단일 분자 FRET는 리보소말 단백질 생합성 공정에 적합한 척도인 나노미터 거리에서 일어나는 역학을 포착할 수 있습니다. 리보솜은 본질적으로 불균일한 여러 요인과 구성 요소를 알로스터디 조정하여 작동합니다. 단일 분자 방법은 이러한 불합종 평균 효과에 의해 제한되지 않고 각 리보솜을 추적할 수 있다.
이 방법은 항생제가 약물 내성 세균 성 감염을 향해 새로운 약을 개발하는 리보솜 기능을 억제하는 방법을 공개합니다. 시작 EFTU, NOG 및 PAG 믹스를 섭씨 37도에서 2분간 1대2로 혼합하여 PRE를 준비한다. 인큐베이션 후, 1.1 대구 쿠션 초원심분리를 100회, 000배 G.Prepare를 사용하여 PRE를 정화하여 개시 EFTU, WG 및 PHE 믹스를 섭씨 37도에서 1대 2-2의 비율로 혼합하여 10분간 준비한다.
인큐베이션 후, 1.1 대구 쿠션 초심분리기를 100배, 000배 G.Clean을 사용하여 직경 1mm, 지름 1.5개, 현미경 1.5마이크로스코프 글래스 커버립을 함유한 현미경 유리 슬라이드를 1.1회 정화한다. 깨끗한 슬라이드와 커버립을 섭씨 300도에서 3시간 동안 굽은 다음, 커버슬립을 아미노셀린으로 코팅합니다. 깨끗한 라미나르 후드에 뚜껑을 평평하게 놓습니다.
조심스럽게 상단 가장자리에 PEG 솔루션의 60 마이크로 리터를 드롭 한 다음 그 위에 또 다른 커버 슬립을 배치, 모세관 효과는 거품이 형성되지 않도록 그들 사이에 솔루션을 확산시키는. 두 쌍의 커버립에 대해 다음 단계를 반복합니다. 이 커버립을 물로 가득 찬 빈 팁 상자에 보관하고 어둠 속에서 3 시간 동안 배양하십시오.
3시간 후, 커버립을 분리하고, 3회 연속 도가니로 물로 헹구고, 건조한 질소 스트림으로 숙청한다. 유리 슬라이드의 구멍을 통해 날카로운 파이펫 팁을 당겨 단단히 맞을 때까지 당깁니다. 날카로운 끝을 유리 표면으로 완전히 평평해질 때까지 긁어낸 다음 채널 패턴이 있는 양면 테이프를 잘라냅니다.
평평한 쪽의 유리 슬라이드에 붙입니다. 코팅된 커버슬립을 더블 페이스 테이프에 붙이고 눌러 샘플 챔버의 단단한 씰을 만들어 코팅된 면이 안쪽으로 향하고 있는지 확인합니다. 컴퓨터와 현미경 스위치를 켭니다.
레이저 제어 인터페이스를 시작하고 레이저를 켭니다. 레이저 제어 상자의 사용 버튼을 눌러 레이저를 따뜻하게 합니다. 카메라를 켜고 현미경 관련 소프트웨어 프로그램을 시작합니다.
상단 셔터를 클릭하고 램프를 클릭합니다. TAM10 버퍼의 1밀리리터에 5%Tween-20의 10마이크로리터를 추가하여 Tween 버퍼로 TAM10을 준비합니다. 작은 미세 원심 분리기 튜브에 포도당 산화제 3 밀리그램을 계량하여 탈옥 용액을 준비하고 45 마이크로리터의 카탈라아제를 추가하십시오.
고체를 용해하기 위해 튜브를 부드럽게 소용돌이시다. 마이크로 센트심분리기에서 20, 000회 G로 1분간 회전하고 상수체를 복용합니다. 텍스트 원고의 지침에 따라 30%의 포도당 용액, 200 밀리머 트롤록스 용액 및 스트렙타비딘 용액의 밀리리터 당 0.5 밀리그램을 준비하십시오.
잔디 목표에 이미징 오일 한 방울을 추가합니다. 샘플 챔버를 목표에 넣습니다. 챔버를 10 마이크로리터의 스트렙타비딘 용액으로 채우고 1분 동안 기다립니다.
Tween 버퍼로 TAM10의 30 마이크로 리터로 챔버를 세척하여 접힌 필터 용지로 런스루 솔루션을 수집합니다. 세탁 후 1분 동안 기다립니다. 트웬 버퍼를 사용하여 TAM10을 사용하여 리보솜 복합체 PRE 또는 POST를 10-15 나노몰라 농도로 희석시.
리보솜 샘플 20마이크로리터를 채널에 적재하고 2분 동안 기다립니다. TAM10 버퍼 50 마이크로리터와 각각 0.5 마이크로리터의 탈옥포도당 및 트록스 용액을 사용하여 이미징 버퍼를 만듭니다. 잘 섞어.
이미징 버퍼의 30 밀리리터로 챔버를 플러시하십시오. 이미지를 수집하기 위해 카메라를 설정합니다. 상단 셔터를 켜고 램프가 꺼져 있습니다.
카메라 수집을 시작하고 두 개의 개별 카메라와 오버레이를 나타내는 세 개의 창으로 이미지를 확산합니다. 획득 메뉴에서 캡처 타임랩스를 선택한 다음 캡처를 자동으로 클릭합니다. 적절한 파일 이름, 파일 경로 및 루프 수를 설정하고 지금 실행을 클릭합니다.
이미지 수집이 완료되면 팝업 창을 닫은 다음 획득한 ND 파일을 엽니다. ROI, 간단한 ROI 편집기와 옵션 원을 선택합니다. 이미지에서 ROI를 선택하고 완료되면 마무리를 클릭합니다.
측정, 시간 측정을 클릭하여 데이터를 플롯 또는 스프레드시트로 표시합니다. 내보내기 탭을 열어 내보내기 매개 변수를 설정한 다음 내보내기를 클릭하여 강도를 저장합니다. 마지막으로 적합한 응용 프로그램을 사용하여 내보낸 파일을 엽니다.
L27 라벨링 잔류물에서 A-사이트 또는 P-site tRNA에 대한 거리는 각각 61 또는 52 angstrom이며, FRET 효율은 0.47 및 0.65에 해당한다. 기증자 및 수락자 채널의 플로레시세스 강도는 타임랩스로 검색되고 플롯되었습니다. 기증자 표백 후, 두 흔적은 수용자에서 직접 발생 할 수 없기 때문에 기준선에 접근했다.
수용자 표백 후, 더 적은 반응 통로가 흥분 에너지를 발산하기 때문에 기증자 의 강도가 증가했습니다. 개별 리보솜은 L27에 거리 변동을 일으키는 원인이 된 tRNA의 흔들리는 운동 때문에 다른 변동을 전시했습니다. Puromycin 분석, 분석, 발가락 인쇄 분석 및 질량 사양과 같은 다른 방법은 단일 분자 FRET 방법에 무료이며 단백질 합성에 대한 자세한 내용을 공개합니다.
단일 분자 FRET는 많은 생물학적 과정이 나노미터 범위와 밀리초 시간 척도에서 발생하기 때문에 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 적절한 위치에 적절한 염료를 태그하면 다른 많은 역학이 드러날 수 있습니다.
