이 방법은 용액에서 세포를 분석하기 때문에 가까운 네이티브 환경에서 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에는 환자 유래 세포 샘플의 분석이 포함됩니다. 이 기술은 세포의 거의 또는 전혀 샘플 준비를 필요로한다.
따라서, 우리는 우리가 세포 이질성을 탐구할 수 있는 주변 조건하에서 온라인으로 개별 세포를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 환자 견본에서 직접 분리된 세포의 다른 모형을 분석할 수 있기 때문에, 다양한 다른 질병 상태에서 액체 생검을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 날카로운 팁테이퍼 프로브로 단일 보어 유리 튜브를 변환하려면 먼저 단일 보어 유리 튜브를 수직 파이펫 홀더의 클램프에 넣고 가열 코일에 대한 유리를 중심으로 튜브를 제자리에 고정시합니다.
가열 코일은 금속 막대 2.5 배 주위에 코일 18 게이지 니켈 크롬 저항 와이어로 구성되어 있습니다. 온도 프로그램 19.5와 유리 튜브를 설정합니다. 솔레노이드 플런저를 4개에서 설정합니다.
유리 튜브를 당기기 위해 솔레노이드를 트리거합니다. 이 단계는 끝에 융합된 두 개의 프로브를 만듭니다. 스웨터를 사용하여 각 프로브의 끝에서 약 1mm 떨어진 곳에서 절단하여 프로브 팁에서 직경 약 10미크론의 오리피스를 만듭니다.
ICMP에 쉽게 결합할 수 있도록 유리 프로브를 구부리려면 단일 프로브 SCMS가 설정됩니다. 먼저 뽑아낸 유리 프로브를 마이크로포지에 넣습니다. 상단을 백금 가열 와이어 위에 약 3밀리미터 높이 배치합니다.
그런 다음 백금 와이어의 열을 최대 온도의 30 %로 켭니다. 프로브를 원래 위치에서 약 45도 구부립니다. 거꾸로 된 현미경 현미경 마이크로 인젝터를 전동 테이블에 두 개의 세포 조작 시스템에 배치하여 질량 분광계와 쉽게 결합할 수 있습니다.
유리 세포 선택 장치를 설정하려면 긴 슬라이드를 모세관 홀더에 넣고 나사를 조이서 마이크로인젝터의 금속 홀더 내부에 유리 셀 선택 프로브를 삽입하여 프로브를 제자리에 고정시하십시오. 가열된 플레이트에 평행하게 기울어진 프로브 팁을 배치합니다. 마이크로 인젝터의 금속 홀더를 세포 조작 시스템에 고정합니다.
그런 다음 프로브 팁을 반전 된 현미경 광의 중간 근처에 배치합니다. 단일 프로브를 포함하는 유리 슬라이드를 셀 조작 시스템의 암 클램프에 고정합니다. 모세관을 전도성 조합에 연결하는 용매를 플라스틱 페룰의 슬리브에 넣고 손가락이 피팅을 조이도록 하여 전도성 조합에 연결합니다.
모세관을 슬리브에 배치하고 피팅을 조여 샘플링 용매를 포함하는 주사기에 연결된 모세관에 전도성 조합의 다른 면을 연결합니다. 이러한 실험에서 샘플링 용매로 0.1%의 포믹산을 가진 아세토나이트를 사용한다. 질량 분광계의 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다.
나노 전기 분무 이온화 또는 나노 ESI 방출기 약 1 밀리미터확장 이온 전달 튜브의 오리피스에 배치. 세포 조작 시스템을 사용하여 단일 프로브의 간격 이동을 제어하고 나노 ESI 방출기를 확장 된 이온 전달 튜브 앞에 중앙으로 배치합니다. 세포 배양에서 세포가 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 플라스크를 피펫합니다.
셀을 섭씨 37도에서 섭씨 37도에서 400회 G로 5분간 회전하고 상체를 폐기합니다. 원하는 치료 농도에서 약물 화합물을 함유하는 RPMI 배지의 4밀리리터에서 세포를 재연한다. 질량 분광계에 대한 실험 매개 변수를 사용자 정의합니다.
계측기 소프트웨어의 스캔 모드 제목 아래에서 검사를 정의합니다. Z 400 이상의 M에서 60, 000의 해상도, 1개의 현미경 100밀리초 최대 주입 시간 및 자동 게인 제어를 사용합니다. 주사기 펌프에서 분당 150 나노리터의 유량을 선택합니다.
NSI 소스를 선택하고 약 4.5 킬로볼트의 전압을 적용합니다. 위플레이트와 하단 렌즈 모두에 대해 선택된 배율의 40배배에서 반전 된 현미경을 켭니다. 라이브 비디오 피드를 캡처하려면 랩톱의 USB 포트에 연결합니다.
가열 된 접시를 켜고 섭씨 37도로 설정합니다. 컴퓨터에서 수집 된 데이터 탭으로 이동하여 획득 된 시간 에서 계속 선택하십시오. 분석을 위해 샘플을 준비하기 위해 샘플 의 2 ~3 개를 작은 페트리 접시 뚜껑에 넣습니다.
가열 된 플레이트 위에 반전 된 현미경에서 빛의 중심에 샘플을 배치합니다. 분석을 위해 유리 셀 선택 프로브를 준비합니다. 그 상단이 세포와 같은 평면의 반전 된 마이크로 소프 아래에 초점을 맞출 수 있도록 세포 조작 시스템을 사용하여 프로브를 이동합니다.
셀 조작 시스템을 사용하여 셀 선택 프로브 팁을 분석을 위한 표적 셀로 이동합니다. 이 과정은 반전 된 현미경을 사용하여 모니터링됩니다. 마이크로인젝터의 손잡이를 부드럽게 돌려 튜브 내부의 미네랄 오일위치를 조정합니다.
미세 인젝터에서 미세 주입기에서 세포 선택 프로브 팁에 표적 셀을 고정하기 위해 부드러운 흡입이 제공됩니다. 셀 조작 시스템을 사용하여 단일 프로브 팁에 초점을 맞춘 디지털 현미경을 사용하여 셀 선택 프로브 팁에서 셀을 단일 프로브 팁으로 이동하여 이 과정을 모니터링합니다. 처리되지 않은 K-562 세포는 실험 방법을 확립하는 데 사용된다.
일반적인 SCMS 실험에서, 질량 스펙트럼의 명백한 변화는 세포 내용물의 검출 도중 및 측정을 완료한 후에 세포를 전송에서 관찰될 수 있습니다. PC 34:4, PC 36:4 및 PC 38:5를 포함한 3개의 일반적인 세포 지질 피크가 모니터링되어 셀이 성공적으로 전송되고 셀룰러 내용이 검출되도록 합니다. 750 ~ 850의 질량 범위에서 많은 PC의 ID는 처리되지 않은 세포 용해 시료에 MSMS를 사용하여 확인된다.
ICMP 단일 프로브 MS 를 사용하여 젬시타빈, 탁솔 및 OSW1은 K-562 셀을 이용한 배양 후 검출되었다. 이러한 결과는 이 방법이 가까운 네이티브 환경에서 용액의 세포로부터 단일 세포 수준에서 세포 내 지질, 약물 및 대사산물을 연구하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 진공 흡입을 적절하게 적용할 수 있도록 유리 셀 선택 프로브를 범용 파이펫 홀더에 단단히 배치해야 합니다.
이 방법은 또한 우리가 이 질병 상태의 더 나은 이해를 얻을 수 있는 세포 형체 사이 다름을 구별하기 위하여 환자 파생한 견본에 적용될 수 있습니다. 이 방법을 개발 한 후, 우리는 잠재적으로 단일 세포 수준에서 약물 화합물의 정량화를 구현할 수 있습니다. 세포와 함께 작업 할 때, 실험실 코트와 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 가지고하는 것이 중요합니다.
유리로 작업할 때 추가 적인 눈 마모를 사용할 수 있습니다.
