이 프로토콜은 동시에 세포 성장에 미치는 영향에 대한 수백 개의 화합물을 선별하기 위해 두 개의 분석서를 사용하는 빠르고 효율적인 전략을 제공합니다. 이 약제는 특정 화합물이 세포 독성인지, 세포 성장을 억제하거나, 세포 성장을 향상시키는지에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 두 가지 아세서를 함께 활용함으로써 정확도를 높이고 세포 독성 화합물을 식별할 수 있습니다.
두 개의 아세의 결과가 분기하는 경우,이 전략은 우리가 다른 방법으로 더 검사 할 수있는 세포 기능에 고유 한 효과화합물을 식별 할 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 빠르고 저렴하며 비노동 집약적이라는 것입니다. 일단 마스터, 그것은 연구원 쉽게 최대의 기본 화면을 수행 할 수 있습니다 200 일주일에 화합물, 다음에 철저한 용량 응답 곡선을 수행 10 받는 사람 15 다른 주에 화합물.
절차를 시연하는 것은 나 자신과 로히니 Manickam, 실험실에서 직원 과학자 및 포스트 baccalaureate 동료가 될 것입니다. 첫째, 생물학적 안전 캐비닛에서, 배양 세포는 분석을 시작할 때 적어도 80%의 컨실수가 될 수 있도록 NSC 매체를 가진 T75 플라스크에 있는. 그리고 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.
세포가 80%에 도달하면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 NSC 배지에서 흡인합니다. 세포 해리 시약 3 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에서 5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 플라스크에 NSC 배지 7밀리리터를 넣고 파이펫을 적극적으로 추가하여 모든 세포가 분리되도록 합니다.
해리된 세포 용액을 15밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 200배 G로 전달합니다. 튜브에서 상체를 제거하고 NSC 배지의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 자동 세포 카운터 또는 혈혈계를 사용하여 세포를 계산하고, 튜브에 NSC 배지를 추가하여 밀리리터당 200, 000 세포로 세포의 농도를 재조정합니다.
이어서, 세포외 매트릭스에 의해 코팅된 3개의 96웰 플레이트의 60개의 내부 우물에서 열로 셀 혼합물 컬럼의 100 마이크로리터를 플레이트에 8채널 멀티채널 파이펫터의 8개의 슬롯 중 6개를 이용하여. 세포가 없는 모든 웰에 100마이크로리터의 베이스 배지 또는 NSC 배지를 추가하여 세포를 포함하는 가장 바깥쪽 우물에서 잠재적인 증발을 최소화합니다. 세포 배양 현미경하에서, 세포가 예상된 밀도에 앉는다는 것을 확인하기 위하여 3개의 96의 우물 각각에 적어도 10개의 우물을 육안으로 검사합니다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 분리 후 16내지 24시간 인큐베이터에서 세포 배양판을 제거하고 8개의 멀티웰 피펫을 사용하여 8개의 채널 멀티웰 피펫기로 열별로 NSC 중간 열을 흡인하고, 8개의 다중 웰 슬롯 중 6개만 사용한다. 복제 플레이트 3개 의 각 웰에 95마이크로리터의 신선한 NSC 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
8개의 채널 멀티웰 피펫을 사용하면 49마이크로리터의 NSC 배지를 빈 U-바닥, V-바닥 또는 라운드 바닥 96 웰 플레이트의 내부 60웰에 추가합니다. 준비된 마스터 컴파운드 플레이트의 봉인을 해제합니다. 피펫 1 마이크로리터는 마스터 플레이트로부터 NSC 배지를 포함하는 내부 60개의 우물으로 각각 의 화합물을 삽입하고, 희석된 화합물을 벤치 탑 피펫터와 세 번 혼합한다.
다음으로, 인큐베이터로부터 NSC의 96개의 웰 플레이트 3개를 제거하고, 세포를 포함하는 3개의 플레이트의 각각 에 5개의 마이크로리터를 분배하여 10 마이크로몰라의 최종 화합물 농도에 대해 1 내지 1000 희석을 산출하고, 72시간 동안 화합물을 함유한 0.1%의 배양세포를 0.1%의 배양세포로 진행한다. 용량 반응 분석을 수행하려면 96을 잘 설정하십시오. 6개의 DMSO 대조군 복제를 위한 2개의 열을 사용하고, 6회 복용량에서, 10 마이크로몰러의 고용량으로 시작하여, 두 배의 연속 희석에서 최대 3개의 다른 화합물의 트리클리타를 시험합니다.
DMSO에서 100%DMSO 또는 테스트 화합물 의 4개의 마이크로리터를 0.5 또는 1.5 밀리리터 미세센트심분리기 튜브에서 NSC 배지의 196마이크로리터로 희석한다. 희석된 DMSO의 마이크로리터 25개와 희석된 시험 화합물 50개소를 해당 우물에 첨가합니다. 96 웰 플레이트의 내부 부분에 남아있는 빈 우물에 NSC 매체의 파이펫 25 마이크로 리터.
멀티채널 피펫터를 사용하여, 10 마이크로몰라 우물에서 5개의 마이크로몰러 우물로 화합물의 25 마이크로리터를 전송하고, 적어도 5회 혼합한다. 파이펫 팁을 교체하고, 나머지 행을 혼합하여 각 화합물에 대해 총 6회 동안 두 배의 희석제에서 삼중액을 생성하여 프로세스를 반복한다. 각 희석제의 5마이크로리터를 테스트 중인 배양 세포가 있는 새로운 플레이트로 옮겨넣습니다.
플레이트를 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 놓습니다. 세포가 72시간 동안 배양된 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트 판독기 내부에 배치합니다. 이미지 기 소프트웨어를 열어 스터디에 대한 프로토콜 및 실험 파일을 설정합니다.
작업 관리자에서 이미저 수동 모드로 이동하여 지금 캡처를 클릭합니다. 용기 유형으로 96 웰 플레이트를 선택합니다. 배율에 대해 10회, 적색 형광 단백질 531 및 593을 선택하여 이미징 tdTomato을 선택합니다.
우물을 클릭합니다. 그런 다음 자동 초점을 클릭하여 이미지에 초점을 맞추고 적절한 노출 시간을 위해 자동 노출을 자동으로 노출합니다. 필요한 경우 초점과 노출을 수동으로 조정합니다.
카메라를 클릭하여 사진을 캡처합니다. 그런 다음 위의 이미지 분석 프로세스를 클릭하여 프로토콜을 계속 빌드합니다. 그리고 분석 탭을 선택합니다.
이미지 오른쪽에 분석 추가 단계에서 셀룰러 분석을 클릭하고 시작을 클릭합니다. 이미지는 각 개별 셀을 나타내기 위해 강조 표시된 셀을 보여줍니다. 옵션 선택을 클릭하여 형광 임계값 또는 세포 크기에 따라 세포를 더 잘 선택하도록 매개 변수를 변경합니다.
이미저가 셀을 제대로 계산하는 경우 화면 하단의 단계 추가를 클릭합니다. 화면 상단의 아이콘을 클릭하여 이미지 집합에서 실험을 만듭니다. 열린 창에서 프로토콜 탭 아래에서 절차를 클릭합니다.
그런 다음 열리는 새 창에서 읽기를 선택합니다. 전체 플레이트를 클릭하여 셀을 포함하는 60개의 우물만 선택합니다. 확인을 클릭하여 변경 내용을 저장합니다.
그런 다음 프로시저 창에서 확인을 클릭합니다. 플레이트를 실행하려면 재생 아이콘을 클릭합니다. 프롬프트에서 파일을 저장한 다음 로드 플레이트 프롬프트에서 확인을 클릭합니다. 이미징이 완료되면 이미저 소프트웨어 프로그램에서 셀 카운트 데이터를 스프레드시트에 다운로드하여 분석을 합니다.
tdTomato 이미징을 완료한 지 2시간 이내에 MTT 분석서를 시작합니다. 25 밀리그램의 MTT를 계량하고 NSC 매체의 5밀리리터로 다시 일시 중단하여 밀리리터 MTT 스톡 솔루션당 5밀리그램을 만듭니다. MTT의 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 몇 분 동안 솔루션을 소용돌이.
인큐베이터에서 세포 배양 판을 제거하고 세포 배양 배지를 흡인시합니다. MTT를 신선한 NSC 배지에 1-10을 희석하고 희석된 MTT의 마이크로리터 100개를 각 셀웰에 추가합니다. 2 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오.
순수한 침전은 우물의 세포 수에 비례하여 대략 적으로 보입니다. MTT 용액을 플레이트에서 분리하고 각 웰에 100% DMSO의 50마이크로리터를 추가합니다. 400 RPM에서 10 분 동안 실온에서 셰이커에 접시를 놓습니다.
그 후 플레이트를 플레이트 판독기로 옮기합니다. 595 나노미터의 사전 설정된 파장에서 각 우물의 흡광도를 읽고, 데이터를 스프레드시트로 내보내 분석용 데이터를 셀 카운트 데이터와 정확하게 분석한다. tdTomato 형광 이미지의 검사는 MTT와 세포 수 분석 사이의 독성에 대한 두 개의 우물 불화를 밝혀.
하나 잘, 세포 수 데이터는 독성을 제안하지. 그러나 MTT 데이터는 그랬습니다. 또 다른 잘 tdTomato 수에 비해 MTT에 의해 세포 수를 과대 평가했다, 더 큰 세포를 가지고 있는 것으로 나타났다, 반면 MTTt tdTomato에 비해 셀 수를 과소 평가 우물에서, 세포는 더 작은 것으로 나타났다.
요약하자면, tdTomato 분석은 11개의 화합물을 독성으로 분류하고, 11개의 성장 억제제로서, 성장 촉진으로, 34는 세포 성장에 명백한 영향을 미치지 않는다. MTT 분석 분류 13 독성으로 화합물, 성장 억제로 두, 성장 향상으로 하나, 와 41 세포 성장에 명백한 영향을 미치지. 화합물 WP1066에 대한 실행 가능한 세포의 그래프는 4개의 가장 낮은 농도에 대한 독성이 없는 비교적 평평한 곡선을 나타낸다.
곡선은 5 개의 마이크로 몰라 용량에서 급속히 떨어지고, 10 마이크로 몰러에서 거의 완전한 독성으로 떨어지며, 이는 tdTomato 분석 및 MTT 분석에 대한 치명적인 용량 50을 4.4 및 6.0 마이크로 몰러로 이끕다. 올바른 용량 반응 곡선이 생성되도록 화합물이 용량 반응 화면에서 제대로 희석되는 것이 중요합니다. 세포 성장에 영향을 미치는이 절차에 의해 확인 된 화합물은 세포 성장을 제어 하는 잠재적으로 새로운 신호 경로를 식별 하기 위해 기능적인 에세이에 의해 더 특징지을 수 있습니다.
신경 줄기 세포에 독성 화합물은 뇌암에 대 한 잠재적인 치료 약으로 테스트 되었습니다., 교 모 세포 종 및 신경 모세포종 등. 포유류 세포, DMSO 및 MTT를 취급할 때 항상 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오. 기관의 화학 폐기물 지침에 따라 DMSO 및 MTT를 폐기하십시오.
