그들의 조언에 대해 Kaz Nagaosa와 Akiko Shiratsuchi에게 감사드립니다.

1. 준비 <ol><li> 신선한 포도 주스 한천 접시 준비 <ol><li> 한천 4.4g에 물 100mL를 넣고 전자 레인지로 가열하여 한천을 녹인다. </li><li> 한천 용액에 신선한 포도 주스 80 mL, 아세트산 5 mL 및 에탄올 5 mL를 넣는다. </li><li> 각 유리 슬라이드 위에 피펫으로 약 1.5 mL의 용액을 부어 응고시킵니다. </li></ol></li><li> 6 cm 접시 아가로 오스 플레이트 준비 <ol><li> 아가로 오스 0.5g에 물 50mL를 넣고 전자 레인지로 혼합물을 가열하여 아가 로스를 녹인다. </li><li> 피펫으로 6cm 요리에 약 2.5 ML 아가로 오스 솔루션을 부어. </li></ol></li></ol> 2. 단계 16 태아 수집 <ol><li> 성인 파리를 모으고, 50 mL 원뿔 튜브에 200 명의 암컷과 200 마리의 수컷을 추가하십시오. </li><li> 효모에 신선한 포도 주스 한천 한 접시를 50 ML 튜브에 넣고 스폰지 CA와 함께 닫습니다피. </li><li> 2 ~ 3 일 동안 16 ° C에서 파리를 품어줍니다. 접시를 하루에 한 번씩 교체하십시오. </li><li> 파리를 25 ° C에서 1 시간 동안 어둠으로 이동시킵니다. </li><li> 오래된 접시를 효모가없는 새 접시로 바꾸십시오. 파리가 2 시간 동안 알을 낳도록하십시오. </li><li> 플레이트를 수집하고 26 ° C에서 16 ° C로 배양하십시오. </li><li> 0.2 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS 1 ML에 페인트 브러시로 접시에서 배아를 수집합니다. </li><li> 0.2 % (브이 / 브이) 트리톤 X - 100을 포함하는 1 ML PBS로 배를 씻으십시오. </li><li> chorion을 제거하기 위해 차아 ​​염소산 나트륨 용액 (2.2 ~ 3.4 % Cl) 1.2 mL를 3 분간 배양합니다. </li><li> 0.2 % (브이 / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 1 ML PBS로 4 번 배아를 씻으십시오. </li><li> 6cm 접시 아가로 오스 판에 배아를 놓습니다. 로버트 20에 설명 된대로 현미경으로 무대 16 태아를 데리러. micropipette 1.5 ML Treff 마이크로 테스트 튜브에 약 50 개의 배아를 수집합니다. </li></ol> 3. 준비배아 세포의 배급 <ol><li> PBS 150 μL로 배아를 두 번 씻으십시오. </li><li> PBS에 collagenase (0.25 % (w / v)) 200 μL의 존재에 1.5 ML 마이크로 테스트 튜브와 펠렛 믹서에 30 배를 균질. </li><li> 10 배 pipetting하여 배아 세포를 분산하고, 1.5 ML 튜브에 세포 현탁액을 이동하십시오. 37에서 세포를 품어 ° C. 수 분이 1 분. 이 단계를 두 번 반복하십시오. </li><li> 세포 현탁액에 PBS 800 μL를 추가하고 1400 X g 에서 원심 분리 4 ° C 5 분. </li><li> 뜨는을 제거하고 세포에 PBS에서 트립신 (0.25 % (W / V)) 200 μL를 추가합니다. 50 배 pipetting하여 배아 세포를 분산시킵니다. </li><li> 70 μm Cell Strainer로 세포 현탁액을 여과합니다. </li><li> 트립신 활동을 중지하려면 여과 된 세포 현탁액에 열 불 활성화 된 태아 소 혈청 40 μL를 첨가합니다. PBS 800 μL를 첨가하고 1,400 x g 에서 4 분간 원심 분리하십시오 (5 분). </li><li> 슈퍼 맵 삭제PBS 200 μL에 침전 된 세포를 정지시키고 4 ℃에서 1400 x g 에서 5 분간 원심 분리한다. </li><li> 뜨는을 제거하고 PBS 30 μL에 침전 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 아미노 프로필 triethoxysilane - 코팅 유리 슬라이드에 준비 세포 현탁액을 탑재하고 세포가 유리 슬라이드에 첨부 할 때까지 10-15 분 기다립니다. </li><li> 피펫으로 유리 슬라이드에 남아있는 솔루션을 제거합니다. PFA (파라 포름 알데히드) 4 % (w / v)를 함유 한 PBS 60 ~ 70 μL를 세포에 고정시킵니다. </li><li> 고정 솔루션을 제거하고 1 분 이상 동안 PBS에 유리 슬라이드를 놓으십시오. </li></ol> 4. 혈구의 염색 <ol><li> 항 Croquemort 항체로 면역 염색 <ol><li> 10 분 동안 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에서 10 분 동안 10 분 동안 메탄올에서 글라스 슬라이드를 적신 다음, 10 분 동안 PBS에서 슬라이드시킨다. </li><li> PBS containi에있는 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청 20 μL를 넣습니다.블로킹을 위해 0.2 % (v / v) 트리톤 X-100 세포에. 슬라이드를 20 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. </li><li> 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고 세포에 0.2 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS에 안티 Croquemort 항혈청 19 , 21 (0.1 % (V / V)) 20 μL를 탑재. 슬라이드를 4 ° C에서 밤새 품어주십시오. </li><li> 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다. </li><li> 유리를 PBS에 10 분 동안 담근다. </li><li> 0.2 % (v / v) Triton X-100 및 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청을 함유 한 PBS에 알칼라인 포스파타제로 표지 된 항 - 랫트 IgG (0.5 % (v / v) 1 시간 동안 온도. </li><li> 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다. </li><li> 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl 2 를 함유하는 완충액에서 10 분 동안 유리 슬라이드를 적시십시오. </li><li> 0.23 mg / mL 5- 브로 모 -4를 함유하는 포스 파타 아제 기질 용액(BCIP), 0.35 mg / mL nitro blue tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl 및 50 mM MgCl 2 를 세포에 첨가하여 항온 배양 하였다. </li><li> 현미경으로 세포를 관찰하여 적절한 얼룩이 있는지 확인하십시오. hemocytes의 과립에 강한 보라색 신호가 나타날 때, 기판 솔루션을 제거하고 10 MM Tris-HCl, 산도 8.5 및 1 MM EDTA로 구성된 버퍼에 유리 슬라이드를 담가. 약 5 ~ 10 분 동안 염색하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 항 GFP 항체 (hemocytes의 얼룩에 대한 또 다른 옵션)와 Immunostaining <ol><li> 10 분 동안 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유하는 PBS를 10 분 동안 메탄올에 유리 슬라이드를 적시고, 10 분 동안 PBS를 적신 다음, PBS를 10 분 동안 적시십시오. </li><li> 블로킹을 위해 세포에 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유 한 PBS에 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청 20 μL를 넣습니다. 슬라이드를 20 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. </li><li> 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고, 마우스 anti-GFP 항체 (1 % (브이 /)) / PBS C의 20 μL를 탑재세포에 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유하고있다. 슬라이드를 밤새 상온에서 인큐베이션하십시오. </li><li> 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다. </li><li> 유리를 PBS에 10 분 동안 담근다. </li><li> 0.2 % (v / v) Triton X-100 및 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청을 함유 한 PBS에 알칼라인 포스파타제 표지 항 마우스 IgG (0.5 % (v / v) 1 시간 동안 온도. </li><li> 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다. </li><li> 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl 2 로 이루어진 완충액에서 10 분 동안 유리 슬라이드를 적시십시오. </li><li> 0.23 mg / ml BCIP, 0.35 mg / mL NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl 및 50 mM MgCl 2가 함유 된 포스파타제 기질 용액을 세포에 올려 놓습니다. </li><li> 현미경으로 세포를 관찰하여 적절한 얼룩이 있는지 확인하십시오. 보라색 신호가 전체 hemocytes에 나타나면, 기판 솔루션을 제거하고 구성된 버퍼에 슬라이드를 담그다10mM 트리스 -HCl, pH8.5 및 1mM EDTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 인 방법. 약 10 ~ 15 분 동안 염색하는 것이 좋습니다. </li></ol></li></ol> 5. TUNEL에 의한 세포 사멸 세포의 얼룩 <ol><li> 유리를 PBS에 5 분 동안 담근다. </li><li> 새로운 PBS로 반복하십시오. </li><li> 10 분 동안 세포에 평형 완충액 (재료 표 참조)을 놓습니다. </li><li> 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 세포 5 ML의 터미널 deoxynucleotidyl transferase 및 15 μL의 반응 버퍼를 포함하는 TdT 솔루션 20 μL를 탑재. </li><li> 유리 슬라이드에서 용액을 제거하고 0.5 ML 중지 / 세척 버퍼와 물 17 ML로 구성된 버퍼에 슬라이드를 담그십시오. </li><li> 슬라이드를 5 분 동안 PBS에 3 회 담그십시오. </li><li> 30 분 동안 상온에서 세포에 20 μL의 Anti-Digoxigenin-Peroxidase를 넣는다. </li><li> 유리를 PBS에 5 분 동안 4 회 담근다. </li><li> 50mM Tris-HCl, pH7.5 함유 물 30 mL로 이루어진 퍼 옥시다아제 기질 용액에 유리 슬라이드를 담근다.3,3&#39;- diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB) 및 0.002 % (v / v) H 2 O 2의 전체 마이크로 주걱을 30 초간 처리 하였다. </li><li> apoptotic 세포가 갈색 얼룩 때까지 단계 5.9를 반복합니다. 유리를 물에 담그면 퍼 옥시다아제 반응이 멈 춥니 다. </li><li> 관찰을 위해 세포를 물로 둘러 쌉니다. </li></ol> 6. Apoptotic 세포의 Phagocytosis의 수준을 측정 <ol><li> phagocytosis의 수준을 평가하기 위해 샘플을 가벼운 현미경으로 관찰하십시오. Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포를 hemocytes로, TUNEL 양성 세포를 세포 사멸 세포로, double positive 세포를 탐식하는 혈구로 계산하십시오. </li><li> 식균 지수는 Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포의 총 수에 대한 이중 양성 세포의 수로 정의됩니다. 300 개 이상의 hemocytes가 관찰되는 것이 좋습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116 (2), 205-219 (2004).</li><li>Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+development.">Cell death in development.</a> Cell. 96 (2), 245-254 (1999).</li><li>Savill, J., Fadok, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corpse+clearance+defines+the+meaning+of+cell+death.">Corpse clearance defines the meaning of cell death.</a> Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).</li><li>Ravichandran, K. S., Lorenz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells:+signals+for+a+good+meal.">Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal.</a> Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beginnings+of+a+good+apoptotic+meal:+the+find-me+and+eat-me+signaling+pathways.">Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways.</a> Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).</li><li>Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+removal+of+cells+that+have+become+unwanted:+implications+for+animal+development+and+tissue+homeostasis.">Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis.</a> Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).</li><li>Reddien, P. W., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+engulfment+process+of+programmed+cell+death+in+caenorhabditis+elegans.">The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).</li><li>Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+programmed+cell+deaths+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).</li><li>Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+the+engulfment+of+cell+corpses+during+programmed+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).</li><li>Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CED-12/ELMO,+a+novel+member+of+the+CrkII/Dock180/Rac+pathway,+is+required+for+phagocytosis+and+cell+migration.">CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration.</a> Cell. 107 (1), 27-41 (2001).</li><li>Hsu, T. Y., Wu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells+in+C.+elegans+is+mediated+by+integrin+alpha/SRC+signaling.">Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling.</a> Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+factor+that+links+apoptotic+cells+to+phagocytes.">Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.</a> Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster.">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).</li><li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis.">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117 (1), 29-43 (1993).</li><li>Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+croquemort+in+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).</li><li>Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+innate+immunity+in+Drosophila+by+endogenous+chromosomal+DNA+that+escaped+apoptotic+degradation.">Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation.</a> Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).</li><li>Manaka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draper-mediated+and+phosphatidylserine-independent+phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+Drosophila+hemocytes/macrophages.">Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages.</a> J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).</li><li>Kuraishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretaporter,+a+Drosophila+protein+serving+as+a+ligand+for+Draper+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+cells.">Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells.</a> Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).</li><li>Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Croquemort,+a+novel+Drosophila+hemocyte/macrophage+receptor+that+recognizes+apoptotic+cells.">Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells.</a> Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).</li><li>Kuraishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+calreticulin+as+a+marker+for+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).</li><li>Nagaosa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila+embryos.">Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos.</a> J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).</li><li>Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alphaPS3/betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+and+bacteria+in+Drosophila.">Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila.</a> J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).</li><li>Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NPxY+motif+in+Draper-mediated+apoptotic+cell+clearance+in+Drosophila.">Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila.</a> Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).</li><li>Bruckner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Pathway+for+Phagocyte+Priming+upon+Encounter+with+Apoptotic+Cells.">Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells.</a> J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+disease+and+impaired+uptake+of+apoptotic+cells+in+MFG-E8-deficient+mice.">Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice.</a> Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).</li></ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

<html> 우리는 여기에 Drosophila 배아를 사용하여 식균 작용 분석을 설명했다. 식균 작용을 정량적으로 측정하기 위해 분산 된 배아 세포를 사용함으로써 hemocyte, Drosophila professional phagocytes가 hemocyte marker Croquemort 또는 srpHemo- driven GFP에 대해 면역 염색되고, apoptotic 세포가이 프로토콜에서 TUNEL에 의해 검출됩니다. 식균 작용의 수준은 hemocytes와 phagocytosing hemocytes의 총 수를 세어 phagocy...

예를 들어 선충류 Caenorhabditis elegans , 초파리 Drosophila melanogaster 및 생쥐와 인간과 같은 전이 동물의 경우 많은 수의 세포가 발달 중에 체내를 형성하고 성인기에 항상성을 유지하기 위해 세포 사멸을 경험합니다 1 , 2 . 세포 사멸 세포는 완전히 제거되지 않으면 면역 원성 세포 내 물질을 방출하여 주변 조직에 염증을 유도하기 때문에 신속하게 제거해야합니다 3 . 신속한 제거를 촉진하기 위해 세포 사멸 세포는 식세포의 삼투 수용체에 의해 인식되고 식균 작용에 의해 제거되는 소위 먹기름 신호를 나타냅니다 3 , 4 , 5 , 6 . 따라서, 식균 작용은 숙주 항상성의 유지에 결정적인 역할을하므로,<html> apoptotic 세포의 phagocytosis의 밑에 lar 기계 장치는 중요하다. 세포 사멸 세포의 식균 작용을 담당하는 메커니즘은 진화 적 선충, 초파리, 생쥐 7 종에 보존 한 것으로 나타났습니다. 여러 가지 식균 작용 분석법이 현재이 모델 동물에서 사멸 세포의 웅덩이를 평가하기 위해 이용 가능하다. C. 엘레 간스 에서 131 체세포는 발달 중에 프로그램 된 세포 사멸을 겪고 세포 시체는 비 전문적인 식세포 8 인 이웃 세포에 의해 탐식된다. 따라서, C. elegans 의 잔류 세포 시체 수를 세는 것은 생체 내에서 의 식균 작용의 정도를 나타낸다 . 증가 된 사멸 세포 수를 나타내는 선충 돌연변이를 탐색함으로써, 식균 작용에 필요한 여러 유전자가 동정되었고 유전 학적으로 9 , 10 ,s = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . 일차 배양 식세포, 일반적으로 대 식세포를 사용한 생체 외 탐식 작용은 마우스에서 종종 이용된다. 아폽토시스 (apoptotic) 세포는 Jurkat 세포와 같은 세포주를 사용하여 준비되며 1 차 식균과 혼합됩니다. 수 시간 동안 배양 한 후, 식균 작용의 수준을 평가하기 위해 식세포와 삼투 식세포의 총 수를 세었다. 이 방법을 정교하게 변형시킨 Nagata의 연구팀은 apoptotic cell이 apoptotic DNA 단편화를 일으키지 않고 caspase-resistant ICAD (caspase-activated DNase의 억제제)를 발현하는 세포를 이용한 ex vivo 식균 작용 분석을 개발했다. 세포는 식균된다. 이러한 세포가 식균 작용 분석에서 세포 사멸 목표로 사용될 때, 삼투 된 세포 사멸 세포의 DNA 만 단편화되고 TdT 매개 dUTP 닉 엔드 라벨링 (TUNEL)에 의해 염색된다. 따라서,사멸 세포의 말림 (L)는 식세포 사멸 세포 및 13의 혼합물 TUNEL 신호를 카운트함으로써 측정된다. D. melanogaster에서 , hemocytes, Drosophila macrophages라는 전문 식세포가 세포 사멸 세포의 탐식 작용을 담당합니다 14 , 15 . 배양 세포주를 이용한 in vitro phagocytosis assay 에 더하여, 전체 Drosophila 배아를 이용한 in vivo phagocytosis assay가 가능합니다. 초파리 배아는 많은 세포가 사멸을 받아야하고 배아 발달 14, 15, 16시 혈구에 의해 포식하기 때문에 세포 사멸 세포 말림의 수준을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 생체 내 식균 작용의 예는 프랑 그룹이 개발 한 방법입니다. 그들의 방법에서는, hemocytes는이다 deperoxidasin, 혈구 마커의 면역 염색에 의해 tected, 사멸 세포는 핵 염색 전체 초파리 배아 티노 마이신 D (7) 아미노산을 이용하여 염색하고, 이중 양성 세포의 수는 탐식 (17)의 신호로 간주된다. 배아에 대한 식균 작용 분석의 또 다른 예는 위에 기술 된 Nagata의 방법의 개념에 기초한다. 그러나, 생체 내 식균 작용은 dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) 돌연변이 파리 18 , 19 의 배아를 사용하여 평가됩니다. 이러한 in vivo phagocytosis assay는 in situ에서 phagocytosis를 직접 관찰하는데 유용합니다. 그러나, 어려움은 식균 세포를 계수하는 단계에서 가능한 모든 편향을 배제하는 것과 관련이 있는데, 그 이유는 그것의 두께로 인해 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하기가 어렵 기 때문이다. 이 한계를 극복하기 위해 우리는Drosophila 배아에서 새로운 식균 작용을 분석했다. 우리의 방법에서는 식균 가능한 혈구를 쉽게 계산하기 위해 전체 배아를 균질화하여 분산 된 배아 세포를 준비한다. 식세포는 식세포 마커의 면역 염색에 의해 검출되며, 아폽토시스 세포는 이들 배아 세포가 분산 된 TUNEL에 의해 검출된다. 분산 된 배아 세포의 사용은 우리가 정확하게 식세포 증의 수준을 정량화하는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. phagocytosis에 의한 세포 사멸 (apoptotic cell clearance)이 가장 많은 발달 단계 인 배아 20의 16 단계로 발전하면 파리의 모든 유전형이이 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 식균 작용의 양을 정량적으로 평가할 수있는 장점이 있어 생체 내 apoptotic 세포의 식균 작용에 관여하는 새로운 분자의 동정에 기여할 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>whole swine serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55993</td>
			<td>For bloking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treff micro test tube(easy fit)&#160; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 4625. 9. 01</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pellet mixer&#160; 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 7339. 9. 03</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0130</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td>
			<td>27250-018</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td>
			<td>KPL</td>
			<td>475-1612</td>
			<td>secondary antibody for 
			stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro- 
			3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td>BCIP, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383213001</td>
			<td>NBT, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Croquemort antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anti-GFP 
			from mouse IgG1&#954; (clones 7.1 and 13.1)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6520</td>
			<td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S7100</td>
			<td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine 
			tetrahydrichloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>11009-41</td>
			<td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Table of Fly Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drpr&#916;5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itgbn2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described in Br&#252;ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-drpr-IR</td>
			<td>VDRC</td>
			<td>4833</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Itgbn-IR</td>
			<td>NIG-fly</td>
			<td>1762R-1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

세포 사멸 세포의 탐식 작용을하는 분자 기작은 면역 및 염증성 난치병에서의 역할 때문에 더 자세하게 밝혀야한다. 우리는 여기에 과일 파리 Drosophila를 사용하여 정량적으로 식균 작용을 조사하는 실험적 방법을 개발했다.이 방법은 삼투 반응을 조절하는 유전자 네트워크가 포유 동물로부터 진화 적으로 보존되어있다. 전체 동물을 사용하여 삼투 및 삼투 식각 세포를 정확하게 검출하고 계산하기 위해 Drosophila 배아를 균질화하여 식균 및 아폽토시스 세포를 포함한 분산 된 세포를 얻었다. 분산 된 배아 세포의 사용은 마치 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하고 식균 작용의 수준을 정량화 할 수 있는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. 이 방법이 이전 연구의 결과를 재현한다는 것을 확인했습니다.apoptotic 세포의 phagocytosis에 필요한 유전자를 확인했다. 이 방법은 죽은 세포의 삼투를 분석하고, 강력한 유전학 인 Drosophila 와 결합하면 식세포에 의한 세포 사멸 (apoptotic) 세포의 이동, 인식, 삼투 및 분해로 구성된 복잡한 식균 반응을 나타냅니다.

apoptotic 세포의 식균 작용을 조사하기 위해 발달 단계의 Drosophila 배아를 모아서 분산 세포로 만들었다. Hemocytes, Drosophila macrophages는 특정 항체 19 , 21을 사용하여 hemocyte 마커 &quot;Croquemort&quot; 17 , 22에 대한 면역 세포 화학 검사로 염색되었으며, apoptotic 세포는 분산 배아 세...

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

phagocytosis-assay-for-apoptotic-cells-in-drosophila-embryos

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

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9.8K 조회수.  Kanazawa University.  우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다. 

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

연구

면역학 및 감염병학

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila* 전지*

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

에 셀 운명을 따라

정량

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

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에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila 전지

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

에 셀 운명을 따라

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망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

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에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila* 전지*