Uma vez que este método analisa células a partir de soluções, ele pode ser usado para estudar células em um ambiente próximo nativo. Isso inclui a análise de amostras de células derivadas do paciente. Esta técnica requer pouca ou nenhuma preparação amostral das células.
Portanto, podemos analisar células individuais on-line em condições ambientais, o que nos permite explorar a heterogeneidade celular. Essa técnica pode ser aplicada para estudar biópsias líquidas de diferentes estados da doença, pois pode analisar diferentes tipos de células diretamente isoladas de amostras de pacientes. Para converter tubos de vidro de furo único em uma sonda afilada com uma ponta afiada, primeiro coloque um único tubo de vidro furado nos grampos de um suporte de pipeta vertical, centralizando o vidro em relação à bobina de aquecimento e aperte para fixar o tubo no lugar.
A bobina de aquecimento é composta por um fio de resistência ao cromo de níquel de 18 bitola enrolado em torno de uma haste de metal 2,5 vezes. Coloque a tubulação de vidro com programa de temperatura 19,5. Coloque o êmbolo solenoide em quatro.
Acione o solenoide para puxar a tubulação de vidro. Esta etapa cria duas sondas fundidas na ponta. Use suéteres para cortar aproximadamente um milímetro da ponta de cada sonda, criando um orifício de aproximadamente 10 mícrons de diâmetro na ponta da sonda.
Para dobrar a sonda de vidro para fácil acoplamento ao ICMP, uma única sonda SCMS configurada. Primeiro coloque uma sonda de vidro puxada no microforge. Posicione a parte superior aproximadamente três milímetros acima do fio de aquecimento de platina.
Em seguida, gire o calor do fio de platina para 30% da temperatura máxima. Dobre a sonda aproximadamente 45 graus da posição original. Coloque o microinjetor de microscópio invertido em dois sistemas de manipulação celular em uma mesa motorizada para fácil acoplamento com o espectrômetro de massa.
Para configurar o dispositivo de seleção de células de vidro, insira a sonda de seleção de células de vidro dentro do suporte metálico do microinjetor, colocando o longo slide no suporte capilar e apertando o parafuso para fixar a sonda no lugar. Posicione as pontas da sonda em ângulo paralelo à placa aquecida. Fixar o suporte metálico do micro injetor no sistema de manipulação celular.
Em seguida, posicione a ponta da sonda perto do meio da luz do microscópio invertido. Fixar a lâmina de vidro contendo a única sonda no grampo de braço do sistema de manipulação celular. Conecte o solvente proporcionando capilar a uma união condutora, colocando o capilar na manga do ferrule plástico e o aperto do dedo no encaixe.
Conecte o outro lado da união condutora a um capilar que está conectado a uma seringa contendo o solvente amostral colocando o capilar na manga e apertando o encaixe. Use acetonitrilo com ácido fórmico de 0,1% como solvente amostral nesses experimentos. Fixar a seringa na bomba de seringa no espectrômetro de massa.
Posicione o emissor nanoeletropray ou nano ESI aproximadamente um milímetro para o orifício do tubo de transferência de íons estendidos. Use o sistema de manipulação celular para controlar os movimentos espaçais da sonda única e posicionar o emissor nano ESI centralmente em frente à tubulação de transferência de íons estendidas. Pipeta as células da cultura celular frasco em um tubo centrífuga de 15 mililitros.
Gire as células a 400 vezes G em 37 graus Celsius por cinco minutos e descarte o supernasce. Resuspend as células em quatro mililitros de meio RPMI contendo o composto da droga na concentração de tratamento desejada. Personalize os parâmetros experimentais para o espectrômetro de massa.
Sob a posição do modo de digitalização do software de instrumento, selecione definir a digitalização. Use uma resolução de 60.000 em M sobre a Z 400, um microscan 100 milissegundos de tempo máximo de injeção e controle automático de ganho. Sob a bomba de seringa, selecione a taxa de fluxo de 150 nanoliters por minuto.
Selecione a fonte NSI e aplique uma tensão de aproximadamente 4,5 quilovolts. Ligue o microscópio invertido em 40 vezes a ampliação selecionada tanto para a placa superior quanto para a lente inferior. Conecte-o à porta USB de um laptop para capturar transmissões de vídeo ao vivo.
Ligue a placa aquecida e coloque-a a 37 graus Celsius. No computador, vá para a guia de dados de aquisição e selecione continuamente em tempo adquirido. Para preparar a amostra para análise, pipeta de dois a três da amostra na tampa de uma pequena placa de petri.
Posicione a amostra no centro da luz a partir do microscópio invertido em cima da placa aquecida. Prepare a sonda de seleção de células de vidro para análise. Use o sistema de manipulação celular para mover a sonda para que seu topo esteja focado sob o microcsope invertido no mesmo plano que as células.
Use o sistema de manipulação celular para mover a ponta da sonda de seleção celular para uma célula alvo para análise. Este processo é monitorado usando o microscópio invertido. Gire suavemente a pega do microinjetor para ajustar a posição do óleo mineral dentro da tubulação.
Uma sucção suave é fornecida pelo microinjetor para fixar a célula alvo na ponta da sonda de seleção celular. Use o sistema de manipulação celular para mover a célula na ponta do teste de seleção de células para a ponta do único teste usando um microscópio digital focado na ponta da sonda única para monitorar esse processo. Células K-562 não tratadas são usadas para estabelecer o método experimental.
Em um experimento típico de SCMS, mudanças óbvias de espectro de massa podem ser observadas a partir da transferência de uma célula durante a detecção de conteúdo celular e após o término da medição. Três picos lipídes celulares comuns, incluindo PC 34:4, PC 36:4 e PC 38:5 são monitorados para garantir que a célula seja transferida com sucesso e o conteúdo celular seja detectado. A identidade de muitos PCs na faixa de massa de 750 a 850 são confirmadas usando MSMS em amostras de liseto celular não tratadas.
Utilizando a sonda única ICMP MS configurada, Gemcitabine, Taxol e OSW1 foram detectados após a incubação com células K-562. Esses resultados sugerem que este método pode ser usado para estudar lipídios intracelulares, drogas e metabólitos no nível de célula única a partir de células em solução em um ambiente próximo nativo. Lembre-se de colocar com segurança a sonda de seleção de células de vidro no suporte universal de pipeta para que a sucção possa ser adequadamente aplicada.
Este método também pode ser aplicado a amostras derivadas do paciente para distinguir diferenças entre metabólitos celulares de uma variedade de tipos celulares, o que nos permite obter uma melhor compreensão desses estados da doença. Depois de desenvolver este método, poderíamos potencialmente implementar a quantificação de compostos medicamentosos no nível de célula única. Ao trabalhar com células, é importante ter equipamentos de proteção individual adequados, incluindo jaleco e luvas.
O desgaste adicional dos olhos pode ser usado ao trabalhar com vidro.
