Da diese Methode Zellen aus lösungsweise analysiert, kann sie verwendet werden, um Zellen in einer nahezu nativen Umgebung zu untersuchen. Dazu gehört auch die Analyse von patientenabgeleiteten Zellproben. Diese Technik erfordert wenig bis gar keine Probenvorbereitung von Zellen.
Daher können wir einzelne Zellen online unter Umgebungsbedingungen analysieren, was es uns ermöglicht, die zelluläre Heterogenität zu erforschen. Diese Technik kann angewendet werden, um flüssige Biopsien aus einer Vielzahl von verschiedenen Krankheitszuständen zu untersuchen, da sie verschiedene Arten von Zellen analysieren kann, die direkt aus Patientenproben isoliert sind. Um einbohrende Glasschläuche in eine verjüngte Sonde mit scharfer Spitze umzuwandeln, legen Sie zunächst ein einzelnes Glasrohr in die Klemmen eines vertikalen Pipettenhalters, wobei das Glas in Bezug auf die Heizspule zentriert und festgezogen wird, um das Rohr an Ort und Stelle zu sichern.
Die Heizspule besteht aus einem 18 Gauge Nickel Chromwiderstandsdraht, der 2,5-mal um einen Metallstab gewickelt ist. Stellen Sie die Glasschläuche mit Temperaturprogramm 19.5 ein. Stellen Sie den Magnetkolben auf vier.
Lösen Sie den Magneten aus, um den Glasschlauch zu ziehen. In diesem Schritt werden zwei Sonden erstellt, die an der Spitze verschmolzen sind. Verwenden Sie Pullover, um etwa einen Millimeter von der Spitze jeder Sonde zu schneiden, wodurch eine Öffnung von etwa 10 Mikrometern Durchmesser an der Sondenspitze entsteht.
Um die Glassonde zur einfachen Kopplung an den ICMP zu biegen, wird Einessonde SCMS eingerichtet. Setzen Sie zunächst eine gezogene Glassonde in die Mikroschmiede. Positionieren Sie die Oberseite etwa drei Millimeter über dem Platin-Heizdraht.
Dann drehen Sie die Wärme auf dem Platindraht auf 30% der maximalen Temperatur. Biegen Sie die Sonde etwa 45 Grad von der ursprünglichen Position. Legen Sie den invertierten Mikroskop-Mikroinjektor in zwei Zellmanipulationssysteme auf einen motorisierten Tisch, um das Massenspektrometer einfach zu koppeln.
Um die Glaszellenauswahlvorrichtung einzurichten, legen Sie die Glaszellen-Selektionsonden in den Metallhalter des Mikroinjektors ein, indem Sie den langen Schlitten in den Kapillarhalter legen und die Schraube anziehen, um die Sonde an Ort und Stelle zu befestigen. Positionieren Sie die Sondenspitzen parallel zur beheizten Platte. Sichern Sie den Metallhalter des Mikroinjektors in das Zellmanipulationssystem.
Positionieren Sie dann die Sondenspitze in der Mitte des invertierten Mikroskoplichts. Befestigen Sie den Glasschlitten mit der einzelsonde in der Armklemme des Zellmanipulationssystems. Verbinden Sie das mit Kapillare versorgende Lösungsmittel mit einer leitfähigen Verbindung, indem Sie die Kapillare in die Hülse der Kunststoffferrule legen und die Armatur mit dem Finger anziehen.
Verbinden Sie die andere Seite der leitfähigen Verbindung mit einer Kapillare, die mit einer Spritze verbunden ist, die das Probenahmelösungsmittel enthält, indem Sie die Kapillare in die Hülse legen und die Armatur anziehen. Verwenden Sie Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure als Probenahmelösungsmittel in diesen Experimenten. Befestigen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe auf dem Massenspektrometer.
Positionieren Sie den Nanoelektrospray-Ionisations- oder Nano-ESI-Emitter etwa einen Millimeter auf die Öffnung des verlängerten Ionentransferrohrs. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die räumlichen Bewegungen der einzelnen Sonde zu steuern und den Nano-ESI-Emitter zentral vor dem verlängerten Ionentransferschlauch zu positionieren. Pipette die Zellen aus der Zellkultur Kolben in eine 15 Milliliter Zentrifugenröhre.
Drehen Sie die Zellen bei 400 mal G in 37 Grad Celsius für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in vier Millilitern RPMI-Medium, das die Wirkstoffverbindung enthält, in der gewünschten Behandlungskonzentration aus. Passen Sie die experimentellen Parameter für das Massenspektrometer an.
Wählen Sie unter der Scanmodusüberschrift der Gerätesoftware Scan definieren aus. Verwenden Sie eine Auflösung von 60.000 bei M über Z 400, ein Mikroscan 100 Millisekunden maximale Injektionszeit und automatische Verstärkungskontrolle auf. Wählen Sie unter Spritzenpumpe den Durchfluss von 150 Nanoliterpro Minute aus.
Wählen Sie nSI-Quelle und wenden Sie eine Spannung von ca. 4,5 Kilovolt an. Schalten Sie das invertierte Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung ein, die sowohl für die obere Platte als auch für die untere Linse ausgewählt wurde. Schließen Sie es an den USB-Anschluss eines Laptops an, um Live-Video-Feeds aufzunehmen.
Schalten Sie die beheizte Platte ein und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Gehen Sie auf dem Computer zur Registerkarte Daten erfassen und wählen Sie kontinuierlich unter erworbener Zeit aus. Um die Probe für die Analyse vorzubereiten, Pipette zwei bis drei der Probe in den Deckel einer kleinen Petrischale.
Positionieren Sie die Probe in der Mitte des Lichts vom invertierten Mikroskop auf der Oberseite der beheizten Platte. Bereiten Sie die Glaszellenauswahlsonde für die Analyse vor. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Sonde so zu bewegen, dass ihre Oberseite unter dem invertierten Mikrocsope in derselben Ebene wie die Zellen fokussiert ist.
Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zelleselektions-Sondenspitze zur Analyse in eine Zielzelle zu verschieben. Dieser Prozess wird mit dem invertierten Mikroskop überwacht. Drehen Sie den Griff des Mikroinjektors vorsichtig, um die Position des Mineralöls im Inneren des Schlauches anzupassen.
Der Mikroinjektor sorgt für eine schonende Absaugung, um die Zielzelle an der Zellselektionssonde zu sichern. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zelle an der Zellauswahlssondenspitze mithilfe eines digitalen Mikroskops, das auf die einzelne Sondenspitze fokussiert ist, zur Einzelsondenspitze zu bewegen, um diesen Prozess zu überwachen. Unbehandelte K-562-Zellen werden verwendet, um die experimentelle Methode zu etablieren.
In einem typischen SCMS-Experiment können offensichtliche Veränderungen von Massenspektren beobachtet werden, wenn eine Zelle während der Detektion von Zellinhalten und nach Abschluss der Messung übertragen wird. Drei häufige zelluläre Lipidspitzen, einschließlich PC 34:4, PC 36:4 und PC 38:5, werden überwacht, um sicherzustellen, dass die Zelle erfolgreich übertragen und zelluläre Inhalte erkannt werden. Die Identität vieler PCs im Massenbereich von 750 bis 850 wird mit MSMS an unbehandelten Zelllysatproben bestätigt.
Mit Hilfe der ICMP-Einzelsonde MS-Einrichtung wurden Gemcitabin, Taxol und OSW1 nach der Inkubation mit K-562-Zellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode verwendet werden kann, um intrazelluläre Lipide, Medikamente, und Metaboliten auf der Ebene der einzelnen Zellen von Zellen in Lösung in einer nahen nativen Umgebung zu studieren. Denken Sie daran, die Glaszellen-Selektionsonde sicher in den universellen Pipettenhalter zu legen, damit die Absaugung angemessen angewendet werden kann.
Diese Methode kann auch auf Patienten entnommen Proben angewendet werden, um Unterschiede zwischen zellulären Metaboliten aus einer Vielzahl von Zelltypen zu unterscheiden, was uns ermöglicht, ein besseres Verständnis dieser Krankheitszustände zu gewinnen. Nach der Entwicklung dieser Methode könnten wir potenziell die Quantifizierung von Wirkstoffverbindungen auf Einzelzellebene umsetzen. Bei der Arbeit mit Zellen ist es wichtig, über eine geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Labormantel und Handschuhe zu verfügen.
Bei der Arbeit mit Glas kann zusätzliche Augenverschleiß verwendet werden.
