이 프로토콜은 복잡한 조직에서 기능적으로 관련된 카스파제를 식별, 검증 및 표적으로 하는 상세한 면역조직화학적 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 유형 특이적 세포사멸 및 비-아폽토시스 카스파제-9 기능의 조사를 가능하게 하고 관심 있는 다른 복잡한 조직 및 카스파제에 적용할 수 있다는 것입니다. 카스파제의 기능을 이해하면 세포 생물학에 대한 현재 지식을 확장하는 데 도움이 될 수 있으며 질병에 관여하기 때문에 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데 유리할 수도 있습니다.
염색된 망막 절편의 컨포칼 현미경 이미지를 사용하여 카스파아제 수준을 정량화하기 시작합니다. 이렇게 하려면 405, 470, 555 및 640 채널의 이미지 파일을 피지 콘솔로 드래그하십시오. 이미지, 색상 및 병합 채널 탭을 클릭하여 파일에 색상을 할당합니다.
그런 다음 이미지 스택과 Z 프로젝트를 클릭하여 Z 스택을 압축합니다. 투영 유형을 최대 강도로 선택합니다. 이미지를 클릭한 다음 색상 채널 도구를 클릭하여 채널의 인터페이스를 엽니다.
다음으로 밝기 및 대비 인터페이스를 엽니다. 채널당 매개변수를 선택하려면 채널 탭으로 이동하여 하나의 채널을 선택합니다. 커서를 배경 위에 놓고 픽셀 값에 주석을 추가합니다.
그런 다음 caspase 표현 셀에 커서를 놓고 픽셀 값에 주석을 달아줍니다. 매개 변수를 테스트하려면 밝기 및 대비 인터페이스로 이동하여 선택을 클릭하십시오. 표시된 최소 값 또는 카스파제 표현 셀의 픽셀 값을 연결합니다.
그런 다음 확인을 클릭하기 전에 최대 표시 값 또는 배경 픽셀 값을 연결합니다. 맹검 조직에서 임의의 이미지를 선택하고 채널당 파라미터 선택을 반복하여 모든 채널에 대한 파라미터를 테스트합니다. 매개 변수가 설정되면 이미지 파일을 열고 Z 스택을 압축합니다.
카스파제 채널에 대한 밝기 및 대비 파라미터와 혈관 마커 채널에 대한 이소렉틴을 추가합니다. 포인트 도구를 사용하고 양성 영역의 판독으로 카스파아제 발현과 혈관 마커의 공동 국소화를 사용하여 양성 혈관 영역의 수를 정량화합니다. 그런 다음 후크를 양성 신경 영역의 마커로 사용하여 긍정적 인 혈관 영역의 수를 정량화합니다.
이미지별로 스프레드시트의 값에 주석을 달고 섹션별로 값의 평균을 구합니다. 눈당 판독값이 될 단면 값의 평균을 구합니다. 이 프로토콜은 카스파제의 세포 국소화와 카스파제가 발현되는 뉴런 망막 층을 확인했습니다.
망막 단면은 망막 신경절 층 또는 RGL, 핵간 층 또는 INL에서 망막 핵의 시각화를 허용하고 후크로 염색 할 때 외부 핵 층 또는 ONL을 시각화 할 수있었습니다. 단면에서, 망막 혈관은 RGL과 INL 사이 및 INL과 ONL 사이에 플렉시 폼 층을 공급하고 분리되고 분리 된 것처럼 보였다. 망막 단면은 또한 망막 정맥 폐색 후 하루 동안 고도로 조절된 caspase-9를 확인했습니다.
카스파제-9 억제는 내피 세포 녹아웃 마우스에서 뉴런 카스파제-7 발현을 감소시키는데 더 효과적이었고, 이는 내피 카스파제-9의 기능적 관련성을 검증하였다. 대표적인 분석은 카스파제-9 활성의 억제가 망막 정맥 폐색 후 카스파제-7 발현을 약리학적으로 차단하는 것으로 나타났다. 이 기술의 성공은 데이터의 일관성, 유효성 및 신뢰성을 보장하기 위해 신중한 조직 준비와 IHC 및 현미경 이미징에 달려 있습니다.
이 방법은 카스파제 신호전달의 반정량적 비교를 위해 웨스턴 블로팅 분석과 결합될 수 있다. 상기 기술은 RVO에서 활성 카스파제-9를 표적화하는 치료적 접근법의 효능을 조사하는 단계를 제공하였다. 이 접근법은 뇌를 포함한 다른 조직에도 적용될 수 있습니다.
