이 프로젝트는 건강 연구의 캐나다 학회 및 앨버타 혁신-건강 솔루션/앨버타 암 재단에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 저자는 그들의 장비, 건물 기초는 슬라이드 스캔은 WHCAS에서 가능 하 게 되었다, 그리고 제품의 창조 자에 폴라 Gedraitis의 일의 사용에 대 한 신경 생물학 핵심 시설에 재생 단위를 인정. 이 문서에서는, 분자 장치 언급.

종양 표본은 프로토콜 로컬 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 및 국가 규정에 따라 실시에 의하여 얻은 했다. WHCAS 및이 문서에서 사용 되는 관련된 소프트웨어 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
1. 가져오기는 저널
<ol><li>관련된 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>재료의 테이블에에서 표시 된 저널 스위트를 다운로드 합니다.</li>
	<li>저널을 향하고 주 메뉴를 클릭 하 여 적절 한 디렉터리에 저널 스위트를 가져오기 가져오기 저널 스위트...,을 선택 하 고 가져오기를 클릭 하.</li>
</ol>2. 만들기 설정 미리 보기에 대 한 검색 인수
<ol><li>플레이트 수집 설정 대화 상자에서 이동 목표 및 카메라 탭 선택 4 배 확대, 카메라 binning으로 1과 2는 이득으로.</li>
	<li>접시-Slidescanning탭 그림 1A 에 설정을 입력 합니다. 참고: 이러한 설정은 사용자 보고 최대 3 슬라이드를 탐색할 수 있도록 개발 되었습니다. 각 슬라이드 쉬운 탐색을 위한 3 인접 한 우물으로 분리 되어 고 '라이브' 조직 조각 또는 셀의 시각화.</li>
	<li>방문 사이트 탭에서 사이트와 우물을 균일 하 게 작성.</li>
	<li>플레이트 하단 설정 편집... 을 클릭 하 고 그림 1B에서 표시 되는 값을 입력.</li>
	<li>인수 루프 탭에서 미리 보기 스캔에 대 한 원하는 파장 (이 예제에서 어떤 핵 얼룩)를 입력 합니다. 최고의 콘트라스트 및 초점 이미지 기반, 밝은 형광 신호 (예를 들어, 자주 핵 얼룩)를 사용 합니다. 참고: 조직 핵 얼룩 같은 밝은 얼룩으로 얼룩이 지기 것이 좋습니다 이후 백그라운드에 비해 높은 콘트라스트를 제공 하는이. 뿐만 아니라 샘플 위치에이 지원 되지만 다음 높은 배율 인수에 하나 이상의 fluorophore 이미징 때 밝은 색상은 다른 색상의 이미징 오프셋을 기준 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>함께 이미지를 플레이트 수집 모드에서 음영 보정 을 사용 합니다.</li>
	<li>A. 설정 이러한 설정을 저장합니다</li>
</ol>3. 고배율에서 슬라이드 인수에 대 한 설정 만들기
<ol><li>플레이트 수집 설정 대화 상자에서 이동 목표 및 카메라 탭 선택 40 X (해상도 대 한 최고의 디지털), 카메라 binning으로 1과 2 (신호 및 이미지의 밝기를 증가)를 이득으로 확대 합니다. 참고: 낮은 객관적인 배율 설정을 사용할 수 있습니다, 하지만 작가 찾을 인간의 microglia 및 다중 파장 셀 득점 모듈을 사용 하 여 뇌 종양 조직에서 세포의 분석에 대 한 최적의 설정 수 X 40.</li>
	<li>접시-Slidescanning 및 편집 판 하단 설정 탭 설정 A와 동일은 모든 설정을 확인 (단계 2 참조).</li>
	<li>얻은 이미지 선명 하 고 있다면, 잘 깊이, 판 높이및 플레이트 하단 설정 조정 초점을 변경할. 초점 문제가 여전히 경우 자동 초점 옵션 섹션 아래 레이저 이미지 복구 를 선택 합니다.</li>
	<li>인수 루프 탭 아래 샘플에 존재 하는 파장의 수를 입력 합니다. 초점 레이저 기반 사용 하 고 (인수 또는 레이저 복구)에 대 한 초점 이미지 기반 사용 옵션을 확인 합니다.</li>
	<li>자동 초점 탭 아래 판과 잘 하단에 초점을 선택 합니다.</li>
	<li>그림 2, 또한 선택 방지 비동기 하드웨어 이동 보장에 표시 된 대로 저널 탭에서 옵션을 선택 합니다.</li>
	<li>이 설정을 설정 B. 저장</li>
</ol>4. Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템에서 슬라이드 배치
<ol><li>주 메뉴를 얻을 수 f 4 를 누릅니다. 검색 슬라이드를 선택 합니다. 오픈도어-추출 슬라이드를 클릭 하 고 슬라이드와 슬라이드 어댑터 (에 최대 3 개의 슬라이드를 저장할 수 있는) WHCAS (그림 3A 와 3B)에 삽입. 슬라이드 아래로 향하게 하는 coverslip와 슬라이드 어댑터 (그림 3A)에 노치 측면 라벨 동양. 참고:이 실험에서 사용 하는 슬라이드 1 mm 슬라이드 x 75 x 표준 25 했다.</li>
	<li>닫기 문-부하 슬라이드를클릭 하십시오.</li>
</ol>5. 미리 보기 스캔을 획득
<ol><li>상영 제목 아래 플레이트 수집 및 제어... 및 플레이트 수집 설치... 선택 하 고 설정 a. 로드</li>
	<li>방문에 웰 스 탭 필요는 잘 포함 하는 샘플을 마우스 오른쪽 클릭 버튼을 사용 하 여 이동 합니다. 셀 위치까지 방문 하는 사이트 탭 아래 라이브 이미지 캡처 다른 사이트로 이동 합니다. 수동으로 샘플에 집중 하거나 자동 초점을 사용 합니다. 캡처 이미지를 스냅 을 사용 합니다. 참고: 샘플 잘 사이트를 피팅 하 여 더 많은 사이트와 찾을 수 쉽습니다 (단계 2.3 참조).</li>
	<li>메인 메뉴에서 미리 보기 슬라이드를 선택 합니다.</li>
	<li>자동으로 팝업 되는 대화 상자에서 스캔 하려고 얼마나 많은 슬라이드를 반영 하는 옵션을 선택 합니다. 한 번에 한 슬라이드를 스캔 합니다. 확인키를 누릅니다. 4 X 배율을 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. (0.17 m m) 아래로 Coverslip 슬라이드 방향 (사용 정정 고리 다른 coverslip 두께 사용 하는 경우) 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. 계속을 클릭 합니다. 참고: 사용자가 2 이상의 슬라이드 미리 보기 스캔을 취득 하고자 하는 경우 각 미리 보기 스캔 해당 고배율 이미지의 인수 전에 개별적으로 열 수 있다.</li>
	<li>부하 검사 슬라이드 설정, 수집 설정 및 교정 상자 체크 확인. 취소를 누릅니다. 검색 슬라이드 설정 상자가 다시 나타납니다, 계속을 선택 합니다.</li>
	<li>슬라이드 스캔 대화 상자가 나타나면 그림 4A-4 C에 제안 하는 대로 설정을 조정 합니다. 가까운 완료를 선택 합니다. 참고: 카메라 binning 및 감소 하는 카메라의 노출 시간을 증가 발생 합니다 빠른 스캔, 이기는 하지만 낮은 디지털 해상도 동적 범위에서 각각, 그러므로 감소 이미지 품질. 음영 보정 보기의 단일 필드에 걸쳐 균일 한 강도 보장 합니다. 하드웨어 및 이미지 자동 설정 검색 초점에서 이지만 스캔 속도 보장 됩니다. 시간을 절약, 관심 낮은 확대 검사를 취득 하는 동안 수정 및 하드웨어 및 이미지 자동 초점에서 음영을 하지만이 옵션을 켜 6 단계에 대 한 높은 확대 이미징 동안 것이 좋습니다. 낮은 확대 스캔의 해상도 높은 확대 스캔의 해상도 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>데이터를 검색 하는 슬라이드에 대 한 디렉터리를 선택 합니다. 확인을 클릭 합니다. 파일에 대 한 이름을 입력 합니다. 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>그리기 영역 대화 상자가 자동으로 표시 됩니다. 사각형 영역 도구 (그림 5A)를 사용 하 여 그림 5B와 같이 전체 미리 보기 스캔 영역을 선택. 계속을 클릭 합니다.</li>
	<li>설치 완료 대화 상자가 표시 됩니다. 계속을 선택 합니다. 참고: 미리 보기 슬라이드 스캔 지금 시작 됩니다.</li>
	<li>미리 보기가 완료 되 면 스캔 완료 대화 상자가 나타납니다. 계속을 선택 합니다. 미리 보기 검색 창을 닫지 마십시오 (이 예에서 DAPI 스캔 창; 그림 6참조). 참고: 설치 및 낮은 확대 스캔 수집 과정 약 20 분 소요 됩니다. 이후 높은 확대 이미지 수집 시간이 각 채널에 대 한 노출 시간 뿐만 아니라 선택 하는 사이트의 수에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>6. 높은 확대 검사
<ol><li>B. 설정 로드</li>
	<li>어느 우물이 이미지 수를 확인 합니다. 방문에 웰 스 탭 필요는 잘 포함 하는 샘플을 마우스 오른쪽 클릭 버튼을 사용 하 여 이동 합니다. 참고: 기술 1 잘 이미징 의해 여기 증명 됩니다.</li>
	<li>세포 나 조직 때까지 방문 사이트 탭 아래 라이브 기능으로 다른 사이트로 이동 합니다. 수동으로 샘플에 집중 하거나 자동 초점을 사용 합니다. 캡처 이미지를 스냅 을 사용 합니다. 참고: 높은 확대에 샘플을 찾기에 투입, 자동 초점 없는 경우 샘플을 찾을 수 100 µ m에 어디에서 든 지 5 단계 크기를 조정 하려면 플레이트 수집 및 제어 대화 상자를 사용 합니다.</li>
	<li>W1 DAPI 탭에서 자동 노출클릭 합니다. 플레이트 수집 스냅-DAPI 이미지는 선명 하 고 확인 합니다.</li>
	<li>주 메뉴에서 풀-다운을 저널 에 클릭 합니다. 저널... 실행을 선택 합니다.</li>
	<li>그것을 발사 지역 수집 설정 슬라이드 저널에 두 번 누릅니다. 설치 슬라이드 영역 인수 대화 상자가 나타나면 계속을 선택 합니다.</li>
	<li>때, 제대로 된 DAPI 스캔 낮은 배율 슬라이드 이미지를 선택 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. 마찬가지로, 강조 플레이트 수집 스냅-DAPI 플레이트 수집 스냅인에 대 한 질문. 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>만들기 또는 부하 영역 상자가 나타나면 DAPI 스캔 (그림 6)의 (a) 지구를 선택 하는 사각형 영역 도구를 사용 합니다. 계속을 누릅니다. 참고: 40 X에서 선택할 수 있는 최대 영역 35 행 45 열입니다. 관심의 여러 영역을 선택 하는 경우 큰 영역 상자 영역 크기가 조정 됩니다. 상자는 크기 위치 될 수 있습니다.</li>
	<li>로드 영역 대화 상자에서 아니요 를 선택 합니다. 참고: 선택 예 부하 이전 슬라이드의 일괄 처리에 대 한 지역으로 저장 관심 위치의 동일한 지역.</li>
	<li>로케이터 도구를 사용 하 여 관심의 가장 큰 영역을 강조 표시 하 고 선택 영역 대화 상자에서 계속 을 누릅니다. 확인 지역 상자가 나타나면 계속을 선택 합니다. 지역 영역 저장 대화 상자가 나타나면 저장 해야 하는지 여부를 결정 합니다.</li>
	<li>사이트 간격, 다음 대화 상자를 사용 하면 Tiled, 오버랩, 또는 10% 중복이미지를 선택할 수 있습니다. 옵션을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다. 저자 Tiled선택 했다.</li>
	<li>세 개의 대화 상자는 이제 표시 됩니다. 계속을 눌러 설치 완료 상자를 해산 수 있습니다. 뜨고 40 X에 대 한 수집 사이트 설정 상자 (그림 7A) 지금 그것은 명확 얼마나 많은 열 및 행 (그림 7B) 플레이트 수집 설정 상자에 입력 하는 데 필요한 이후. 뜨고 표시 되는 WellPositions 상자 (그림 ℃) 왼쪽 아래 모서리에는 화상의 동안.</li>
	<li>플레이트 수집 설정 상자의 방문 하 웰 스, 이전에 선택한 관심의 영역으로 우물의 동일한 수 있어야 합니다 (그림 7D)을 강조 했다. 참고: 저자 슬라이드 당 관심의 9 개 지역 중 최대이 프로토콜을 개발. 더 많은 경우, 단순히 열 또는 관심 영역 수를 반영 하기 위해 플레이트-SlideScanning 탭 행의 수를 늘립니다. 이러한 웰 스 공간 어떤 식으로든에서 관심 영역의 위치를 대표 하지 않는다 하지만 적절 한 번호 강조 (왼쪽) 해야 합니다.</li>
	<li>플레이트 수집 설정 상자에서 방문 하는 사이트 탭 이동 제안된 열과 행 (그림 7B)을 입력 합니다. 타일 사이트클릭 하 여 기억 하십시오.</li>
	<li>샘플을 포함 하는 사이트를 찾는의 추측을 제거 하려면 미리 선택 된 관심 영역에서 무대를 요약 탭 아래 취득 접시 를 누릅니다. 일단 카메라는 셀을 포함 하는 사이트를 통해 팬, 누르십시오 취소 이미지 수집을 중지 하려면 오른쪽 하단 모서리에서. 무대는 이제 확인 샘플에 위치 하 고 있습니다.</li>
	<li>초점과 높은 동적 범위 이미지 획득은 파장 설정을 최적화 합니다. 만족, 요약 탭 및 취득 접시에서 클릭 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석
<ol><li>원하는 사용자 지정 모듈을 선택 합니다. 참고: 저자는 뇌 종양 슬라이드의 자동된 분할을 보여 주기 위해 다중 파장 셀 득점 모듈을 선택 했다.</li>
	<li>모든 사이트에서 분석을 실행 합니다. 분석 매개 변수가 많은 슬라이드 같은 경우, 분석 게시물 수집 탭 플레이트 수집 설정 상자에 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>분석 완료 되 면 결과 편견을 하지 가난한 이미지 품질의 사이트를 제외 합니다. 이 분석의 목표 microglia 및 세포 종양 실질에 계량 하기 때문에, 종양 샘플의 가장자리에서 관심 영역을 선택 합니다. 또한, 초점 및/또는 조직 주름 또는 거품과 조직에서 눈물을 포함 하는 사이트를 제외 합니다. 데모를 위해 대표 결과참조 하십시오. 또는, 어떤 사이트는 제외 임계값 아래 레이저 반사의 진폭에 따라 각 사이트에 대해 생성 된 레이저 초점 점수 를 사용 하 여 (임계값은 사용자 정의 및 노출 시간 등에 따라와 사용 되는 매체 형식)입니다. 참고: 높은 확대 이미지 가능 하 게 특별히 필요한 경우 구조, 큰 혈관의 괴 사, 지역 등을 제외 하. 그것은 또한 hypercellular는 하는 관심 영역만 포함 하도록 가능입니다. 이러한 방법으로, 특이성 및 분석의 정확성 증가 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+positional+biosensor+screening+assay+for+compounds+to+prevent+or+disrupt+androgen+receptor+and+transcriptional+intermediary+factor+2+protein-protein+interactions.">High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).</li><li>Rishal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WIS-NeuroMath+enables+versatile+high+throughput+analyses+of+neuronal+processes.">WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes.</a> Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).</li><li>Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+changes+in+axon+length+using+transgenic+zebrafish+embryos.">In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos.</a> Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).</li><li>Schurmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+illumina+gene+expression+microarray+data+from+different+tissues:+methodological+aspects+of+data+analysis+in+the+MetaXpress+Consortium.">Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).</li><li>Bravo-San Pedro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+GFP-LC3++dots+by+automated+fluorescence+microscopy.">High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).</li><li>Varga, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multichannel+fluorescent+whole+slide+imaging+and+its+application+for+cytometry.">Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).</li><li>Narayan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fibrinogen+extravasation+into+Alzheimer's+disease+brain+using+high-content+screening+of+brain+tissue+microarrays.">Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).</li><li>Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantitative+analysis+of+apoptosis+of+Chinese+hamster+ovary+cells+from+fluorescence+microscopy+images.">Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images.</a> Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).</li><li>Mueller, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+segmentation+of+fluorescence+microscopy+images+of+heterogeneous+tissue:+application+to+the+detection+of+residual+disease+in+tumor+margins.">Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins.</a> PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).</li><li>Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+method+for+quantifying+macrophages+in+different+experimental+models+of+central+nervous+system+pathology.">An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).</li><li>Kozlowski, C., Weimer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+quantify+microglia+morphology+and+application+to+monitor+activation+state+longitudinally+in+vivo.">An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).</li><li>Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+segmentation+methodology+for+quantifying+immunoreactive+puncta+number+and+fluorescence+intensity+in+tissue+sections.">An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections.</a> Brain Research. 1240, 62-72 (2008).</li><li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research.">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li></ol>

저자가이 원고에 설명 된 제품에 아무런 재정적 이익을 있고 아무것도 공개.

생물 과학 연구의 효율성을 방해한 일반적인 문제 아직도 붙일 표시 된 조직의 정확, 공평 하 고 정확한 정량화 및 그들의 구조에 대 한 프로토콜의 개발 이다. 상당한 양의 시간과 노력을 그들은 몇 군데 있다 일단 조직 슬라이드를 분석 하는 방법을 찾는 쪽으로 이동 합니다. 많은 기존의 방법 프로그램12,13,14에서 다시 사용자에 대 한 알고리즘을 제공 합니다. 이러한 메서드는 수락 가능 하다, 하지만이 보고서의 의미는 그것 쉽고 빠르게 설정 하는 전체적인 이미지 수집 및 분석 프로토콜 사용자가는 WHCAS에 액세스 하는 경우 사용자 수 있습니다. 종류를 구분 하 고 여러 구조와 프로세스, 세포 주기 분석, 및 핵 전 좌, 계량 분석 예를 들어 이미 관련된 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다.
설치 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. 첫째, 접시에 마치 슬라이드의 공간 매개 변수 정의 됩니다. 둘째, 낮은 배율 개요 검사는 관심 영역 높은 확대 이미징 선택으로 만들어집니다. 마지막으로, 정확도 및 후속 분석의 정밀도 영향을 주는 사이트는 제외 됩니다. 이 기술의 가장 큰 한계는 그것의 적용에 따라는 사용자가는 WHCAS에 액세스할 경우 이다. 그러나, 하이 콘텐츠 분석 시스템을 위한 증가 필요와 많은 기관 제공 하는 이러한 경쟁15에 남아 그들의 연구원에 게. 문제 해결은 가장 일반적으로 때 필요 조직 단면도 동일한 두께 필요가 없습니다. 다른 사람 하지 것입니다 동안 관심의 여러 영역을 선택 하는 경우 일부 초점에 있을 것입니다. 이상적으로, 단면, 하는 동안 사용자 다룰 것입니다 균질 견본을 만드는. 그러나, 샘플 일치 하지 않는 경우 집중 하는 데 사용 되는 핵 얼룩 파장 (또는 사용자의 밝은 fluorophore)에 초점을 맞추고 수 수 재조정 관심 각 밖의 초점 영역에 대 한 및 보기의 각 필드에 대 한도. 로 다른 파장은 단순히 핵 얼룩 파장에서 오프셋만이 파장 재조정을 해야 합니다.
이 보고서에서 우리는 검사 하 고 WHCAS 및 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 슬라이드를 분석 하는 방법을 선발. 다중 파장 셀 득점 모듈을 사용 하면 어떤 핵 또는 세포질 마커를 붙일 레이블이 자동으로 계산 수 있습니다. 초점 설정을 조정 하 고 너비와 몇 군데 조직에 모듈을 사용자 지정 하는 지역 등 세포 특성 정의 후 더 이상 이미지 슬라이드와 양적 데이터를 사용자의 개입에 대 한 필요는. 최대 3 개의 슬라이드를 한 번에 몇 군데 수 있다 하 고 관심의 여러 영역을 정의할 수 있습니다. WHCAS 사용자가 슬라이드를 분석 하는 데 필요한 활용 사용자 정의 다목적,이 프로토콜 사용 하면 자동 워크플로 좀 더 최적화를 요구 하 고 미래에 조직의 조직학 분석을 포함 하는 모든 프로젝트에 적용할 수 있습니다.

슬라이드에 붙일 레이블 조직의 정확 하 고 정밀한 정량 많은 과학 분야에서 매우 인기 있는 기술입니다. 그러나, 연구원은 자주 수동으로 계산 표본 또는이 비 자동화 된 기법을 개발 하는 시간의 상당한 금액을 지출. 여기, 우리는 자동된 슬라이드 스캔 및 예를 들어 냉동된 인간 두뇌 종양 섹션에 타고 난 면역 세포는 WHCAS 및 그 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 셀의 정량에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 셀 유형1,2,3,,45, 의 세 neurite 결과에서 기본 제공 사용자 정의 모듈의 넓은 범위를 제공 하는 관련된 소프트웨어 6.이 방법의 목표의 이미지와 슬라이드 마운트 어떤 조직에 놓여있는지 표시 된 엔터티를 quantitate 시작 완료, 쉽게 재현할 수 프로토콜 연구를 제공 하는.
이 프로토콜에는 WHCAS 주로 슬라이드 어댑터와 기본 슬라이드 스캔7 에 사용할 수 있었던 비록 후속 분석 관련된 소프트웨어에 대 한 번호판을 이미징 사용 됩니다. 그것은 수집 지역, 해당 저널의 선택, 맞춤형된 로드의 창조와 제품 담당자와 연락의 주의 공간 교정 필요 했다 때문에 이미지 슬라이드를 금지 했다. 문학, 전용된 슬라이드 이미징 및 분석 기구8, 구입 하는 대신 넓은 본문에이 소프트웨어에 액세스할 수 있는 이전 기술 보고서 WHCAS 전부9슬라이드 이미지 수집을 피할. 이미지 수집 또는 이미지 분석을 수행 하는 다른 플랫폼에서 각각 다른와 호환은 보장 하기 위해 추가 작업을 필요로 합니다.
이미지 캡처는 WHCAS 및 그것의 소프트웨어를 사용 하는 기능에 대 한 검색 또는 이러한 도구를 워크플로 외국인 개발의 불필요 한 합병증을 피할 것 이다. 이 문서에서는, 접시,으로 슬라이드 하 여 낮은 확대 개요 검사 및 해당 고배율 이미지를 만드는 데 필요한 단계 및 다중 파장 셀 득점 세그먼트 모듈을 사용 하 여 후속 분석을 허용 합니다 WHCAS의 재사용. 이 쉽게 사용할 수 프로토콜 알고리즘 또는 다단계 세 프로토콜10,11 을 개발 하는 일단 이미지는 WHCAS에 인수는 필요가 없기 때문에 다른 기술에 비해 우위를 제공 합니다. 이 프로토콜 정량 기법을 최적화 하는 데 필요한 시간을 줄입니다, 더 정확 하 게12 와 수동 계산 보다 효율적인는 WHCAS의 사용을 극대화. 이 프로토콜 사용할 수 있습니다 광범위 하 고 쉽게 영상 및 슬라이드에 어떤 붙일 라는 조직의 분석 수 있습니다 이후.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1640">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">ImageXpress MicroXLS</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td style="width:1087px;">Apparatus for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">MetaXpress 5.1</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide adapter</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&#38;highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Select this journal in Step 6.6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system

슬라이드 검색 자동화 되 고 붙일 라는 조직의 세분화는 전체 슬라이드 또는 큰 조직 단면도 분석 하는 가장 효율적인 방법. 불행히도, 많은 연구원은 다량 시간 및 자원을 개발 하 고 그들의 자신의 실험 관련만 되는 워크플로 최적화의 지출. 이 문서에서 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)에 대 한 액세스와 함께 그 어떤 슬라이드 마운트 조직, 관련된 소프트웨어에 미리 모듈 내에서 사용자 지정에 대 한 옵션으로 이미지를 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 원래 슬라이드 스캔을 위한,이 문서에 자세히 설명 하는 단계 슬라이드 관련된 소프트웨어로 가져올 수 있는 WHCAS에서 이미지 스캔을 취득 가능 합니다. 이 예제에서는 뇌 종양 슬라이드의 자동된 분할 설명 된다, 그러나 마커의 모든 붙일 표시 된 핵 또는 세포질 자동된 분할 가능 하다. 또한, 단백질 지역화/전, 세포질 확산/생존/apoptosis, 및 실행할 수 있는 신생에 대 한 분석을 포함 한 다른 양적 소프트웨어 모듈의 다양 한이 있다. 이 기술은 연구원은 시간 및 노력을 저장 하 고 슬라이드 분석을 위한 자동화 프로토콜을 만듭니다.

WHCAS 소프트웨어 내에서 이미지를 볼 수 있습니다. 그림 8 의 정의 된 영역 내에서 모든 사이트의 높은 확대 축소판을 보여줍니다. (예제 표시 됩니다 그림 8 및 그림 9에서 낮은 확대율에서 각각) 분석에서 제외 해야 하는 것 들을 식별 하기 위해 각 사이트를 검토 합니다. 예를 들어 사이트 149 초점 (그림 9A), 사이트 219는 거품 (그림 9B) 이며 사이트 54 배 (그림 9C)를 포함 하 고 제외 해야 합니다. 이미지가 포함 된 모든 사이트의 10-15%를 제외 일반적입니다. 제공 된 예제에서 사이트의 15.3% 제외 (25/300 거품, 17/300 초점 있었다, 3/300은 접혀 있었고 1/300 가장자리에). 그림 10A는 대표 이미지 분석 (해당 낮은 확대 축소판 그림 8에 표시 됩니다)에 대 한 선택. 여기, 다중 파장 셀 득점 모듈에 의해 생성 된 해당 오버레이 사이트 59, 작성자의 사양에 맞게 사용자 지정에서 수행 하는 자동화 된 세분화의 결과 보여 줍니다 (핵 최소 폭 2.5 µ m, 최대 너비 = = 7.5 µ m, 그리고 로컬 배경 위의 강도 = 35 graylevels; CD11b-긍정적인 세포의 최소 폭 4 µ m, 최대 너비 = = 18 µ m, 최소 스테인드 영역 15 µ m2와 지역 배경 위의 강도 = = 310 graylevels; CD45-긍정적인 세포의 최소 폭 4 µ m, 최대 너비 = = 18 µ m, 최소 스테인드 영역 15 µ m2와 지역 배경 위의 강도 = 50 graylevels =). 따라 세분화, 각 표식에 대 한 긍정적인 얼룩이 지는 세포의 비율의 양적 데이터 (6.2 ± 5.1% 및 3.8 ± 2.1 %CD11b+ 및 CD45+ 세포, 각각), 두 마커 (3.5 ± 2.1 %CD11b+CD45+ 셀), 아무 표식 (86.6 ± 9.0 %CD11b-CD45- 세포; 그림 10B) 스테인드 지역 평균 (40.0 ± 9.2 µ m 및 CD11b의 36.7 ± 7.6 µ m+ 및 CD45+ 세포, 각각; 그림 10C) 형광 강도 의미 하 고 (408.9 ± 40.3 상대 형광 수량과 373.9 ± 38.1 상대 형광 CD11b의+ 및 CD45+ 세포, 각각; 그림 10) 얻을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> 그림 1: 낮은 확대율에서 슬라이드 인수에 대 한 설정. A.이 이미지는 접시 설정이 표시 됩니다. B. 여기, 플레이트 하단 설정이 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> 그림 2: 높은 배율 슬라이드 인수에 대 한 설정. 이 그림에는 적절 한 저널의 선택 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> 그림 3: 슬라이드 어댑터를 사용 하 여 슬라이드를 로드 하는 방법의 데모. A. 슬라이드 아래로 슬라이드 어댑터 노치 측면 레이블 coverslip을 배치 됩니다. B. 슬라이드 어댑터 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템에 로드 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> 그림 4: 미리 보기 슬라이드 설정. A.이 그림 인수에 대 한 매개 변수를 표시 합니다. B. 여기, Hoescht/DAPI 파장 설정에 대 한 값이 표시 됩니다. C.이 이미지 저널 설정을 보여 줍니다. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> 그림 5: 슬라이드 영역 그리기. A. 사각형 영역 도구 (다른 그리기 도구를 사용할 수 없습니다.) 미리 보기 스캔 영역을 선택한 DAPI 스캔에 관심 영역을 생성 하는 데 사용. B.이 그림에서 청록 개요 (를 포함 하 여 라벨) 슬라이드의 전체 영역을 선택 해야 합니다 방법을 보여 줍니다. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> 그림 6: 미리 보기 스캔에 관심 영역 만들기. 미리 보기 또는 DAPI 스캔 전체 슬라이드 영역을 나타냅니다. 이 예제에서 3 개의 직렬 뇌 조직 섹션 (단단한 흰색 사각형 윤곽선)이 있다. 이러한 섹션 위의 영역 슬라이드에 원형 레이블을 나타냅니다. 다른 섹션 준비는 이후 다양 한 관심 영역을 제한 하지 것입니다. 이 특정 예제에서 관심 영역 점선된 흰색 사각형 윤곽선으로 표시 됩니다. scalebar = 1 m m. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> 그림 7: 높은 확대에 대 한 필수적인 윈도우 이미지 수집. A. 수집 사이트 설치 창이 표시 됩니다 얼마나 많은 열과 행의 지구 내. B. 열 정확한 수를 확인 그림 7A 에 표시 된 행 플레이트 수집 설정 상자에 입력 하 고 사이트 타일. C. 뜨고 WellPositions 윈도우 이미지 수집 동안 공백에 불구 필요가 있다. D. 적절 한 수의 관심 영역을 강조 해야 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> 그림 8: 관심 영역의 대표 이미지. 각 사이트는 관심의 영역의 복합 축소판에 표시할 수 있습니다. (빨간 상자 표시)는 제외 된 대표 사이트와 (녹색 상자 표시)는 포함 된 사이트의 예를 들어 더 높은 확대에 표시 됩니다. 그것은 분석에 대 한 충분 한 품질의 보장 하기 위해 각 사이트를 검토 하는 것이 좋습니다. scalebar = 1 m m. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> 그림 9: 분석에서 제외 해야 하는 사이트의 예. A. 인간 두뇌 종양 섹션 있다 되었습니다 스테인드 CD45 (빨간색), CD11b (녹색)와 microglia 및 대 식 세포의 표식. 이 이미지 초점 고 분석에서 제외 되었습니다. B. 거품은 최종 분석에서 제외 된이 이미지에 존재. C. 이 사이트는 조직에서 배 때문에 분석에서 제외 했다. 스케일 바는 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> 그림 10: 대표 이미지 및 분석. A. 각 이미지 오버레이 자동된 분할의 결과 나타내는 옆에 표시 됩니다. 오버레이에서 핵 화이트에 표시 됩니다 하 고 긍정적으로 얼룩진된 셀 CD45에 대 한 CD11b 및 빨간 녹색에 표시 됩니다. 후에 분석에서 부적절 한 품질의 사이트를 제외 하 고 모든 나머지 사이트, B의 결과 결합. 각 표식에 대 한 긍정적인 얼룩이 지 고 공동 두 마커, C에 대 한 분류는 각 사이트에 있는 셀의 총 수의 평균 비율. 평균 스테인드 영역 및 D. 평균 셀 강도 그래픽으로 표현 됩니다. RFU = 상대 형광 단위. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현 됩니다. 스케일 바는 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System at JoVE.com

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

automated-slide-scanning-segmentation-fluorescently-labeled-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K 조회수.  University of Calgary. 여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

비디오: Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

연구

생체공학

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

의 체계적인 분석<em&gt; 체외</em멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용하여&gt; 셀 롤링

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...