이 방법을 사용하면 코어 히스톤 H3 및 H4의 정확한 정량화와 세포 및 조직 추출물의 번역 후 수정을 통해 고품질의 재현 가능한 결과를 생성할 수 있습니다. 제시 된 기술은 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 그것은 히스톤의 네이티브 번역 후 수정을 보존합니다.
둘째, 고가의 낮은 처리량 방법을 우회합니다. 마지막으로 다운스트림 중간 처리량 응용 프로그램과 완벽하게 호환됩니다. 절차를 보여주는 Karolina Janczura 완전히이 프로토콜을 최적화 하 고 알 츠 하이 머 병에 후성 유전학 규칙에 관한 중요 한 질문에 대답 하는 기술을 사용 하는 내 실험실에서 재능있는 대학원 학생 될 것입니다.
텍스트 프로토콜에 따라 적절한 세포 배양 배지를 사용하여 10센티미터 조직 배양식 접시에서 세포를 플레이트를 시작합니다. 세포가 약 90%의 합류에 도달할 때까지 성장하도록 허용합니다. 세포가 원하는 합류에 도달한 후 배양 배지를 부드럽게 흡인시키고 미리 따뜻해진 혈청 없는 매체로 세포를 두 번 씻는다.
그 후 세포에서 혈청이 없는 매체를 제거하고 10센티미터 의 접시를 얼음 위에 놓습니다. 각 접시에 1밀리리터의 얼음 냉기 추출 버퍼를 넣습니다. 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 추출 버퍼에서 세포를 수집하고 라벨이 부착된 1.5 밀리리터 튜브로 옮습니다.
그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 냉동 조직을 사용하는 경우, 미리 냉각 된 1.5 밀리 리터 튜브에 조직을 배치하고 잠시 얼음에 해동. 다음으로 추출 버퍼의 권장량과 뇌졸중 수를 사용하여 휴대용 균질화로 뇌 조직을 균질화합니다.
균질화는 눈에 보이는 조직 단편이 없고 용액이 유백색 외관에 걸리면 완료됩니다. 그 후, 단일 채널 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 호모게네이트를 1.5밀리리터 튜브로 이송하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포 용해및 균질화 된 뇌 조직을 포함하는 튜브를 섭씨 4도에서 15 RpM에서 회전하는 회전 플랫폼에 놓습니다.
그 후, 4섭씨에서 10분 동안 최대 속도로 튜브를 원심분리합니다. 다음으로 상체를 새로운 사전 냉각 된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 펠릿을 폐기하십시오. 다음으로 1/4 부피의 중화 버퍼로 히스톤을 중화하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.
pH 스트립을 사용하여 혼합물의 pH를 확인하고 필요한 경우 중화 버퍼로 pH를 추가로 조정합니다. 산성 히스톤이 이 단계에서 중화되지 않으면 컬럼 멤브레인에 제대로 결합되지 않고 통과하여 유동에서 검출됩니다. 샘플 의 37.5 마이크로 리터를 샘플 버퍼 12.5 마이크로 리터에 추가합니다.
짧은 원심 분리 후 10 분 동안 섭씨 99도에서 혼합물을 변성합니다. 그 후, 얼음에 튜브를 놓고 응축수 수집을 위해 잠시 회전. 샘플을 SDS-PAGE 젤에 로드하고 1시간 동안 100볼트에서 젤을 실행합니다.
그런 다음 하룻밤 동안 젤을 얼룩지게합니다. 그리고 3 연속 세차중에 그것을 destain. 먼저 각 스핀 컬럼에 500마이크로리터의 평형 버퍼를 추가합니다.
3분 동안 열을 원심분리합니다. 흐름-스루를 버리고 원심분리를 한 번 더 반복합니다. 이 후에 열에 샘플의 500 마이크로리터를 추가합니다.
3분 동안 컬럼을 원심분리하고 흐름을 수집합니다. 그런 다음 이전에 설명한 대로 열 흐름을 분석합니다. 열에 500 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다.
3분 동안 컬럼을 원심분리하고 흐름을 수집합니다. 컬럼을 1.5밀리리터 튜브로 이전합니다. 열에 히스톤 용출 버퍼 50 마이크로리터를 추가합니다.
원심 분리 후 컬럼은 히스톤 단백질을 함유한 흐름을 저장합니다. 화학 후드 에서 4 %의 과염소산의 최종 농도를 달성하기 위해 정제 된 히스톤에 과염소산을 추가합니다. 파이펫을 6번 위아래로 섞어 섞습니다.
시료의 히스톤이 매우 농축되면 과염소산을 첨가한 후 용액이 흐리게 됩니다. 그 후, 24 시간 동안 섭씨 4도에서 튜브를 배양. 하룻밤 히스톤 침전이 성공하면 원심 분리 단계 후 유리병 바닥에 작은 흰색 펠릿이 표시됩니다.
펠릿을 연속 단계로 세척할 때 펠릿이 유리병 바닥에서 쉽게 분리할 수 있으므로 방해받지 않도록 보장합니다. 다음 날 미리 냉각된 미세 원심 분리기 튜브에서 75분 동안 시료를 원심분리합니다. 수퍼네티를 조심스럽게 흡인시키고 펠릿 샘플에 500 개의 미세 리터 얼음 차가운 과염소산을 추가하십시오.
최대 속도로 10분 동안 샘플을 원심분리한 후, 슈퍼나탄을 흡인시킵니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 샘플에 얼음 차가운 아세톤 500 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 상체를 제거하고 튜브가 얼음에 뚜껑을 덮지 않고 30 분 동안 건조 할 수 있습니다.
그런 다음 얼음에서 튜브를 제거하고 샘플이 실온에서 5 분 동안 건조 할 수 있도록합니다. 펠릿이 건조 한 후 멸균 물의 30 마이크로 리터에 그것을 다시 중단. 튜브를 캡하고 히스톤이 얼음에서 30~50분 동안 재구성되도록 합니다.
펠릿이 다시 중단되는지 확인한 후 튜브를 다시 캡을 씌워 얼음에서 제거합니다. 인간 미세글리아BV-2 세포로부터의 이 프로토콜 히스톤에서 정제되었고 추출물 조성물을 분석하였다. 스테인드 젤은 추출 시간이 15분에서 24시간 사이로 원유 히스톤 추출물의 전반적인 조성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
컬럼의 매트릭스에 결합하는 히스톤의 효율은 겔의 염색을 통해 분석하였다. 컬럼 효율은 컬럼 유량에서 검출 가능한 히스톤 단백질의 부재에 의해 입증된 바와 같이 약 100%였다. 추출 시간 기간에 관계없이, 즉.
15 분, 2 시간 또는 24 시간. 첫 번째 컬럼 워시는 추출물에서 가장 많은 양의 비히스톤 단백질을 제거합니다. 24시간 추출 군으로부터 정제된 히스톤 단백질 분획은 15분 2시간 추출 시간에 비해 더 많은 H3 및 H4 히스톤을 함유하고 있습니다.
제1컬럼 용출은 두 번째 용출에서 히스톤 단백질의 부재에 의해 입증된 바와 같이 약 100% 효율적이였다. 조잡한 히스톤은 마우스 전체 뇌에서 추출되었고 번역 후 수정을 측정했습니다. 광범위하게 작용하는 HADC 억제제, 트리부티린, H4K12 아세틸화추출물에 대한 반응으로 증가.
그러나, 항체의 특이성은 원유 추출물에 불순물의 존재로 인해 감소하였다. 히스톤 정화 프로토콜은 클래스 I 및 IIb HDAC 억제제, M344로 처리된 트리플 트랜스제닉 A/D 마우스의 전두엽 피질로 완성되었으며, 단일 순수 코어 히스톤 분획은 H4K12 아세틸화의 변화에 대해 평가되었다. 총 히스톤이 검출되었고 M344에 대응하여 H4K12 아세틸화의 현저한 증가를 관찰했다.
이 절차를 시도하는 동안 프로토콜 내에서 설명된 여러 검사대를 수행하여 프로세스 전반에 걸쳐 성공적인 히스톤 정화를 검증하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 히스톤 인산화 및 메틸화 상태에 관한 추가 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 발달은 알츠하이머 병에 관련되게 있는 유전 기계장치를 분석하는 우리의 실험실에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
그러나 크로마틴 변형이 가설되어 중요한 역할을 하는 다양한 질병 모델에서 사용될 수 있다.
