이 방법은 개발 중 생물막 의 성장과 행동 특성에 영향을 미치는 주요 환경 조건을 식별하는 방법과 같은 생물막 개발에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다중 채널, 마이크로 유체 플레이트가 통계적으로 유의한 결과를 빠르게 획득할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 생물막 구조에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 항생제 치료 및 생물 학적 치료에 적용 될 수있다.
일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 투쟁 할 것 이다, 프로토콜및 세심한 기술의 세부 사항에 주의 주의 하기 때문에, 필요 하기 때문에. 소프트웨어에 계측기연결오류가 발생하지 않도록 PC 워크스테이션을 먼저 켜고 형광 모듈을 켭니다. 형광 셔터가 켜졌는지 확인하고 하드웨어 컨트롤러를 켭니다.
다음으로 이미징 시스템 컨트롤러와 CCD 카메라를 켭니다. 그런 다음 이미징 스테이션을 켭니다. 모든 장비가 준비되면 제어 응용 프로그램을 시작하고 플레이트 측면에 있는 레이블에 있는 플레이트 번호를 입력합니다.
프라이밍을 위해 먼저 접시 바닥의 유리 표면을 만지지 않고 포장에서 48 개의 미세 유체 플레이트를 제거하고 렌즈 조직으로 플레이트 바닥에 유리 슬라이드를 청소하십시오. 마이크로 유체 채널을 프라임하기 위해, 피펫 200 마이크로 리터37 섭씨 최소 배지를 출력에 잘, 거품을 피하기 위해 주의. 그런 다음 접시를 플레이트 스테이지에 놓습니다.
에탄올로 인터페이스를 닦아 에탄올이 건조되면 플레이트 스테이지에 밀봉합니다. 제어 모듈의 수동 모드에서는 액체를 37도에서 Luria-Bertani 국물으로 설정하고 최대 투명도는 평방 센티미터당 5 개의 단음으로 설정합니다. 출력 우물을 클릭하여 출력에서 입력으로의 흐름을 활성화하여 채널을 프라임합니다.
5분 후 흐름을 일시 중지하여 시드를 준비하고 스테이지에서 플레이트를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음, 마이크로 유체 채널로 이어지는 내부 원으로부터 배지를 제거하지 않고 출력에서 잔류 배지를 잘 흡인한다. 실험 채널을 시드하려면 최소 배지 300마이크로리터를 입력에 잘 넣고 세균 배양 300마이크로리터를 출력에 잘 첨가합니다.
플레이트를 이미징 스테이지로 돌려보내서 플레이트에 놓기 전에 에탄올로 인터페이스를 닦고 라이브 카메라 피드를 사용하여 단일 채널에 집중합니다. 라이브 피드를 시각적으로 모니터링하는 동안, 약 2 ~4 초 동안 평방 센티미터 당 1 ~ 2 dym에서 흐름을 재개하고, 세포가 실험 채널에 입력할 수 있도록하지만 뱀 채널이 아닌, 1 시간 동안 온도 제어 단계에 플레이트를 두고, 세포가 부착 할 수 있도록. 부착 기간이 끝나면 스테이지에서 플레이트를 조심스럽게 제거하고 채널을 방해하지 않고 출력에서 박테리아를 잘 흡인합니다.
그런 다음 새 파이펫 팁을 사용하여 입력 우물에서 매체를 제거합니다. 소프트웨어에서, 현미경 이미지 수집을 제어하기 위해 다차원 인수를 열고 시간 경과, 다중 단계 위치 및 다중 파장을 선택합니다. 저장 탭에서 간단한 기본 이름을 만들어 파일이 있는 경우 곡어 기본 이름을 선택합니다.
설명에 실험의 필수 세부 사항을 포함합니다. 디렉토리 를 선택하려면 모든 파일이 시간 경과 탭에서 저장되는 폴더를 선택하고 실험 시간의 지속 시간을 24 시간으로 조정하고 실험 전반에 걸쳐 5 분마다 이미지를 획득하는 시간 간격을 설정합니다. 라이브 카메라 피드와 10x 목표를 사용하여 플레이트에 새겨진 채널 번호 위 또는 아래에 있는 채널의 중앙에 초점을 맞추고 스테이지 위치를 설정합니다.
20배 목표로 전환하고 채널 내에서 최적의 시야 영역과 초점 평면을 찾습니다. 그런 다음 새 설정을 사용하여 목록에 스테이지 위치를 추가합니다. 파장 메뉴에서 파장의 수를 3으로 설정하고 첫 번째 파장을 FITC 100% 카메라로 설정하고, 10밀리초 노출 시간으로, 두 번째 파장은 50%카메라로 50%를 표시하고, 노출 시간이 3밀리초이고 세 번째 파장은 모두 닫히므로, 획득 시간 사이의 마지막 채널에는 빛이 남아 있지 않습니다.
자동 실행 편집 메뉴에서 프로토콜 설정 탭을 열고 적절한 실험 전단 속도로 전진 방향으로 흐름이 설정된 24시간 지속 시간으로 새 프로토콜을 설정합니다. 추가 및 저장을 클릭하여 프로토콜을 저장하고 시퀀스 설정 탭을 엽니다. 새로운 시퀀스를 설정하려면 모든 채널의 기본 유체로 Luria-Bertani 국물을 37도에서 선택합니다.
채널 1에서 12까지의 채널에 대한 단계 반복 1에서 첫 번째 실험 전단 속도로 프로토콜을 선택하고 모든 채널을 활성화합니다. 채널 13에서 24까지의 경우 두 번째 실험 전단 속도로 프로토콜을 선택하고 모든 채널을 활성화합니다. 그런 다음 적용 및 저장을 선택하여 시퀀스를 저장하고 AutoRun 메뉴를 열어 AutoRun에 사용할 저장된 시퀀스를 선택합니다.
시간 별 성장 생물막 실험을 설정하려면 최대 1,300마이크로리터의 멸균 최소 배지를 마이크로 유체 플레이트의 입력 웰에 추가하고 플레이트를 이미징 단계로 되돌려 놓습니다. 그런 다음 에탄올로 인터페이스를 닦고 접시를 밀봉합니다. 프로토콜과 시퀀스가 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다.
시작을 선택하고 자동 실행을 시작하고 즉시 클릭하여 현미경 이미지 컬렉션을 시작합니다. 첫 번째 이미지 수집이 끝나면 일시 중지를 클릭하고 밝은 필드 파장에서 라이브 이미지 모드를 선택합니다. 각 스테이지 위치를 보려면 이동을 선택하고 현재로 설정하여 새 설정을 설정합니다.
그런 다음 다음 예약된 인수를 시작하기 전에 이력서를 클릭합니다. 이 대표적인 시간적 생물막 성장 실험에서, 생물막 커버리지 또는 백분율 임계 값 표면적, 전단이 생물막 표면 커버리지에 직접적인 영향을 미쳤음을 나타내는 세 가지 전단 설정 모두에 대해 상이했다. 바이오필름 축적의 총 상대측정은 시간의 함수로서 증가하여 가장 높은 전단 응력에서 가장 낮은 전단 응력으로 성장률이 감소했습니다.
각 조건하에서, 양적 성장률을 계산할 수 있는 기하급수적인 성장의 명확한 기간이 있었습니다. 전반적으로, 모든 전단 조건에서 시간이 지남에 따라 거칠기 계수가 감소하여 모든 생물막 표면이 부드러워졌음을 나타냅니다. 그러나 가장 낮은 전단과 비교하여 전단 설정이 높아져 시간이 지남에 따라 표면이 부드러워져 더 빠른 전단 흐름이 더 부드럽고 균일한 표면에 기여한다는 것을 나타냅니다.
또한, 모든 전단 조건에 대해 시간이 지남에 따라 텍스처 엔트로피 또는 형태의 임의성이 증가했습니다. 이 절차를 수행하는 동안 지정된 시퀀스를 따르고 각 단계를 정확하게 수행하는 데 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 필요한 기술은 마스터하기 위해 몇 가지 실행을 취할 수 있습니다.
이 절차에 따라 HBLC 또는 GCMS와 같은 다른 방법은 포도당과 같은 아직자의 농도에 대한 추가 질문에 응답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 생물막 분야의 연구원들이 통제된 실험 조건과 수치료 샘플링을 통해 일반 흐름 환경을 실시간으로 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. BSL2 세균균과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 보호 장비를 착용하고 적절한 폐기물 프로토콜을 사용하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
