이 방법은 잠재적인 치료로 주요 실험실 사실 인정의 번역을 위한 자연적인 3D 구조 및 조성에 있는 살아있는 인간 조직의 조사를 허용합니다. 이 기술은 특히 개별 사망한 환자 폐 조직 견본의 시각화를 위해 외과적으로 제분되거나 이식된 인간 폐 조직에서 조직 배양의 생성을 가능하게 합니다. 질병없는 폐 조직은 높은 현면적 해결에서 초기 병기 메커니즘의 분석을 가능하게 폐 질환 ex vivo를 모델링하기 위해 3D 조직 배양으로 사용할 수 있습니다.
먼저 정초된 폐 샘플을 멸균 15센티미터 배양 접시에 15밀리리터의 재배 배지에 넣고 티슈 페이퍼로 덮인 멸균 금속 트레이에 넣고, 30밀리리터 주사기를 섭씨 42도 낮은 융점 아가로즈로 채웁니다. 주변 정맥 카테터에서 외고를 제거하고 카테터를 30 밀리리터 주사기에 부착합니다. 조직의 손상되지 않은 부분에서 환기 조직에서 0.5 ~ 3 mm 직경의 기관지인 기관지와 가능한 한 기관지에 카눌라를 부드럽게 삽입합니다.
집게를 사용하여 카누라 주변의 기관지 벽을 압축하여 인접한 폐 동맥을 동시에 고정하고 카눌라 주변의 기관지를 밀봉하고 수술 용 클램프를 사용하여 아가로즈 누출을 방지하십시오. 다음으로, 포셉을 사용하여 배양 접시에서 폐 조직을 들어 올리고 주사기를 사용하여 카누라를 통해 아가로스를 수동으로 전달하며 초당 0.3 밀리리터보다 빠르지 않습니다. 폐 조직이 조직을 과도하게 팽창하지 않고 완전히 채워지면 즉시 카눌라를 제거하고 기관지클을 고정하십시오.
아가로즈 고형화를 용이하게 하기 위해 30분간 배양 배지에 있는 조직을 침수하고, 추가 적인 기관지 개구부를 위한 아가로즈 충진 절차를 반복한다. 그런 다음 아가로즈로 채워진 폐 조직 섹션을 섭씨 4도 에 슬라이스 할 때까지 저장합니다. 정밀 절단 폐 슬라이스의 경우, 세포 배양 접시의 바닥에 핀셋으로 부드럽게 누르면 붕괴되지 않는 폐 조직 내에서 고체 아가로즈 채워진 영역을 식별합니다.
1~1.5입방센티미터 블록을 단단히 채운 부위의 한쪽은 여전히 흉막으로 덮여 있고, 시아노아크라일레이트 접착제를 사용하여 각 조직 블록의 복수면을 진동홀더에 부착한다. 조직의 단지 2 ~ 3 마일로미터가 슬라이스 남아있을 때까지, 긴 조직 블록을 통해 전체 방법을 슬라이스. 집게를 사용하여 각 500 마이크로미터 섹션을 재배 매체를 함유하는 12웰 플레이트의 1웰로 이송하여 얻어진다.
모든 조직이 단면되었을 때, 각 우물에서 개별 10센티미터 배양 요리로 샘플을 옮기고 정밀 절단 폐 슬라이스의 상부 표면에 4밀리미터 생검 펀처를 직교로 배치합니다. 그런 다음, 시계 방향으로 및 반시계 방향으로 회전하여 펀처를 이동시키고 폐 샘플의 조직 펀치를 얻습니다. 그들은 얻을로 96 웰 플레이트의 개별 우물에 신선한 세포 배양 배지에 각 펀치를 배치.
모든 조직 펀치를 얻을 때, 최대 5 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 인간 3-D 폐 조직 배양에서 면역형광을 사용하여 세포 핵에서 섬유네크틴의 면역 라벨링은 보존된 폐포 구조 ex vivo의 이미징을 허용한다. 인간 정밀 절단 폐 슬라이스 펀치를 48 시간 동안 섬유질 사이토카인 칵테일으로 처리하면 섬유증관련 세포외 매트릭스 구성 요소, 콜라겐 타입 원 및 섬유 넥틴 유전자의 중요한 유도를 포함하여 인간 폐 3-D 조직 배양에서 섬유증과 같은 변화가 발생합니다.
추가적으로, 중간엽 마커 vimentin의 단백질 수준은 3-D 폐 조직 배양 펀치의 처리 후에 4명의 환자 중 3에서 위로 통제됩니다. 이러한 절차에 따라, 정량적 실시간 PCR에 의한 RNA 분석, 또는 서양 블로팅에 의한 단백질 분석과 같은 다른 방법은 조직 내에서 각각 유전자 및 단백질 발현을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 개발 후, 이 기술은 실험용 폐학 분야의 연구를 위한 길을 열어주었으며, 폐 생물학을 식히고 인간 조직 샘플에서 독성 및 약리학 연구를 수행했습니다.
살아있는 인간 조직은 잠재적으로 감염되고 개인 보호 장비 및 적절한 조직 저장, 운송 및 폐기물 취급과 같은 예방 조치를 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 기억하십시오.
