 기술은 샘플 당 미토콘드리아 수십만의 분석을 허용 급속한 정량화 및 높은 처리량이다. 이 소설의 페이지를 평가에 적용 할 수있다정상적인 생리적 조건하에 미토콘드리아 표면 roteins뿐 아니라 병리 과정이 소기관에 mislocalized 될 수 단백질. 중요한 것은,이 방법은 미토콘드리아 개체군의 특정 활동에 대한보고를 형광 표시 염료에 결합 및 중추 신경계 (뇌와 척수)뿐만 아니라 간에서 미토콘드리아에 대한 가능하다 할 수있다.

래트 척수 유래의 미토콘드리아는 Mitofusin2 (Mfn2), (8)의 미토콘드리아 외막의 융합에 관여 단백질에 표적 항체 immunolabeled 수있다. Mfn2 특정 항체와 형광 접합 된 이차 항체 분리 및 라벨에 따라, 미토콘드리아는 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 처리된다. 데이터 수집 후, 샘플은 제 도트 플롯 (도 2A)에 수집 된 모든 이벤트를 가시화하여 분석 소프트웨어를 이용하?...

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Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K 조회수.  Université de Montréal, CRCHUM.  여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다. 

비디오: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

연구

생물학

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.

MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...